Design and structural optimization of new molecules as potential antiinflammatory and/or anticancer agents.

2013 - 2014L’infiammazione ed il cancro sono due complessi meccanismi patologici in cui risultano coinvolti una serie di differenti mediatori molecolari. La profonda connessione tra cancro ed infiammazione è ben nota e la modulazione di questi processi rappresenta uno dei principali obiettivi della moderna chimica farmaceutica. L’identificazione di nuove entità molecolari capaci di interferire con target biologici coinvolti in questi due meccanismi è altamente auspicabile per lo sviluppo sia di nuovi potenziali farmaci sia di sonde molecolari utili per studiare aspetti biologici finora meno investigati. Tre principali target, coinvolti a vari livelli nell’infiammazione e nel cancro, sono stati investigati a fondo: le proteine contenenti bromodomain (BRD), l’enzima microsomiale prostaglandina E2 sintasi di tipo 1 (mPGES-1) e lo chaperone heat shock protein 90 (Hsp90). I risultati ottenuti possono essere riassunti in tre principali sezioni, in base al target di interesse: a) Scoperta di nuovi modulatori dei bromodomain umani attraverso approcci structure-based e metodiche computazionali. I BRD sono moduli proteici evolutivamente conservati che fungono da “readers” del codice istonico, riconoscendo residui di acetil-lisina (Kac) sulle code istoniche. Il coinvolgimento delle proteine contenenti BRD è recentemente emerso in molteplici patologie, specialmente in processi tumorali. Allo scopo di identificare un nuovo chemotipo in grado di mimare Kac, è stato intrapreso un approccio structure-based partendo da frammenti a nucleo 9H-purinico. Uno dei frammenti inizialmente identificati (2a), che era emerso come ligando dei BRD umani, è stato sistematicamente modificato impiegando approcci si sintesi organica in modo da ricavare un profilo di relazioni struttura attività da sfruttare nel successivo step di ottimizzazione strutturale. Questi studi hanno permesso di individuare ligandi con affinità nell’ordine del nanomolare per BRD9 (composti 7d e 11) e solo residua affinità micromolare per BRD4. Il legame di 7d e 11 al bromodomain di BRD9 è stato investigato mediante esperimenti di cristallografia e di docking flessibile che hanno evidenziato un esteso riarrangiamento dei residui aminoacidici che formano la tasca di riconoscimento di Kac, suggerendo un meccanismo di interazione di tipo “induced-fit”. Infine, i composti non hanno esibito alcun effetto citotossico in cellule HEK293T e hanno efficacemente spiazzato il bromodomain di BRD9 dalla cromatina in saggi BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer), influendo solo parzialmente sul complesso BRD4/istone. b) Identificazione ed ottimizzazione strutturale di inibitori dell’mPGES-1 a nucleo diidropirimidinico. L’mPGES-1 è un omotrimero di membrane coinvolto nella cascata dell’acido arachidonico, che funge da enzima terminale nella via biosintetica delle cicloosigenasi (COX) catalizzando la formazione della prostaglandina (PG)E2 dal precursore PGH2. L’inibizione dell’mPGES-1 può rappresentare un valido approccio terapeutico per modulare la formazione della PGE2 indotta da stimoli infiammatori, permettendo di evitare interferenze con i prostanoidi costitutivamente prodotti. Al fine di individuare una nuova piattaforma molecolare per la modulazione dell’mPGES-1, è stato seguito un approccio structure-based focalizzato su una collezione di molecole a nucleo 3,4-diidropirimidin-2(1H)-onico (DHPM), utilizzando la prima struttura cristallografica ad alta risoluzione dell’enzima in forma attiva (PDB: 4AL0). Le interazioni con la controparte recettoriale sono state introdotte come filtro qualitativo per la selezioni dei composti più promettenti da sintetizzare nella successiva fase di sintesi chimica. I risultati biologici ottenuti sono stati in accordo con i suggerimenti computazionali portando all’individuazione di due molecole (48 e 49) con una promettente attività inibitoria nei confronti dell’mPGES-1 da saggi in vitro. La più recente struttura cristallografica dell’mPGES-1 in complesso con l’inibitore noto LVJ (PDB: 4BPM) è stata utilizzata per ottimizzare il composto 48 (IC50 = 4.16 ± 0.47 μM), portando al composto 53, un inibitore con attività 10 volte maggiore rispetto al composto lead (IC50 = 0.41 ± 0.02 μM). Allo scopo di investigare ulteriormente questo complesso enzima, sono stati seguiti anche protocolli di espressione eterologa dell’mPGES-1 umano, seguiti da successivi studi di cristallizzazione bidimensionale. c) Il nucleo diidropirimidinico come nuovo chemotipo per la modulazione del sito C-terminale di Hsp90. Hsp90 è uno chaperone molecolare ampiamente coinvolto nello sviluppo, sopravvivenza e proliferazione di cellule tumorali. I più noti inibitori di Hsp90 si legano alla regione N-terminale della proteina. Tuttavia, questo tipo di modulazione è associato in ambito clinico a problemi di somministrazione e di tossicità dovuti all’induzione della risposta da stress nelle cellule tumorali, un meccanismo citoprotettivo indesiderato. Sebbene meno investigata, l’inibizione del sito C-terminale di Hsp90 rappresenta un approccio alternativo molto promettente per lo sviluppo di nuovi potenziali farmaci antitumorali, in quanto esso non risulta essere associato agli effetti negativi causati dalla risposta da stress. Nel tentativo di identificare modulatori della regione C-terminale di Hsp90 non ispirati a composti naturali, una collezione di derivati a nucleo diidropirimidinico (DHPM) è stata sintetizzata. Il razionale alla base di tale scelta deriva dell’analogia strutturale tra tale scaffold e l’uridina trifosfato, un nucleotide capace di legarsi selettivamente al C-terminale di Hsp90, ma non all’N-terminale. Saggi biologici hanno confermato che il nucleo diidropirimidinico può essere effettivamente considerato come un nuovo chemotipo per la modulazione della funzione chaperonica di Hsp90 attraverso l’interazione con la sua regione C-terminale. In particolare, il composto 54 è stato identificato come un nuovo promettente agente antiproliferativo capace di legarsi al C-terminale di Hsp90. [a cura dell'autore]XIII n.s

Le allergie alimentari nel cane e nel gatto

La presente tesi ha l’obiettivo di descrivere le allergie alimentari nel cane e nel gatto, partendo dagli aspetti epidemiologici, per poi passare alla presentazione e all’analisi dell’eziopatogenesi, delle manifestazioni cliniche, della diagnosi, della terapia ed infine degli aspetti prognostici, ciò attraverso una revisione della letteratura scientifica e degli studi fino ad oggi effettuati. Il lavoro di ricerca svolto ha messo in evidenza che le allergie alimentari sono patologie su base immunologica che si manifestano in cani e gatti di qualsiasi età e senza predilezione di sesso, anche se si sospetta l’esistenza di una predisposizione di razza sia nei cani che nei gatti. La reale prevalenza delle allergie alimentari è tutt’ora sconosciuta ed è molto variabile. I principali allergeni responsabili di allergia alimentare sono glicoproteine, contenute negli alimenti, che hanno un peso molecolare compreso tra 10 Kd e 60 Kd. I segni clinici più frequenti sono quelli cutanei, mentre più rari sono i segni gastroenterici, ed in particolare il segno clinico principale è un prurito a carattere non stagionale. Dagli studi emerge inoltre una stretta relazione tra la dermatite atopica canina e l’allergia alimentare, in quanto tali malattie si possono manifestare con segni clinici sovrapponibili, oppure l’allergia alimentare può essere causa scatenante della dermatite atopica. L’unico modo per diagnosticare l’allergia alimentare è l’esecuzione di una dieta ad eliminazione seguita da un test di provocazione con la vecchia dieta. La dieta migliore a scopo diagnostico è risultata essere quella casalinga poiché dotata di un più alto potere diagnostico e poiché meno frequentemente responsabile di reazioni allergiche rispetto alle diete commerciali. Per quanto riguarda la terapia, essa si basa sull’esclusione dalla dieta dell’alimento responsabile di allergia

Correction: Identification of the key structural elements of a dihydropyrimidinone core driving toward more potent Hsp90 C-terminal inhibitors

Correction for 'Identification of the key structural elements of a dihydropyrimidinone core driving toward more potent Hsp90 C-terminal inhibitors' by S. Teracciano et al., Chem. Commun., 2016, 52, 12857–12860