Variabilidad genética y caracterización espermática de las poblaciones en cautiverio del Tapir Centroamericano (Tapirus bairdii) en Panamá.

El Tapir (mamífero de mayor tamaño de Centroamérica) se encuentra en peligro de extinción. Una de las dificultades que se presentan para su conservación es el alto costo económico que representa el planeamiento e implementación de planes de preservación de un número mínimo de animales para mantener la variabilidad genética que garantice la supervivencia de la especie. Además, se requiere mucho esfuerzo para su reproducción en cautiverio y es difícil mantener poblaciones de este tipo que se "auto-sustenten" genéticamente. Esto es debido al limitado espacio disponible que no permite mantener poblaciones suficientemente grandes para evitar los impactos negativos de la endogamia ni la disminución de la variabilidad debido a la deriva genética. Los desarrollos biotecnológicos en el campo de la reproducción, ofrecen alternativas muy interesantes y únicas para el mejoramiento genético y el rescate de diferentes especies animales. Entre los objetivos de este estudio están: 1) caracterizar el nivel de variabilidad genética y endogamia presentes en las poblaciones de tapires en cautiverio de Panamá y 2) caracterizar la biología reproductiva del macho del tapir. Para tal fin, se recolectaron muestras de semen por electroeyaculación, sangre y pelo de todos los individuos. Se realizaron estudios moleculares, a partir de DNA extraído de las muestras de sangre, utilizando la técnica de microsatélites (mediante la técnica de PCR con cola M13) para determinar la variabilidad genética de los individuos y el nivel de endogamia presente en las poblaciones estudiadas. Los estudios relacionados a la caracterización espermática de la especie consistieron en la determinación de características generales del eyaculado más las características morfológicas del esperma, llevados a cabo por primera vez a nivel mundial gracias a este proyecto. Los resultados indican que el nivel de variabilidad genética presente en estas pobiaciones refleja la variabilidad presente en las poblaciones silvestres y, hasta el momento, no se ha visto afectado por la endogamia. Con respecto a las características espermáticas, las poblaciones presentan teratospermía, sin embargo, esto parece no estar relacionado a los niveles de variabilidad genética, sino a factores de manejo como la dieta, y no ha afectado la capacidad reproductiva de los individuos por el momento. Este estudio es un medio para desarrollar técnicas y planes de manejo que se conviertan en una garantía para la conservación de la biodiversidad genética de esta especie en peligro de extinción

STRUCTURAL AND FUNCTIONAL CHARACTERIZATION OF THE PANAMANIAN GOLDEN FROG (ATELOPUS ZETEKI) SPERMATOZOA – IMPACT OF MEDIUM OSMOLALITY AND CRYOPRESERVATION ON MOTILITY AND CELL VIABILITY

The Panamanian Golden Frog (Atelopus zeteki, Anura: Bufonidae), an endemic species from Panama, is critically endangered and believed to be extinct from the wild. Infectious disease, habitat destruction and pet trade are among the major causes of the populations decline. Conservation initiatives in Panama and the US have established captive breeding programs for the species but there is still much to be learned about its reproductive physiology to manage and sustain populations using Assisted Reproductive Technologies (ARTs). The main objectives of this dissertation were: 1) characterize the general sperm parameters and assess the effect of hormonal stimulation on motility, forward progressive motility, DNA integrity, sperm morphology and seasonality; 2) identify the effect of extracellular conditions, mainly dilution and temperature, on motility, forward progressive motility, duration of motility, morphology and DNA integrity; and 3) evaluate the effect of cryoprotectants on motility, forward progressive motility and sperm DNA integrity before and after freezing. Results demonstrated that: 1) A. zeteki sperm morphology is similar to that described in other Bufonids; the species successfully produces high quality spermatozoa when stimulated with intraperitoneal injection of Amphiplex, GnRH and hCG; hormonal stimulation is not detrimental to the motility parameters, cell morphology or DNA integrity; and, there is no seasonal effect on the response to the hormonal stimulation. These results indicate that the use of hormone treatments can be included in captive breeding programs to safely collect good quality sperm; 2) dilution of spermic urine in water highly reduces sperm motility, forward progressive motility, DNA and morphological integrity while storage of spermic urine at 4 °C preserves sperm quality for at least 46 min after collection; and 3) some recovery of viable A. zeteki spermatozoa after cryopreservation can be achieved by equilibrating the ARS-diluted samples for 5 min at 4 °C in CPA3-REY, using step-wise cooling before plunging the samples in LN2. Collective results offer missing information on the reproductive biology of the male A. zeteki and lead to the application of ARTs for the captive management of this charismatic but critically endangered species

Creación de un banco genómico de esperma para la conservación de la rana coronada (Triprion spinosus)

Una rápida disminución de la diversidad de especies de anfibios que se ha producido en todo el mundo en las últimas décadas requiere medidas de conservación inmediata y eficientes. La rana arbórea coronada (Anotheca spinosa). La especie está siendo afectada por el hongo causante de la quitridiomicosis (Bd). Los bancos genómicos (GRB) funcionan como pólizas de seguro para las especies en peligro Los GRB se pueden utilizar para almacenar germoplasma de poblaciones amenazadas, con la intención deliberada de utilizarlos en un programa de reproducción en el futuro. El objetivo de este estudio es desarrollar un protocolo de estimulación hormonal y criopreservación de esperma para la conservación de la Rana Coronada (Anotheca spinosa). Se aplicó la estimulación hormonal en 35 machos de A. spinosa. Los tratamientos fueron aplicados vía intraperitoneal. Se tomaron muestras de 8 individuos por tratamiento. La colecta de la orina espermática se llevó a cabo insertando un catéter en la cloaca. Para establecer las curvas de concentración espermática y los picos de producción para cada hormona, las muestras fueron colectadas 0.5, 1.5, 2.5, 3.5, 4.5, 5.5, 6.5, 24, 28 y 48 h post-estimulación. Los tratamientos hormonales utilizados fueron: 1, 2 o 4 μg/gpc del agonista de la hormona liberadora de la gonadotropina GnRH-des- Gly10, D-Ala6 , Pro-NHEt9; 5 y 10 IU/gpc hormona gonadotrópica humana (hCG). Como controles se utilizó orina obtenida sin estimulación hormonal y controles de orina de animales inyectados con Amphibian Ringer Solution (ARS). Para cada una de las colectas se procedió a evaluar la calidad espermática en términos de concentración, osmolalidad, pH, volumen, porcentaje de motilidad, porcentaje de movimiento progresivo y morfología). Los resultados indican que para la especie A. espinosa todos los tratamientos hormonales estimularon la producción de esperma, sin embargo, los tratamientos con 1 y 4 μg/gpc GnRH no fueron diferentes a los controles

Fertilización artificial aplicado a la conservación de la rana hojarasca desvanciente (Craugastor evanesco)

Dentro de los vertebrados, los anfibios representan una clase biológica de gran diversidad que enfrenta la situación más crítica. Existen dificultades dentro de los programas de reproducción en cautiverio que limitan la reproducción exitosa de dichas especies y su posterior reintroducción. La prioridad de establecer programas de conservación ex situ ha promovido la creación de centros de conservación en cautiverio con la finalidad de mantener vivas a estas especies y reproducir especímenes genéticamente viables Entre ellas, el poco conocimiento sobre la biología general y las características reproductivas específicas de cada especie. Craugastor evanesco es una de nuestras especies endémicas que habita en la cuenca atlántica y Coclé, apenas descrita en el año 2010 y es muy susceptible a la infección del hongo patógeno Bd, con alta probabilidad de desaparecer en vida silvestre. Por lo mencionado anteriormente, nuestro objetivo general es desarrollar un protocolo de fertilización artificial aplicado a la conservación de la rana hojarasca desvaneciente (Craugastor evanesco). Para este fin se comparará la efectividad de estimulación de una sola dosis ovulatoria vs la efectividad de estimulación utilizando dosis preparatorias previas de menor concentración seguidas de la administración de la dosis ovulatoria de mayor concentración. Los huevos obtenidos mediante estimulación con el/los tratamientos más efectivos serán colocados en un plato Petri humedecido con ARS. Las muestras de esperma de alta calidad (motilidad y movimiento progresivo > 90%) serán distribuidas sobre la masa de huevos utilizando una pipeta

Sperm collection and storage for the sustainable management of amphibian biodiversity

Current rates of biodiversity loss pose an unprecedented challenge to the conservation community, particularly with amphibians and freshwater fish as the most threatened vertebrates. An increasing number of environmental challenges, including habitat loss, pathogens, and global warming, demand a global response toward the sustainable management of ecosystems and their biodiversity. Conservation Breeding Programs (CBPs) are needed for the sustainable management of amphibian species threatened with extinction. CBPs support species survival while increasing public awareness and political influence. Current CBPs only cater for 10% of the almost 500 amphibian species in need. However, the use of sperm storage to increase efficiency and reliability, along with an increased number of CBPs, offer the potential to significantly reduce species loss. The establishment and refinement of techniques over the last two decades, for the collection and storage of amphibian spermatozoa, gives confidence for their use in CBPs and other biotechnical applications. Cryopreserved spermatozoa has produced breeding pairs of frogs and salamanders and the stage is set for Lifecycle Proof of Concept Programs that use cryopreserved sperm in CBPs along with repopulation, supplementation, and translocation programs. The application of cryopreserved sperm in CBPs, is complimentary to but separate from archival gene banking and general cell and tissue storage. However, where appropriate amphibian sperm banking should be integrated into other global biobanking projects, especially those for fish, and those that include the use of cryopreserved material for genomics and other research. Research over a broader range of amphibian species, and more uniformity in experimental methodology, is needed to inform both theory and application. Genomics is revolutionising our understanding of biological processes and increasingly guiding species conservation through the identification of evolutionary significant units as the conservation focus, and through revealing the intimate relationship between evolutionary history and sperm physiology that ultimately affects the amenability of sperm to refrigerated or frozen storage. In the present review we provide a nascent phylogenetic framework for integration with other research lines to further the potential of amphibian sperm banking

Ecology- and bioassay-guided drug discovery for treatments of tropical parasitic disease: 5α,8α-epidioxycholest-6-en-3β-ol isolated from the mollusk Dolabrifera dolabrifera shows significant activity against Leishmania donovani

An ecology- and bioassay-guided search employed to discover compounds with activity against tropical parasitic diseases and cancer from the opisthobranch mollusk, Dolabrifera dolabrifera, led to the discovery of antileishmanial properties in the known compound, 5α,8α-epidioxycholest-6-en-3β-ol (1). Compound 1 was identified through nuclear magnetic resonance spectroscopy (1H, 13C) and mass spectrometry. The compound was concentrated in the digestive gland of D. dolabrifera, but was not detected in other body parts, fecal matter or mucus. Compound 1 showed an IC50 of 4.9 µM towards the amastigote form of Leishmania donovani compared with an IC50 of 281 µM towards the control Vero cell line, a 57.3-fold difference, and demonstrated no measurable activity against Plasmodium falciparum, Trypanosoma cruzi, and the breast cancer cell line, MCF-7