Plasmids and aromatic degradation in Sphingomonas for bioremediation : Aromatic ring cleavage genes in soil and rhizosphere

Microbial degradation pathways play a key role in the detoxification and the mineralization of polyaromatic hydrocarbons (PAHs), which are widespread pollutants in soil and constituents of petroleum hydrocarbons. In microbiology the aromatic degradation pathways are traditionally studied from single bacterial strains with capacity to degrade certain pollutant. In soil the degradation of aromatics is performed by a diverse community of micro-organisms. The aim of this thesis was to study biodegradation on different levels starting from a versatile aromatic degrader Sphingobium sp. HV3 and its megaplasmid, extending to revelation of diversity of key catabolic enzymes in the environment and finally studying birch rhizoremediation in PAH-polluted soil. To understand biodegradation of aromatics on bacterial species level, the aromatic degradation capacity of Sphingobium sp. HV3 and the role of the plasmid pSKY4, was studied. Toluene, m-xylene, biphenyl, fluorene, phenanthrene were detected as carbon and energy sources of the HV3 strain. Tn5 transposon mutagenesis linked the degradation capacity of toluene, m-xylene, biphenyl and naphthalene to the pSKY4 plasmid and qPCR expression analysis showed that plasmid extradiol dioxygenases genes (bphC and xylE) are inducted by phenanthrene, m-xylene and biphenyl whereas the 2,4-dichlorophenoxyacetic acid herbicide induced the chlorocatechol 1,2-dioxygenase gene (tfdC) from the ortho-pathway. A method to study upper meta-pathway extradiol dioxygenase gene diversity in soil was developed. The extradiol dioxygenases catalyse cleavage of the aromatic ring between a hydroxylated carbon and an adjacent non-hydroxylated carbon (meta-cleavage). A high diversity of extradiol dioxygenases were detected from polluted soils. The detected extradiol dioxygenases showed sequence similarity to known catabolic genes of Alpha-, Beta-, and Gammaproteobacteria. Five groups of extradiol dioxygenases contained sequences with no close homologues in the database, representing novel genes. In rhizoremediation experiment with birch (Betula pendula) treatment specific changes of extradiol dioxygenase communities were shown. PAH pollution changed the bulk soil extradiol dioxygenase community structure and birch rhizosphere contained a more diverse extradiol dioxygenase community than the bulk soil showing a rhizosphere effect. The degradation of pyrene in soil was enhanced with birch seedlings compared to soil without birch. The complete 280,923 kb nucleotide sequence of pSKY4 plasmid was determined. The open reading frames of pSKY4 were divided into putative conjugative transfer, aromatic degradation, replication/maintaining and transposition/integration function-encoding proteins. Aromatic degradation orfs shared high similarity to corresponding genes in pNL1, a plasmid from the deep subsurface strain Novosphingobium aromaticivorans F199. The plasmid backbones were considerably more divergent with lower similarity, which suggests that the aromatic pathway has functioned as a plasmid independent mobile genetic element. The functional diversity of microbial communities in soil is still largely unknown. Several novel clusters of extradiol dioxygenases representing catabolic bacteria, whose function, biodegradation pathways and phylogenetic position is not known were amplified with single primer pair from polluted soils. These extradiol dioxygenase communities were shown to change upon PAH pollution, which indicates that their hosts function in PAH biodegradation in soil. Although the degradation pathways of specific bacterial species are substantially better depicted than pathways in situ, the evolution of degradation pathways for the xenobiotic compounds is largely unknown. The pSKY4 plasmid contains aromatic degradation genes in putative mobile genetic element causing flexibility/instability to the pathway. The localisation of the aromatic biodegradation pathway in mobile genetic elements suggests that gene transfer and rearrangements are a competetive advantage for Sphingomonas bacteria in the environment.Maaperän mikro-organismit (bakteerit, arkit, sienet ja alkueläimet) muodostavat valtavan lajien ja aineenvaihdunnan monimuotoisuuden kirjon. Tämä monimuotoisuus vastaa pääasiallisesti luonnossa tapahtuvasta orgaanisten ja epäorgaanisten aineiden kierrosta. Kaikki luonnolliset ja suurin osa ihmisten tuottamista yhdisteistä toimivat mikro-organismien energian lähteenä hajoten prosessissa lopulta lähtöaineiksi. Mikro-organismit hajottavat myös useita ympäristömyrkyiksi luettavia yhdisteitä. Esitumallisten (bakteerit ja arkit) eliöiden määrä maaperässä on valtava, tyypillisesti gramma maata sisältää 1-10 miljardia solua. Maailmanlaajuisesti esitumalliset eliöt sisältävät yhtä paljon hiiliyhdisteitä kuin kasvit ja kymmenen kertaa enemmän typpeä ja fosforia. Maaperän esitumallisten aineenvaihdunta tunnetaan kuitenkin heikosti, koska vain murto-osaa lajeista pystytään viljelemään laboratoriossa, mikä mahdollistaisi niiden fysiologian yksityiskohtaisen tutkimisen. Tässä väitöskirjassa kuvattiin suomalaisesta peltomaasta eristetyn Sphingobium sp. HV3 bakteerikannan genetiikkaa ja aromaattisten hiilivetyjen hajotuskykyjä. Kehitettiin molekyylibiologinen tutkimusmenetelmä aromaattisen aineiden hajotuksesta vastaavien geenien havaitsemiseen maaperän mikrobiyhteisöissä. Menetelmällä arvioitiin koivun (Betula pendula) juuriston vaikutusta hajoittajabakteeriyhteisöihin polyaromaattisilla yhdisteillä saastuneessa maassa. Aromaattisiin hiilivetyihin kuuluu monia ympäristömyrkkyjä, jotka leviävät ihmisen toiminnan seurauksena ekosysteemiin mm. öljyvahingoissa, petrokemian teollisuuden päästöinä ja epätäydellisissä palamisreaktioissa. Työssä osoitettiin, että Sphingobium sp. HV3 kanta pystyy hajottamaan useita erityyppisiä myös ympäristömyrkkyinä tunnettuja aromaattisia hiilivetyjä: kaksi- ja kolmirenkaisia polyaromaatteja, bifenyyliä ja fluoreenia sekä mono-aromaattisia liuottimia. Kun HV3-bakteerikannan sisältämän kehämäisen geneettisen elementin (plasmidin) pSKY4:n geenien täydellinen emäsjärjestys selvitettiin, löydettiin myös aromaattisten hiilivetyjen hajotuksessa vastaavat geenit. Hajotustien sijainti plasmidissa mahdollistaa sen siirtymisen bakteerilajista toiseen. Lisäksi hajotustien molemmilta puolilta löydettiin useita geenejä, jotka koodaavat DNA:n organisaatiomuutoksia katalysoivia entsyymejä. Tämä viittaa siihen, että hajotustie voi toimia plasmidista riippumattomana liikkuvana geneettisenä elementtinä. Plasmidit sekä niiden sisäiset liikkuvat geneettiset elementit näyttävät vaikuttavan laajalle levinneen Sphingomonas-suvun aromaattisten hajotusteiden leviämiseen ja evoluutioon. Väitöskirjassa kehitetyllä molekyylibiologisella tutkimusmenetelmällä selvitettiin aromaattisten yhdisteiden hajotusgeenien monimuotoisuutta öljy-yhdisteillä saastuneissa maissa ja osoitettiin että saastuneet maat sisältävät lukuisia uusia geneettisiä hajotusteitä, joita ei ole kuvattu viljellyistä bakteerikannoista. Merkkigeenejä tieteelle tuntemattomista hajotusteistä havaittiin maaperässä paljon enemmän kuin tunnettuista. Koivun (Betula pendula) juuriston vaikutusta maaperän hajotusmerkkigeenien monimuotoisuuteen ja polyaromaattisten hiilivetyjen hajoamiseen tutkittiin kasvihuonekokeessa. Kokeessa osoitettiin että koivun juuristoa ympäröivässä maassa on monimuotoisempi aromaattisten yhdisteiden hajotuspopulaatio kuin juurettomassa maassa. Lisäksi koivun juuriston vaikutus näkyi tehostuneena polyaromaattisten yhdisteiden hajoamisena. Koivun istutus voi tulevaisuudessa tarjota keinon tehostaa öljyhiilivedyillä saastuneen maaperän puhdistamista samalla muuttaen joutomaan puuviljelmäksi. Tämä työ osoitti että aromaattisten hiilivetyjen hajoaminen maaperän mikrobiyhteisöissä on monimutkainen prosessi, johon osallistuu monia vielä tuntemattomia bakteerilajeja ja hajotusteitä. Tämänkaltaiset hajotustiet voivat sijaita myös siirtyvissä geneettisissä elementeissä ja siten siirtyä ei vaan genomin sisällä vaan myöskin bakteerista toiseen maaperässä

A novel Arabidopsis phyllosphere resident Protomyces species and a re-examination of genus Protomyces based on genome sequence data

Protomyces is an understudied genus of yeast-like fungi currently defined as phytopathogens of only Umbelliferae and Compositae. Species relationships and boundaries remain controversial and molecular data are lacking. Of the 82 named Protomyces, we found few recent studies and six available cultures. We previously isolated Protomyces strains from wild Arabidopsis thaliana, a member of Brassicaceae, a family distant from accepted Protomyces hosts. We previously sequenced the genomes of all available Protomyces species, and P. arabidopsidicola sp. nov. strain C29, from Arabidopsis. Phylogenomics suggests this new species occupied a unique position in the genus. Genomic, morphological, and physiological characteristics distinguished P. arabidopsidicola sp. nov. from other Protomyces. Nuclear gene phylogenetic marker analysis suggests actin1 gene DNA sequences could be used with nuclear ribosomal DNA internal transcribed spacer sequences for rapid identification of Protomyces species. Previous studies demonstrated P. arabidopsidicola sp. nov. could persist on the Arabidopsis phyllosphere and Protomyces sequences were discovered on Arabidopsis at multiple sites in different countries. We conclude that the strain C29 represents a novel Protomyces species and propose the name of P. arabidopsidicola sp. nov. Consequently, we propose that Protomyces is not strictly associated only with the previously recognized host plants.Peer reviewe

Ecosystem services of soil microbial communities - developing sustainable cultivation methods for agriculture

The aim of the project is to develop innovative and feasible agro-environmental technology for improvement of environmental sustainability of cultivation methods. This will be achieved by increasing soil crop cover taking advantage of ecosystem services of soil microbes to suppress crop pathogens as an alternative system for chemical control, and to optimal degradation of crop residues

Interaction between Bacteriophage DMS3 and Host CRISPR Region Inhibits Group Behaviors of Pseudomonas aeruginosa

Bacteriophage infection has profound effects on bacterial biology. Clustered regular interspaced short palindromic repeats (CRISPRs) and cas (CRISPR-associated) genes are found in most archaea and many bacteria and have been reported to play a role in resistance to bacteriophage infection. We observed that lysogenic infection of Pseudomonas aeruginosa PA14 with bacteriophage DMS3 inhibits biofilm formation and swarming motility, both important bacterial group behaviors. This inhibition requires the CRISPR region in the host. Mutation or deletion of five of the six cas genes and one of the two CRISPRs in this region restored biofilm formation and swarming to DMS3 lysogenized strains. Our observations suggest a role for CRISPR regions in modifying the effects of lysogeny on P. aeruginosa

Sarkopenia - lihasmassan ja -voiman kato

Vertaisarvioitu. English summary.• Sarkopenia tarkoittaa etenevää yleistynyttä lihasmassan ja -voiman vähenemistä. Se ei ole ikään sidottu, mutta se on tavallisempi vanhalla iällä. • Patofysiologia on monimutkainen ja etiologia moninainen. Tehokas ehkäisy edellyttää elämänaikaisia toimia. • Sarkopenia lisää merkittävien kliinisten tapahtumien riskiä, mm. kaatumisia, toimintakyvyn ¬heikentymistä ja gerastenian kehittymistä. • Toistaiseksi paras hoito koostuu lihasvoimaharjoitusten ja ravitsemushoidon yhdistämisestä. ¬Spesifisiä lääkehoitomahdollisuuksia tutkitaan.Peer reviewe

Isolation and characterization of resident yeasts from the phylloplane of Arabidopsis thaliana

The genetic model plant Arabidopsis thaliana (arabidopsis) has been instrumental to recent advances in our understanding of the molecular function of the plant immune system. However, this work has not yet included plant associated and phytopathogenic yeasts largely due to a lack of yeast species known to interact with arabidopsis. The plant phylloplane is a significant habitat for neutral-residents, plant-growth and health-promoting species, and latent-pathogenic species. However, yeast phylloplane residents of arabidopsis remain underexplored. To address this, resident yeasts from the phyllosphere of wild arabidopsis collected in field conditions have been isolated and characterized. A total of 95 yeast strains representing 23 species in 9 genera were discovered, including potentially psychrophilic and pathogenic strains. Physiological characterization revealed thermotolerance profiles, sensitivity to the arabidopsis phytoalexin camalexin, the production of indolic compounds, and the ability to activate auxin responses in planta. These results indicate a rich diversity of yeasts present in the arabidopsis phylloplane and have created culture resources and information useful in the development of model systems for arabidopsis-yeast interactions.Peer reviewe

Pellon kasvipeitteisyyden teknologia muuttuvassa ilmastossa – maaperämikrobien ekosysteemipalvelujen hyödyntäminen

Maatalous kohtaa ilmastonmuutoksen myötä entistä suurempia ympäristöhaasteita. Eroosio– jaravinnekuorma vesistöihin kasvaa, mikäli talvet muuttuvat ennustetulla tavalla lauhemmiksi jasateisemmiksi. Talviaikainen kasvipeitteisyys suojaa maan pintaa vähentäen eroosio– jaravinnehuuhtoumariskiä. Kevätkylvöisten kasvien viljelyssä kasvukauden ulkopuolinenkasvipeitteisyys voidaan toteuttaa sekä vähentämällä syysmuokkausta (mm. kevennetty muokkaus,suorakylvö sänkeen keväällä) että lisäämällä viljelykiertoon monivuotisia kasveja. Muokkaustakevennettäessä edellisen vuoden kasvustojäte voi hidastaa maan lämpenemistä ja kuivumista keväällä,sekä luoda suotuisat olosuhteet maa– jakasvinjätelevintäisille kasvitaudeille. Kasvipeitteisyydenympäristöhyöty vähenee, mikäli torjuntaaineidenkäyttötarve lisääntyy.Peltomaassa on yleensä jossain määrin luontaista kykyä estää taudinaiheuttajien kehittymistä jakasvua. Syynä ovat muut maaperän mikrobit: tietyt maaperämikrobit voivat tuottaa toisten mikrobienkasvua estäviä ns. antagonistisia yhdisteitä ja mikrobiston monimuotoisuuden sinänsä on todettuvahvistavan maan kykyä tukahduttaa sienitauteja. Maaperän mikrobiston koostumuksen ratkaisevanatekijänä on viljelytekniikka, joka vaikuttaa maamikrobien ravintoon ja elinympäristön olosuhteisiin.Tällaisia viljelyteknisiä keinoja ovat mm. maan muokkaus ja viljelykierto.Vuonna 2009 aloitettiin hanke ’Tuotannon kestävyys muuttuvissa ilmastooloissa– teknologisetratkaisut ja maaperäbiologisten ekosysteemipalvelujen hyödyntäminen’, jonka tavoitteena on kehittääinnovatiivistä ja käytännön peltoviljelyyn soveltuvaa maatalouden ympäristöteknologiaa peltojenkasvipeitteisyyden lisäämiseksi samalla hyödyntäen maaperämikrobiston ekosysteemipalvelujatautimikrobien tukahduttamiseksi luontaisin menetelmin ja kasvijätteen toivotunlaiseksi hajotukseksi.Hankkeessa on monitieteinen tutkimusryhmä MTT:n ja Helsingin yliopiston tutkijoita maataloudenympäristöteknologiasta, ympäristöbiotekniikasta, biologiasta ja mikrobiologiasta.Posterissa annetaan yleiskuva hankkeesta (ks. myös posteri Knuutila ym.) sekä esitellääntarkemmin kasvitautien luontaiseen tukahduttamiseen eli tautisuppressiivisuuteen keskittyvääosahanketta