Evaluación del efecto del óxido nítrico sobre la expresión génica en células madre embrionarias

Tesis Doctoral para optar al grado de Doctor por la Universidad Pablo de Olavide de Sevilla. presentada por Alonso Rafael Tapia Limonchi.El principal objetivo del presente trabajo es analizar el efecto global de las bajas concentraciones de oxido nítrico sobre la biología de las células madre. La expresión de las diversas isoformas de la óxido nítrico sintasa (NOS) presenta una dinámica que está relacionada con los procesos de autorrenovación y diferenciación. La disminución de la expresión de eNOS está relacionada con la pérdida de pluripotencialidad y el incremento de la expresión de iNOS con la ganancia de diferenciación. Así mismo, las bajas concentraciones de óxido nítrico suministrado exógenamente tienen un efecto positivo sobre la autorrenovación de las CMEs de ratón y humanas, siendo la concentración óptima la de 2 ¿M para el donador DETA-NO que correlaciona con una baja tasa de muerte celular y altos niveles de expresión de marcadores de pluripotencia. Las células que sobreexpresan eNOS muestran un mismo patrón de expresión que el tratamiento con bajas concentraciones de DETA-NO. A concentraciones mayores de 50 ¿M se obtienen resultados opuestos. El tratamiento con 2¿M de DETA-NO sobre las CMEs cultivadas en ausencia de LIF ofrece un patrón de expresión génica del circuito básico de regulación de la pluripotencia incrementando la expresión de marcadores clásicos (Oct4, Nanog y Sox2) y disminuyendo la expresión de cMyc y Rex1. A nivel transcriptómico el tratamiento con 2¿M de DETA-NO promueve un perfil de expresión para un grupo de genes, similar al de las células no diferenciadas (cultivadas en presencia de LIF o bFGF), mientras que para otro grupo confiere un patrón de expresión exclusivo debido al tratamiento. Entre los genes comunes encontramos algunos genes que intervienen en el proceso de autorrenovación en vías no clásicas. Es importante concluir que el tratamiento con NO por si solo no es suficiente para el mantenimiento del estado de pluripotencia de las células madre embrionarias. Durante el análisis del transcriptoma de las células tratadas con NO, no ha sido posible encontrar evidencias de diferenciación clara hacia ningún tipo celular específico. Por el contrario todos nuestros datos indican que hay una regulación génica dirigida hacia inhibir la entrada al proceso de diferenciación. Bajas concentraciones de óxido nítrico regulan positivamente la expresión de genes anti-apoptóticos y negativamente los pro-apoptóticos. Además hemos encontrado que el óxido nítrico controla el ciclo celular de las CMEs de ratón, provocando un bloqueo en la fase G2/M. Finalmente podemos concluir que el cultivo bajo estas condiciones de NO puede contribuir al mantenimiento del estado no diferenciado de las CMEs reemplazando, no en su totalidad, a factores como el LIF o el bFGF, lo cual puede ser usado en el mejoramiento de los cultivos de células madre,Peer Reviewe

Evaluación del efecto del óxido nítrico sobre la expresión génica en células madre embrionarias

Programa de doctorado en Biotecnología y Tecnología QuímicaEl principal objetivo del presente trabajo es analizar el efecto global de las bajas concentraciones de oxido nítrico sobre la biología de las células madre. La expresión de las diversas isoformas de la óxido nítrico sintasa (NOS) presenta una dinámica que está relacionada con los procesos de autorrenovación y diferenciación. La disminución de la expresión de eNOS está relacionada con la pérdida de pluripotencialidad y el incremento de la expresión de iNOS con la ganancia de diferenciación. Así mismo, las bajas concentraciones de óxido nítrico suministrado exógenamente tienen un efecto positivo sobre la autorrenovación de las CMEs de ratón y humanas, siendo la concentración óptima la de 2 ¿M para el donador DETA-NO que correlaciona con una baja tasa de muerte celular y altos niveles de expresión de marcadores de pluripotencia. Las células que sobreexpresan eNOS muestran un mismo patrón de expresión que el tratamiento con bajas concentraciones de DETA-NO. A concentraciones mayores de 50 ¿M se obtienen resultados opuestos. El tratamiento con 2¿M de DETA-NO sobre las CMEs cultivadas en ausencia de LIF ofrece un patrón de expresión génica del circuito básico de regulación de la pluripotencia incrementando la expresión de marcadores clásicos (Oct4, Nanog y Sox2) y disminuyendo la expresión de cMyc y Rex1. A nivel transcriptómico el tratamiento con 2¿M de DETA-NO promueve un perfil de expresión para un grupo de genes, similar al de las células no diferenciadas (cultivadas en presencia de LIF o bFGF), mientras que para otro grupo confiere un patrón de expresión exclusivo debido al tratamiento. Entre los genes comunes encontramos algunos genes que intervienen en el proceso de autorrenovación en vías no clásicas. Es importante concluir que el tratamiento con NO por si solo no es suficiente para el mantenimiento del estado de pluripotencia de las células madre embrionarias. Durante el análisis del transcriptoma de las células tratadas con NO, no ha sido posible encontrar evidencias de diferenciación clara hacia ningún tipo celular específico. Por el contrario todos nuestros datos indican que hay una regulación génica dirigida hacia inhibir la entrada al proceso de diferenciación. Bajas concentraciones de óxido nítrico regulan positivamente la expresión de genes anti-apoptóticos y negativamente los pro-apoptóticos. Además hemos encontrado que el óxido nítrico controla el ciclo celular de las CMEs de ratón, provocando un bloqueo en la fase G2/M. Finalmente podemos concluir que el cultivo bajo estas condiciones de NO puede contribuir al mantenimiento del estado no diferenciado de las CMEs reemplazando, no en su totalidad, a factores como el LIF o el bFGF, lo cual puede ser usado en el mejoramiento de los cultivos de células madreUniversidad Pablo de Olavide. Centro de Estudios de Postgrad

Análisis del efecto de las modificaciones post-traduccionales inducidas por óxido nítrico en células troncales embrionarias de ratón.

Motivación: La nitrosilación es un tipo de modificación postraduccional de las proteínas derivada de la presencia de óxido nítrico (NO) en el medio, y cuya acción se centra en residuos de tirosina y cisteína. Sin embargo, no se sabe con certeza como afectan estas modificaciones a la expresión génica en células embrionarias cuando se ven afectados factores de transcripción, histonas o determinados complejos proteicos. De esta forma, podría jugar un papel relevante en procesos de mantenimiento de pluripotencia o de diferenciación celular.En este proyecto se pretende analizar la influencia a nivel genómico de este patrón de expresión diferencial, para así discenir el papel que desempeña la nitrosilación en los mecanismos de regulación transcripcional de células embrionarias. Métodos: Se realizó un ensayo ChIP on chip, para visualizar qué regiones génicas se ven afectadas por el NO en forma de sus dos modificaciones principales (Schnetz MP 2010). Este ensayo permite determinar qué regiones génicas se han visto afectadas por factores de transcripción modificados respecto a una muestra control. Con los resultados de este ensayo, se han iniciado diferentes procedimientos bioinformáticos para la normalización, cribado y visualización de las regiones a las que se unen factores de transcripción nitrosilados, así como identificación de motivos modificados y factores implicados en el proceso. Resultados: Resultados preeliminares demostraron que las proteínas nitrosiladas en residuos de cisteína ocupan regiones reguladoras de genes implicados en procesos de autorenovación y diferenciación celular. Posteriormente, se ha procedido al análisis de genes concretos implicados, motivos y factores de transcripción afectados. Conclusiones: Estamos a la espera de obtener resultados definitivos para realizar las valoraciones oportunas

Regulación de la Expresión del Factor de Transcripción Pdx1 por Altas Concentraciones de Óxido Nítrico en Células Madre Embrionarias de Ratón

Estudios previos en nuestro laboratorio muestran que el óxido nítrico a altas concentraciones promueve la diferenciación de células madre embrionarias de ratón (mESC), e induce la expresión de genes de endodermo, entre ellos el factor de transcripción Pdx1, “Pancreas/duodenum homeobox protein 1”. Pdx1, tiene un rol importante en el desarrollo embrionario del páncreas y en la células beta madura. Con el fin de conocer los mecanismos por los que el NO incrementa la expresión de Pdx1, hemos estudiado la región promotora de este gen, encontrando que la expresión de Pdx1 se asocia con la liberación del factor de transcripción Egr1. Además, análisis epigenéticos del promotor muestran que la expresión de Pdx1 va asociada a un cambio en el patrón de metilación de su promotor y a la ocupación de marcas de histonas activadoras (H3Ac y H3K4me3) y a la desocupación de modificadores represores de histonas (HDAC) en el promotor de Pdx1

Nitric oxide prevents mouse embryonic stem cell differentiation through regulation of gene expression, cell signaling, and control of cell proliferation

Nitric oxide (NO) delays mouse embryonic stem cell (mESC) differentiation by regulating genes linked to pluripotency and differentiation. Nevertheless, no profound study has been conducted on cell differentiation regulation by this molecule through signaling on essential biological functions. We sought to demonstrate that NO positively regulates the pluripotency transcriptional core, enforcing changes in the chromatin structure, in addition to regulating cell proliferation, and signaling pathways with key roles in stemness. Culturing mESCs with 2 μM of the NO donor diethylenetriamine/NO (DETA/NO) in the absence of leukemia inhibitory factor (LIF) induced significant changes in the expression of 16 genes of the pluripotency transcriptional core. Furthermore, treatment with DETA/NO resulted in a high occupancy of activating H3K4me3 at the Oct4 and Nanog promoters and repressive H3K9me3 and H3k27me3 at the Brachyury promoter. Additionally, the activation of signaling pathways involved in pluripotency, such as Gsk3-β/β-catenin, was observed, in addition to activation of PI3 K/Akt, which is consistent with the protection of mESCs from cell death. Finally, a decrease in cell proliferation coincides with cell cycle arrest in G2/M. Our results provide novel insights into NO-mediated gene regulation and cell proliferation and suggest that NO is necessary but not sufficient for the maintenance of pluripotency and the prevention of cell differentiation.Ministerio de Economía y Competitividad, Secretaria de Estado de Investigacion Desarrollo e Innovacion co-funded by Fondos FEDER; Grant number: SAF2005-08014, SAF2006-06673, SAF2007/60105, CYT-836, IPT-2011-1615-900000; Grant sponsor: Ministerio de Economía y Competitividad, Instituto de Salud Carlos III co-funded by Fondos FEDER; Grant number: RED-TERCEL RD06/0010/0025, FIS-052106 and CIBERDEM initiative; Grant sponsor: Junta de Andalucía, Consejería de Economía, Innovacion, Ciencia y Empleo-CEICE; Grant number: PAI/CTS576, PI-0022/2008, Proyecto Motriz/CTS-7127/2011; Grant sponsor: Junta de Andalucía, Consejería de Salud; Grant number: PI-0105/2010, PI-0095/2007; Grant sponsor: Junta de Andalucía, Consejería de Salud, Servicio Andaluz de Salud; Grant number: SAS 11245.Peer Reviewe

Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells toward Functional Pancreatic ß-Cell Surrogates through Epigenetic Regulation of Pdx1 by Nitric Oxide

Pancreatic and duodenal homeobox 1 (Pdx1) is a transcription factor that regulates the embryonic development of the pancreas and the differentiation toward ß cells. Previously, we have shown that exposure of mouse embryonic stem cells (mESCs) to high concentrations of diethylenetriamine nitric oxide adduct (DETA-NO) triggers differentiation events and promotes the expression of Pdx1. Here we report evidence that Pdx1 expression is associated with release of polycomb repressive complex 2 (PRC2) and P300 from its promoter region. These events are accompanied by epigenetic changes in bivalent markers of histones trimethylated histone H3 lysine 27 (H3K27me3) and H3K4me3, site-specific changes in DNA methylation, and no change in H3 acetylation. On the basis of these findings, we developed a protocol to differentiate mESCs toward insulin-producing cells consisting of sequential exposure to DETA-NO, valproic acid, and P300 inhibitor (C646) to enhance Pdx1 expression and a final maturation step of culture in suspension to form cell aggregates. This small molecule-based protocol succeeds in obtaining cells that express pancreatic ß-cell markers such as PDX1, INS1, GCK, and GLUT2 and respond in vitro to high glucose and KClCentro Anadaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa (CABIMER)Postprin

Mesenchymal Stromal Cell-Based Therapies as Promising Treatments for Muscle Regeneration After Snakebite Envenoming

Snakebite envenoming is a global neglected disease with an incidence of up to 2.7 million new cases every year. Although antivenoms are so-far the most effective treatment to reverse the acute systemic effects induced by snakebite envenoming, they have a limited therapeutic potential, being unable to completely neutralize the local venom effects. Local damage, such as dermonecrosis and myonecrosis, can lead to permanent sequelae with physical, social, and psychological implications. The strong inflammatory process induced by snake venoms is associated with poor tissue regeneration, in particular the lack of or reduced skeletal muscle regeneration. Mesenchymal stromal cells (MSCs)-based therapies have shown both anti-inflammatory and pro-regenerative properties. We postulate that using allogeneic MSCs or their cell-free products can induce skeletal muscle regeneration in snakebite victims, improving all the three steps of the skeletal muscle regeneration process, mainly by anti-inflammatory activity, paracrine effects, neovascularization induction, and inhibition of tissue damage, instrumental for microenvironment remodeling and regeneration. Since snakebite envenoming occurs mainly in areas with poor healthcare, we enlist the principles and potential of MSCs-based therapies and discuss regulatory issues, good manufacturing practices, transportation, storage, and related-procedures that could allow the administration of these therapies, looking forward to a safe and cost-effective treatment for a so far unsolved and neglected health problem.The authors are supported by the University Pablo de Olavide (Sevilla), the University Miguel Hernández (Elche, Alicante), National University Toribio Rodriguez de Mendoza (Chachapoyas, Peru) Grants: Contrato N° 09-2019-FONDECYT-BM-INC.INV to JRT, JDRF 2-SRA-2019-837-S-B and AVI-GVA COVID-19-68 to BS, Fundación Andaluza de I+D and Al-Andalus Biopharma Project (FAID-2018-1). The authors CC-O, CG-D, and TCSA were supported by Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, Brazil (CNPq) (Process: 406163/2018-9), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, Brazil - CAPES (Program COFECUB Process: 88881.191812/2018-01) and by Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais, Brazil (FAPEMIG)

Pdx1 is transcriptionally regulated by EGR-1 during nitric oxide-induced endoderm differentiation of mouse embryonic stem cells

The transcription factor, early growth response-1 (EGR-1), is involved in the regulation of cell differentiation, proliferation, and apoptosis in response to different stimuli. EGR-1 is described to be involved in pancreatic endoderm differentiation, but the regulatory mechanisms controlling its action are not fully elucidated. Our previous investigation reported that exposure of mouse embryonic stem cells (mESCs) to the chemical nitric oxide (NO) donor diethylenetriamine nitric oxide adduct (DETA-NO) induces the expression of early differentiation genes such as pancreatic and duodenal homeobox 1 (Pdx1). We have also evidenced that Pdx1 expression is associated with the release of polycomb repressive complex 2 (PRC2) and P300 from the Pdx1 promoter; these events were accompanied by epigenetic changes to histones and site-specific changes in the DNA methylation. Here, we investigate the role of EGR-1 on Pdx1 regulation in mESCs. This study reveals that EGR-1 plays a negative role in Pdx1 expression and shows that the binding capacity of EGR-1 to the Pdx1 promoter depends on the methylation level of its DNA binding site and its acetylation state. These results suggest that targeting EGR-1 at early differentiation stages might be relevant for directing pluripotent cells into Pdx1-dependent cell lineages.C.S.-A. was a doctoral PFIS fellow of ISCIII (FI11/00301). This study was supported by grants from Consejería de Igualdad, Salud y Políticas Sociales, Junta de Andalucía (PI105/2010, TCMR06/009, and PI-0022) to F.J.B. and F.M.; from Consejería de Economía, Innovación, Ciencia y Empleo, Junta de Andalucía (CTS-7127/2011) to F.J.B.; from ISCIII cofunded by Fondos FEDER (RED-TERCEL RD 16-011-0034, along with PICI PICI21/00016 and GVA-COVID19/2021/047 to B.S.); from Servicio Andaluz de Salud (SAS 11245), and from Ministerio de Economía y Competitividad- Secretaría de Estado de Investigación Desarrollo e Innovación (IPT-2011-1615-900000). Along with this, there was support to PAIDI group CTS576, and by the European Regional Development Fund (FEDER) and the Consejería de Economía, Conocimiento, Empresas y Universidades de la Junta de Andalucía, within the framework of the operational program FEDER Andalucía 2014–2020. Specific Objective 1.2.3 “Promotion and generation of frontier knowledge and knowledge oriented to the challenges of society, development of emerging technologies” led the reference research project (UPO-1381598) of J.R.T.Peer reviewe

Caracterización molecular del dominio de la hélice del gen K13 de Plasmodium falciparum en muestras de comunidades nativas de Condorcanqui, Amazonas, Perú

Introduction: Resistance of Plasmodium falciparum to different antimalarial drugs is an obstacle to the elimination of the disease. The artemisinin resistant genotype of P. falciparum can be assessed by examining polymorphisms in the helix domain of the PfK13 gene. WHO recommends using these mutations as molecular markers to detect the presence of resistance to artemisinin in countries where P. falciparum malaria is endemic.Objective: Identify artemisinin resistance-related mutations present in the helix domain of the P. falciparum K13 gene.Materials and method: Through passive case detection (PCD), a total of 51 positive samples were collected by microscopy for Plasmodium, from six communities in the district of Río Santiago in Condorcanqui, Amazonas. Molecular species confirmation was performed by real-time PCR and the helix domain of the PfK13 gene was amplified and sequenced by capillary electrophoresis. The obtained sequences were compared with the wild type 3D7 reference strain.Results: A total of 51 positive samples were confirmed for P. falciparum from the communities of Ayambis, Chapiza, Palometa, Muchinguis, Alianza Progreso and Caterpiza. After alignment of the DNA sequences, it was determined that the samples did not present resistance-associated mutations in the K13 gene. Discussion: The results obtained are consistent with similar studies conducted in other South American countries, including Peru, so these data provide a baseline for molecular surveillance of artemisinin resistance in the Amazon region and reinforce the efficacy of artemisinin-based combination therapy in this area.Introducción. La resistencia de P. falciparum a diferentes fármacos antipalúdicos es un obstáculo para la eliminación de la enfermedad. El genotipo resistente de P. falciparum a la artemisinina se puede evaluar examinando polimorfismos en el dominio de la hélice del gen PfK13. La OMS recomienda utilizar estas mutaciones como marcadores moleculares para detectar la presencia de resistencia a la artemisinina en países donde la malaria por P. falciparum es endémica. Objetivo. Identificar mutaciones relacionadas a la resistencia de artemisinina presentes en el dominio de la hélice del gen K13 de P. falciparum.Materiales y métodos. Mediante la detección pasiva de casos (DPC) se colectó un total de 51 muestras positivas por microscopía para Plasmodium, provenientes de seis comunidades del distrito de Río Santiago en Condorcanqui, Amazonas. Se realizó la confirmación molecular de especie mediante PCR en tiempo real y el dominio de la hélice del gen PfK13 se amplificó y secuenció por electroforesis capilar. Las secuencias obtenidas se compararon con la secuencia de la cepa de referencia 3D7 de tipo salvaje.Resultados. Se confirmaron un total de 51 muestras positivas para P. falciparum, provenientes de las comunidades de Ayambis, Chapiza, Palometa, Muchinguis, Alianza Progreso y Caterpiza. Después del alineamiento de las secuencias de ADN, se determinó que las muestras no presentaron mutaciones asociadas a resistencia en el gen K13. Discusión. Los resultados obtenidos son consistentes con estudios similares realizados en otros países de América del Sur, incluyendo Perú, por lo que, estos datos proporcionan una línea base para la vigilancia molecular de resistencia a artemisinina en la región Amazonas y refuerzan la eficacia de la terapia combinada con artemisinina en esta área