RsfA (YbeB) Proteins Are Conserved Ribosomal Silencing Factors

The YbeB (DUF143) family of uncharacterized proteins is encoded by almost all bacterial and eukaryotic genomes but not archaea. While they have been shown to be associated with ribosomes, their molecular function remains unclear. Here we show that YbeB is a ribosomal silencing factor (RsfA) in the stationary growth phase and during the transition from rich to poor media. A knock-out of the rsfA gene shows two strong phenotypes: (i) the viability of the mutant cells are sharply impaired during stationary phase (as shown by viability competition assays), and (ii) during transition from rich to poor media the mutant cells adapt slowly and show a growth block of more than 10 hours (as shown by growth competition assays). RsfA silences translation by binding to the L14 protein of the large ribosomal subunit and, as a consequence, impairs subunit joining (as shown by molecular modeling, reporter gene analysis, in vitro translation assays, and sucrose gradient analysis). This particular interaction is conserved in all species tested, including Escherichia coli, Treponema pallidum, Streptococcus pneumoniae, Synechocystis PCC 6803, as well as human mitochondria and maize chloroplasts (as demonstrated by yeast two-hybrid tests, pull-downs, and mutagenesis). RsfA is unrelated to the eukaryotic ribosomal anti-association/60S-assembly factor eIF6, which also binds to L14, and is the first such factor in bacteria and organelles. RsfA helps cells to adapt to slow-growth/stationary phase conditions by down-regulating protein synthesis, one of the most energy-consuming processes in both bacterial and eukaryotic cells

Troubleshooting coupled in vitro transcription–translation system derived from Escherichia coli cells: synthesis of high-yield fully active proteins

Cell-free coupled transcription–translation systems with bacterial lysates are widely used to synthesize recombinant proteins in amounts of several mg per ml. By using reporter green fluorescence protein (GFP) we demonstrate that proteins are synthesized with an unsatisfyingly low-active fraction of (50 ± 20)%. One reason is probably the T7 polymerase used, being up to eight times faster than the intrinsic transcriptase and thus breaking the coupling between transcription and translation in bacterial systems. The active fraction of the synthesized protein was improved by using either a slower T7 transcriptase mutant or lowering the incubation temperature to 20°C. A drop of protein synthesis observed after 7 h incubation time was not due to a shortage of nucleotide triphosphates, but rather to a shortage of amino acids. Accordingly, a second addition of amino acids after 10 h during an incubation at 20°C led to synthesis of up to 4 mg/ml of GFP with virtually 100% activity

Antibiotika als Hemmer der Translation: Neue Methoden - Neue Einsichten

1\. Preface 2\. Introduction 3\. Materials and methods 4\. Results 5\. Discussion 6\. Appendix 7\. BibliographyParameters of two in vitro systems for protein synthesis were analyzed and improved. The optimized systems were used to study some selected antibiotic and to unravel their inhibition mechanisms. The following results have been achieved: 1\. Optimization of a coupled trascription-translation system (Rapid Translation System, Roche). By using the reporter Green Fluorescent Protein (GFP) we demonstrated that proteins are synthesized in high yield (up to 4 mg per ml) but with an unsatisfyingly low-active fraction (about 50%). One reason could be the T7 RNA polymerase routinely used in standard expression systems. The T7 polymerase is up to eight times faster then the intrinsic E. coli transcriptase thus breaking the coupling between transcription and translation in a bacterial system. Accordingly we could demonstrate that the active fraction of the synthesized protein was substantially improved by using either a slower T7 transcriptase mutant or lowering the incubation temperature to 20°C. A drop of protein synthesis observed after 7 h incubation time was not due to a shortage of nucleotide triphosphates, but rather to a shortage of amino acids. Accordingly, a second addition of amino acids after 7 h during an incubation at 20 degrees C led to synthesis of up to 4 mg/ml of GFP with virtually 100% activity. 2\. We developed the RTS to a simple and comprehensive tool for studying the accuracy of protein synthesis. Here, among others edeine (Ede) and pactamycin (Pct) were analyzed, EDE was found to be a strong inducer of misreading in contrast to Pct. The new drug NRI was found to be the first antibiotic showing a strong accuracy defect in the RTS system but a perfect accuracy on the standard poly(Phe) synthesis demonstrating the limitation of the latter. 3\. We developed a poly(U)-dependent poly(Phe) synthesis to a robust system yielding 100 to 300 Phe incorporation per ribosome with the following features: (i) 4.5 mM Mg2+ appears to be optimal concerning efficiency and accuracy in the polyamine system, (ii) high Phe incorporation allows the assessment of misincorporation [Leu/(Leu+Phe)] with a resolution limit of 1:10.000 (one misincorporation per 10.000 incorporated Phe) and determined the accuracy of poly(Phe) to be about 1:2000 (one Leu per 2000 Leu+Phe incorporations), (iii) misreading concerning the second nucleotide position is not observed and only very moderate misincorporation was found concerning the first nucleotide position, even when misreading was amplified by streptomycin or increased Mg2+ concentrations. 4\. Kasugamycin: The inhibitions mechanism was unraveled and together with crystallographic studies its binding site determined. We demonstrated that kasugamycin inhibits P-site tRNA binding through perturbation of the mRNA-tRNA codon-anticodon interaction near the E-site position during 30S canonical initiation. Our data explained why the 70S-type initiation on leaderless mRNA is not inhibited by this drug. 5\. Contradicting data on aminoglycoside effects on inhibition of the A site could be resolved. We showed that aminoglycoside can under artificial conditions induce a back-translocation of ribosomes confirming recent results from another group, but we could demonstrate that this effect plays no role for the inhibition mode of this important group of drugs and cannot be used to explain the bactericidal effect.Parameter zweier in vitro Systeme zur Proteinsynthese wurden analysiert und verbessert, die optimierten Systeme wurden zum Studium ausgesuchter Antibiotika und Aufklärung ihrer Hemmechanismen angewendet. Folgende Ergebnisse wurden erzielt: 1\. Optimierung eines gekoppelten Transkriptions- Translations-Systems (Rapid Translation System, Roche). Mit GFP als Reporter konnten große Mengen synthetisiert werden (bis zu 4 mg/ml), jedoch mit unbefriedigender Aktivität (ca. 50%). Ein Grund könnte die weit verbreitete T7 RNA Polymerase sein, deren Transkriptionsrate bis zu achtmal schneller ist als die der E. coli Transkriptase und damit die Kopplung von Transkription und Translation aufhebt. Tatsächlich wurde die aktive Fraktion erheblich angehoben, wenn entweder eine genetisch manipulierte, langsamere T7 Polymerase eingesetzt wurde oder die Inkubationstemperatur auf 20 °C erniedrigt wurde. Eine Abnahme der Proteinsynthese nach siebenstündiger Inkubation wurde nicht durch einen Mangel an Triphosphaten, sondern einen Mangel an Aminosäuren verursacht. Ein zweite Aminosäuregabe nach 7 Stunden bei 20°C führte zur Synthese von etwa 4 mg/ml bei praktisch voller GFP Aktivität. 2\. Das RTS wurde zu einem System für umfassende Analyse der Proteinsynthese-Genauigkeit modifiziert. Es wurden unter anderen Edein und Pactamycin analysiert. Das Edein, aber nicht Pactamycin entpuppte sich als starker Induktor von Fehleinbau. Einen überraschenden Befund gab es bei NRI: Es verursacht hohe Fehlereinbau, jedoch nicht im Standard poly(U) System (Leu gegenüber Phe Einbau), was eine Grenze des poly(U) Systems aufzeigt. 3\. Wir entwickelten unser Standard poly(U) System zu einem robusten Instrument und erzielten statistisch 100 bis 300 eingebaute Phe Reste per Ribosom. Es hat folgende Merkmale: (i) 4.5 mM Mg2+ erscheint optimal gemessen an Synthese- und Fehleinbaurate. (ii) Hoher Phe-Einbau erlaubt eine genaue Messung der Fehlerrate mit einer Auflösungsgrenze von 1:10.000 (ein Fehleinbau per 10.000 eingebauten Phe). Das System weist einen Fehlereinbau von 1:2.000 auf, was der in vivo Genauigkeit entspricht. (iii) Ein Fehleinbau bezüglich der wobble Position des Codons (dritte Nukleotidposition) häufig, einen bezüglich des mittleren Nucleotids des A-Codons wird nicht beobachtet, auch wenn der Fehleinbau dramatisch von Streptomycin oder angehobener Mg2+ Konzentration verstärkt wird; wohl aber ein sehr geringer Fehleinbau bezüglich der ersten Position. 4\. Kasugamycin: Der Hemmechanismus wurde aufgeklärt und zusammen mit kristallographischen Untersuchungen der Bindeort bestimmt: Das Antibiotikum hemmt die Bindung der P-tRNA nur in der 30S Untereinheit (jedoch nicht am 70S Ribosom), durch Störung der Codon-Anticodon Wechselwirkung nahe auf der Seite der E-Stelle. Unsere Daten erklären, warum die 70S Initiation von leaderless mRNA nicht von Kasugamycin gestört wird. 5\. Widersprechende Daten zu Aminoglycosid-Effekten auf die A-Stellen Besetzung wurden aufgelöst. Wir zeigten, dass unter artifiziellen Bedingungen Aminoglykoside eine Rück- Translokation auslösen (in Übereinstimmung mit jüngst publizierte Daten einer anderen Gruppe), aber auch dass dieser Effekt keinen Bedeutung für den Hemmechanismus hat und den bakteriziden Effekt dieser wichtigen Antibiotikagruppe erklären könnte

Antibiotics as translation inhibitors: new methods – new insights

Parameter zweier in vitro Systeme zur Proteinsynthese wurden analysiert und verbessert, die optimierten Systeme wurden zum Studium ausgesuchter Antibiotika und Aufklärung ihrer Hemmechanismen angewendet. Folgende Ergebnisse wurden erzielt: 1. Optimierung eines gekoppelten Transkriptions-Translations-Systems (Rapid Translation System, Roche). Mit GFP als Reporter konnten große Mengen synthetisiert werden (bis zu 4 mg/ml), jedoch mit unbefriedigender Aktivität (ca. 50%). Ein Grund könnte die weit verbreitete T7 RNA Polymerase sein, deren Transkriptionsrate bis zu achtmal schneller ist als die der E. coli Transkriptase und damit die Kopplung von Transkription und Translation aufhebt. Tatsächlich wurde die aktive Fraktion erheblich angehoben, wenn entweder eine genetisch manipulierte, langsamere T7 Polymerase eingesetzt wurde oder die Inkubationstemperatur auf 20 °C erniedrigt wurde. Eine Abnahme der Proteinsynthese nach siebenstündiger Inkubation wurde nicht durch einen Mangel an Triphosphaten, sondern einen Mangel an Aminosäuren verursacht. Ein zweite Aminosäuregabe nach 7 Stunden bei 20°C führte zur Synthese von etwa 4 mg/ml bei praktisch voller GFP Aktivität. 2. Das RTS wurde zu einem System für umfassende Analyse der Proteinsynthese-Genauigkeit modifiziert. Es wurden unter anderen Edein und Pactamycin analysiert. Das Edein, aber nicht Pactamycin entpuppte sich als starker Induktor von Fehleinbau. Einen überraschenden Befund gab es bei NRI: Es verursacht hohe Fehlereinbau, jedoch nicht im Standard poly(U) System (Leu gegenüber Phe Einbau), was eine Grenze des poly(U) Systems aufzeigt. 3. Wir entwickelten unser Standard poly(U) System zu einem robusten Instrument und erzielten statistisch 100 bis 300 eingebaute Phe Reste per Ribosom. Es hat folgende Merkmale: (i) 4.5 mM Mg2+ erscheint optimal gemessen an Synthese- und Fehleinbaurate. (ii) Hoher Phe-Einbau erlaubt eine genaue Messung der Fehlerrate mit einer Auflösungsgrenze von 1:10.000 (ein Fehleinbau per 10.000 eingebauten Phe). Das System weist einen Fehlereinbau von 1:2.000 auf, was der in vivo Genauigkeit entspricht. (iii) Ein Fehleinbau bezüglich der „wobble“ Position des Codons (dritte Nukleotidposition) häufig, einen bezüglich des mittleren Nucleotids des A-Codons wird nicht beobachtet, auch wenn der Fehleinbau dramatisch von Streptomycin oder angehobener Mg2+ Konzentration verstärkt wird; wohl aber ein sehr geringer Fehleinbau bezüglich der ersten Position. 4. Kasugamycin: Der Hemmechanismus wurde aufgeklärt und zusammen mit kristallographischen Untersuchungen der Bindeort bestimmt: Das Antibiotikum hemmt die Bindung der P-tRNA nur in der 30S Untereinheit (jedoch nicht am 70S Ribosom), durch Störung der Codon-Anticodon Wechselwirkung nahe auf der Seite der E-Stelle. Unsere Daten erklären, warum die 70S Initiation von „leaderless“ mRNA nicht von Kasugamycin gestört wird. 5. Widersprechende Daten zu Aminoglycosid-Effekten auf die A-Stellen Besetzung wurden aufgelöst. Wir zeigten, dass unter artifiziellen Bedingungen Aminoglykoside eine Rück-Translokation auslösen (in Übereinstimmung mit jüngst publizierte Daten einer anderen Gruppe), aber auch dass dieser Effekt keinen Bedeutung für den Hemmechanismus hat und den bakteriziden Effekt dieser wichtigen Antibiotikagruppe erklären könnte

Role of Alternatively Spliced Messenger RNA (mRNA) Isoforms of the Insulin-Like Growth Factor 1 (IGF1) in Selected Human Tumors

Insulin-like growth factor 1 (IGF1) is a key regulator of tissue growth and development that is also implicated in the initiation and progression of various cancers. The human IGF1 gene contains six exons and five long introns, the transcription of which is controlled by two promoters (P1 and P2). Alternate promoter usage, as well as alternative splicing (AS) of IGF1, results in the expression of six various variants (isoforms) of mRNA, i.e., IA, IB, IC, IIA, IIB, and IIC. A mature 70-kDa IGF1 protein is coded only by exons 3 and 4, while exons 5 and 6 are alternatively spliced code for the three C-terminal E peptides: Ea (exon 6), Eb (exon 5), and Ec (fragments of exons 5 and 6). The most abundant of those transcripts is IGF1Ea, followed by IGF1Eb and IGF1Ec (also known as mechano-growth factor, MGF). The presence of different IGF1 transcripts suggests tissue-specific auto- and/or paracrine action, as well as separate regulation of both of these gene promoters. In physiology, the role of different IGF1 mRNA isoforms and pro-peptides is best recognized in skeletal muscle tissue. Their functions include the development and regeneration of muscles, as well as maintenance of proper muscle mass. In turn, in nervous tissue, a neuroprotective function of short peptides, produced as a result of IGF1 expression and characterized by significant blood-brain barrier penetrance, has been described and could be a potential therapeutic target. When it comes to the regulation of carcinogenesis, the potential biological role of different var iants of IGF1 mRNAs and pro-peptides is also intensively studied. This review highlights the role of IGF1 isoform expression (mRNAs, proteins) in physiology and different types of human tumors (e.g., breast cancer, cervical cancer, colorectal cancer, osteosarcoma, prostate and thyroid cancers), as well as mechanisms of IGF1 spliced variants involvement in tumor biology

Inhibitors of N-glycosylation as a potential tool for analysis of the mechanism of action and cellular localisation of glycoprotein P

Multidrug resistance has for many years attracted attention of numerous investigators. Attempts have also been made to increase efficiency of anti-neoplastic therapy. For this reason, most of efforts have been devoted to analysing proteins engaged in the mechanism of multidrug resistance such as the N-glycosylated membrane protein glycoprotein P. Interestingly, glycosylation probably plays a significant role in the intracellular location and activity of modified proteins. Inhibitors of glycosylation have been demonstrated to alter the activity of glycoprotein P in various ways, depending on the cell line examined. These inhibitors markedly reduce multidrug resistance of cancer cells, thus promoting success of anti-neoplastic therapy. Here, we review the basic knowledge on N-glycosylation inhibitors, their effect on glycoprotein P and their therapeutic potential

Vinca alkaloid drugs promote stress-induced translational repression and stress granule formation

Resistance to chemotherapy drugs is a serious therapeutic problem and its underlying molecular mechanisms are complex. Stress granules (SGs), cytoplasmic ribonucleoprotein complexes assembled in cells exposed to stress, are implicated in various aspects of cancer cell metabolism and survival. SGs promote the survival of stressed cells by reprogramming gene expression and inhibiting pro-apoptotic signaling cascades. We show that the vinca alkaloid (VA) class of anti-neoplastic agents potently activates a SG-mediated stress response program. VAs inhibit translation initiation by simultaneous activation of eIF4E-BP1 and phosphorylation of eIF2α, causing polysome disassembly and SG assembly. VA-induced SGs contain canonical SG components but lack specific signaling molecules. Blocking VA-induced SG assembly by inactivating eIF4EBP1 or inhibiting eIF2α phosphorylation decreases cancer cell viability and promotes apoptosis. Our data describe previously unappreciated effects of VAs on cellular RNA metabolism and illuminate the roles of SGs in cancer cell survival