Automatische sequentielle Zuordnung von mehrdimensionalen Protein-NMR-Spektren sowie molekulardynamisch gestützte stereospezifische Zuordnung von Seitenkettenamidgruppen in Modellpeptiden

Im ersten Teil dieser Arbeit wurden die stereospezifischen Zuordnungen der Seitenkettenamidgruppen der Random-Coil-Modellpeptide Gly-Gly-Asn-Ala-NH2 und Gly-Gly-Gln-Ala-NH2 ermittelt. Stereospezifische Zuordnungen werden meistens mit Hilfe von Datenbanken bereits gelöster Biomoleküle bestimmt. Die bekannteste dieser Datenbanken ist die Biological Magnetic Resonance Data Bank (BMRB). Untersucht man die in der BMRB gespeicherten chemischen Verschiebungen genauer, so findet man Inkonsistenzen bei den stereospezifischen Zuordnungen. Es wurde außerdem festgestellt, dass die beiden Programme SHIFTS und SHIFTX, die chemischen Verschiebungen aus den 3D-Strukturen von Peptiden und Proteinen vorhersagen können, Resonanzen ebenfalls stereospezifisch falsch zuordnen können. Für die stereospezifische Zuordnung wurden NOESY-Spektren der Random-Coil-Peptide von Gly-Gly-Asn-Ala-NH2 und Gly-Gly-Gln-Ala-NH2 aufgenommen. Mit AUREMOL RELAX, das den vollständigen Relaxationsmatrixformalismus verwendet, wurden entsprechende Spektren aus Molekulardynamik (MD) Rechnungen der beiden Tetrapeptide simuliert. Ein Vergleich der experimentellen und simulierten Signalvolumina erbrachte eine eindeutige stereospezifische Zuordnung der Random-Coil-Verschiebungen der Seitenkettenamid- und Hβ-Protonen der beiden Aminosäuren. Die vorgestellte Methode hat das Potential in zukünftigen Arbeiten auf einen großen Teil aller Aminosäuren übertragen zu werden, um eine vollständige stereospezifische Random-Coil-Verschiebungsdatenbank zu erzeugen. Im zweiten Teil der Arbeit wurde SIBASA, das neue AUREMOL Modul zur automatischen Zuordnung von HSQC-Spektren und NMR-Protonenresonanzen vorgestellt. SIBASA basiert auf dem Top-Down-Ansatz und bestimmt die vollständige Zuordnung eines Proteins, indem es die optimale Übereinstimmung zwischen experimentellen und mit variablen chemischen Verschiebungen zurückgerechnete NOESY-Spektren findet. Durch den Top-Down-Ansatz ist es möglich 2-D-NOESY-Spektren von großen Proteinen als Informationsquelle der automatische Zuordnung zu verwenden. SIBASA benötigt für die vollständige Zuordnung der Protonen und Stickstoffresonanzen eine 3D-Struktur des Proteins, das 2-D-NOESY- und das 3D 15N-NOESY-HSQC-Spektrum. Die Rückrechnungen der NOESY-Spektren werden wieder mit AUREMOL RELAX erzeugt. RELAX wertet zudem MD-Trajektorien aus, um Informationen über lokale Beweglichkeit im Protein erhalten. Mithilfe der Programme SHIFTS und SHIFTX2 kann SIBASA Wahrscheinlichkeitsdichteverteilungen der chemischen Verschiebungen der zuzuordnen Kerne aus der MD-Trajektorie des betrachten Proteins vorhersagen, was zur Verbesserung der Zuverlässigkeit und Geschwindigkeit der automatischen Zuordnung führt. Die optimale Übereinstimmung der experimentellen und der zurückgerechneten NOESY-Spektren wird durch den Threshold-Accepting-Algorithmus, der in mehreren Instanzen mit verschiedenen Startzuordnung ausgeführt wird, bestimmt. Mehrere Instanzen helfen SIBASA die wahrscheinlichste vollständige Zuordnung zu finden und sind Voraussetzung für die Verifikation. SIBASA ist in der Lage, jeder automatisch gefundene Zuordnung eine Wahrscheinlichkeit zuzuordnen. Die automatische Zuordnung wurde mit den NOESY-Spektren und den Röntgenstrukturen der Proteine von S. aureus HPr (H15A) (88 Aminosäuren), von Thioredoxin Plasmodium falciparum (PfTrx) (104 Aminosäuren) und von Ras(T35S)-GppNHp (166 Aminosäuren) getestet. SIBASA konnte 91,3 % der Resonanzen von HPr (H15A), 81,9 % der Resonanzen von PfTrx und 77,6 % der Resonanzen von Ras(T35S)-GppNHp richtig zuordnen. Eine Verifikation auf dem signifikanten Niveau ermöglicht es, einen großen Teil der falschen Zuordnungen von den richtigen zu trennen. Insgesamt erhielten 77,8 % der automatisch gefunden Resonanzzuordnungen von HPr (H15A), 77,5 % der gefunden Resonanzzuordnungen von PfTrx und 66,8 % der Resonanzzuordnungen von Ras(T35S)-GppNHp von SIBASA eine Wahrscheinlichkeit von mindestens 95 %. Von diesen Resonanzen sind beim HPr (H15A) nur 3,5 %, beim PfTrx nur 9,7 % und beim Ras(T35S)-GppNHp nur 10,2 % falsch zugeordnet worden. Es wurde anhand der drei Proteine gezeigt, dass SIBASA in der Lage ist HSQC-Spektren sicher teilzuordnen. Das HSQC-Spektrum von HPr (H15A) konnte von SIBASA vollständig richtig zugeordnet werden. Beim PfTrx waren 90 % und beim Ras(T35S)-GppNHp 88 % der automatisch gefundenen HSQC-Zuordnungen richtig. Vertraut man nur Zuordnungen von HSQC-Signalen, die von SIBASA bestätigt wurden, so konnten 82 % der Signale von HPr (H15A), 72 % der Signale von PfTrx und 68 % der HSQC-Signale des Ras(T35S)-GppNHp richtig zugeordnet werden. In keinem Fall enthielt die Gruppe der bestätigten Signale eine falsche Zuordnung. Das vorgestellte Modul ermöglicht es für die Wirkstoffentwicklung wichtige [1H,15N]-HSQC-Spektren automatisch zuzuordnen, ohne auf die umständliche Markierung der Proteine mit dem Isotop 13C zurückgreifen zu müssen, wobei eine Kristall- oder eine NMR-Struktur eines homologen Proteins verfügbar ist

Stereospecific assignment of the asparagine and glutamine sidechain amide protons in proteins from chemical shift analysis

Side chain amide protons of asparagine and glutamine residues in random-coil peptides are characterized by large chemical shift differences and can be stereospecifically assigned on the basis of their chemical shift values only. The bimodal chemical shift distributions stored in the biological magnetic resonance data bank (BMRB) do not allow such an assignment. However, an analysis of the BMRB shows, that a substantial part of all stored stereospecific assignments is not correct. We show here that in most cases stereospecific assignment can also be done for folded proteins using an unbiased artificial chemical shift data base (UACSB). For a separation of the chemical shifts of the two amide resonance lines with differences >0.40 ppm for asparagine and differences >0.42 ppm for glutamine, the downfield shifted resonance lines can be assigned to H-delta 21 and H-epsilon 21, respectively, at a confidence level > 95%. A classifier derived from UASCB can also be used to correct the BMRB data. The program tool AssignmentChecker implemented in AUREMOL calculates the Bayesian probability for a given stereospecific assignment and automatically corrects the assignments for a given list of chemical shifts

Metal–Bis(2-picolyl)amine Complexes as State 1(T) Inhibitors of Activated Ras Protein

Allosteric interactions: Metal(II) cyclens inhibit Ras-effector interactions by stabilizing a weak effector-binding state of Ras, state 1(T), and binding directly in the active site. The novel state (1T) inhibitor Zn(2+) -BPA (BPA=bis(2-picolyl)amine) binds outside the nucleotide binding pocket but nevertheless allosterically stabilizes state 1(T) and thus inhibits the Ras-Raf interactio

Late Cretaceous extension overprinting a steep belt in the Northern Calcareous Alps (Schesaplana, Rätikon, Switzerland and Austria)

The Triassic to Cretaceous sediment succession of the Lechtal Nappe in the western part of the Northern Calcareous Alps (NCA) has been deformed into large-scale folds and crosscut by thrust and extensional faults during Late Cretaceous (Eoalpine) and Tertiary orogenic processes. The following sequence of deformation is developed from overprinting relations in the field: (D1) NW-vergent folds related to thrusting; (D2) N–S shortening leading to east–west-trending folds and to the formation of a steep belt (Arlberg Steep Zone) along the southern border of the NCA; (D3) E–W to NE–SW extension and vertical shortening, leading to low-angle normal faulting and recumbent “collapse folds” like the Wildberg Syncline. D1 and D2 are Cretaceous in age and predate the Eocene emplacement of the Austroalpine on the Penninic Nappes along the Austroalpine basal thrust; the same is probably true for D3. Finally, the basal thrust was deformed by folds related to out-of-sequence thrusting. These results suggest that the NCA were at least partly in a state of extension during the sedimentation of the Gosau Group in the Late Cretaceous