Estudio del déficit de frataxina en Drosophila

La ataxia de Friedreich (AF) es la ataxia hereditaria más común en la población de origen europeo, con una prevalencia de 2-4:100.000 (Palau y Espinós 2006). Se trata de una enfermedad neurodegenerativa que afecta principalmente al sistema nervioso central y periférico. Además de los síntomas neurológicos, los pacientes presentan cardiomiopatía hipertrófica, que constituye la causa frecuente de muerte prematura. También pueden presentar intolerancia a carbohidratos y diabetes mellitus en un 20% y 10% de los casos respectivamente. Actualmente no se dispone de cura ni de tratamiento efectivo para la enfermedad, pero diversas estrategias terapéuticas se encuentran en proceso de investigación y ensayo clínico. La AF está causada por la expansión del triplete GAA en el primer intrón del gen FXN que produce una reducción importante de los niveles de la frataxina (Campuzano et al. 1996), cuya función se ejerce fundamentalmente en la mitocondria (Koutnikova et al. 1997). No obstante, no hay consenso en cuanto a la función exacta de esta proteína pero parece que está implicada en la homeostasis del hierro, en concreto en la formación de los grupos Fe-S (revisado en Pastore y Puccio 2013). De hecho, la falta de frataxina produce un déficit en la actividad de los enzimas que requieren un centro ferrosulfurado para su función. Otras características de la patología molecular de la AF incluyen la acumulación de hierro intramitocondrial acompañado de déficit de hierro en el citoplasma, disfunción mitocondrial y daño oxidativo (Babcock et al. 1997; Rötig et al. 1997; Puccio et al. 2001; Li et al. 2008). La frataxina es una proteína altamente conservada en la evolución, con ortólogos en todos los eucariotas y gran parte de los procariotas (Gibson et al. 1996; Adinolfi et al. 2002). El mutante de frataxina en levadura es viable, pero la ausencia de esta proteína en organismos superiores es letal (Rötig et al. 1997). Se han obtenido distintos modelos de AF en ratón basados en estrategias de “knockout” condicional donde la falta de frataxina está limitada a ciertos tejidos como el neural o el cardiaco (Puccio et al. 2001), la inserción de una expansión del triplete GAA en el gen endógeno Fxn (Miranda et al. 2002), o mediante la transgénesis de alelos mutados del gen humano FXN (Pook et al. 2001). También se dispone de diversos modelos celulares, incluyendo los desarrollados a partir de células de pacientes como linfoblastos y fibroblastos (Rötig et al. 1997). El ortólogo de FXN en Drosophila, fh (frataxin homolog) codifica para una proteína de 190 amino ácidos que muestra una elevada similitud con el resto de ortólogos de frataxina (Cañizares et al. 2000). Actualmente hay dos modelos de AF en Drosophila que recapitulan las características patológicas y bioquímicas de la enfermedad. Estos modelos fueron obtenidos mediante el sistema de RNA de interferencia (RNAi) para el silenciamiento de fh, combinado con el sistema UAS-GAL4 que permite el control espacio temporal de su expresión. En el primero de ellos, la expresión ubicua del transgen fhRNAi-1 produce una reducción del 90% de los niveles de frataxina que causa letalidad en el estado pre-adulto (Anderson et al. 2005). El segundo de los modelos de AF en la mosca induce una reducción del 70% en los niveles de frataxina cuando se expresa ubicuamente la construcción fhRNAi-2. Estos mutantes funcionales de falta de frataxina presentan una disminución de supervivencia y de capacidad locomotora, que se agravan en condiciones de elevado estrés oxidativo (hiperoxia), y a nivel bioquímico, una reducción de la actividad aconitasa (Llorens et al. 2007). Objetivos El objetivo principal de esta tesis es continuar la caracterización del modelo de AF en Drosophila obtenido en nuestro laboratorio, para contribuir al estudio de la función de frataxina y de la fisiopatología de la enfermedad, así como para la búsqueda de marcadores biológicos y estrategias terapéuticas. Para ello, definimos los siguientes objetivos específicos en esta tesis: (1) demostrar la equivalencia funcional entre las frataxinas humana y de Drosophila; (2) evaluar la validez del modelo de AF en Drosophila para el rastreo de fármacos, mediante el análisis del efecto de los compuestos deferiprona e idebenona; (3) identificar modificadores de los fenotipos inducidos por la falta de frataxina por medio de un rastreo de genes candidatos y (4) determinar el efecto de la falta de frataxina en la homeostasis de los metales. Metodología y resultados 1. Equivalencia funcional de las frataxinas humana y de Drosophila (Navarro et al. 2011, figuras 4 y 5) Para demostrar la equivalencia funcional de ambas proteínas, en este trabajo se evaluó si la proteína humana podía reemplazar funcionalmente a la frataxina endógena en Drosophila. Para ello se generó un transgen que contiene la región codificante de FXN bajo el control de la secuencia UAS. Después se obtuvieron moscas que portaban esta construcción UAS-FXN y también la construcción de RNA de interferencia UAS-fhRNAi-1, expresadas de forma ubicua con actina-GAL4. La expresión de FXN en la mosca revirtió la reducción de la actividad aconitasa observada en las larvas actina-GAL4>UAS-fhRNAi-1 (Anderson et al. 2005), demostrando la equivalencia funcional de ambas proteínas. La sobrexpresión de la frataxina endógena en Drosophila produce una reducción en la actividad aconitasa junto con otros fenotipos patogénicos como reducción de la supervivencia o de la habilidad motora. De forma similar, la sobrexpresión de la frataxina humana reduce la actividad aconitasa de las larvas UAS-FXN. Se ha descrito que la frataxina de levadura puede formar oligomeros de distintos tamaños y que un aumento de la oligomerización sería la responsable de los déficits funcionales de las proteínas con centros Fe-S (Seguin et al. 2009). Por ello, consideramos la posibilidad de que la frataxina humana estuviera produciendo oligomeros o quizá formando algún tipo de agregados tóxicos que redujeran la cantidad de proteína funcional en Drosophila. Para comprobar esta hipótesis se realizó una cromatografía de filtración en gel. Mediante esta técnica se recuperó el total de la frataxina humana expresada en Drosophila en forma de monómero. La ausencia de oligomeros o agregados indica que el mecanismo de toxicidad de la sobrexpresión de frataxina es de otro tipo, posiblemente una saturación del sistema por exceso de proteína o quizá el secuestro de proteínas que interaccionen con frataxina. 2. La deferiprona y la idebenona rescatan fenotipos inducidos por la falta de frataxina en Drosophila (Soriano et al. 2013). Debido a la presencia de acúmulos de hierro en corazón, cerebro y otros tejidos de pacientes de AF (Bradley et al. 2000), se propuso la quelación de hierro como estrategia terapéutica para la enfermedad. El quelante de hierro deferiprona (DFP) produjo resultados prometedores en los primeros ensayos clínicos en pacientes en forma de reducción de la acumulación de hierro o mejoría de la ataxia (Boddaert et al. 2007; Kakhlon et al. 2008). Evaluamos el efecto de dos concentraciones de DFP (60 y 163 μM) administradas o bien en el estadio de larva o bien a los individuos adultos, sobre los fenotipos de nuestro modelo en Drosophila de AF. Cuando la DFP se administró de forma temprana, se observó una mejoría de la supervivencia y la habilidad motora de las moscas actina-GAL4>UAS-fhRNAi-2, siendo en general más efectiva la concentración más alta del compuesto. Dicha concentración de DFP también produjo la mejoría de la capacidad de escalada de los individuos neuralized-GAL4>UAS-fhRNAi-2, que presentan una reducción de los niveles de frataxina en el sistema nervioso periférico (Llorens et al. 2007). A continuación caracterizamos el efecto de la DFP sobre los niveles de hierro de las moscas modelo de AF. Encontramos que los niveles de hierro mitocondrial estaban aumentados en las moscas actina-GAL4>UAS-fhRNAi-2, mientras que la forma ferrosa del hierro en la fracción soluble se encontraba disminuida. Esto puede ser indicativo de la existencia de agregados de hierro insolubles. En cuanto al efecto de la DFP, el quelante produjo un aumento de los niveles de hierro férrico y ferroso solubles, lo que sugiere que evita la formación de la forma insoluble tóxica. El aumento de los niveles de estrés oxidativo se ha descrito en pacientes de AF y en diversos modelos de la enfermedad (Rötig et al. 1997). Esto llevó a proponer el uso de antioxidantes como terapia que contrarrestara dicho daño oxidativo. La idebenona (IDE) es un antioxidante análogo a la coenzima Q10 que se utilizó en ensayos clínicos para la AF, en los que se describió una estabilización neurológica en pacientes pediátricos (Meier et al. 2012). Evaluamos también el efecto de la IDE sobre el fenotipo de las moscas modelo de AF, utilizando la misma estrategia que para la DFP, siendo en este caso las concentraciones de 7 y 15 μM. Ambas concentraciones produjeron una mejora de la supervivencia y la capacidad de escalada tanto cuando el déficit de frataxina era ubicuo como cuando se restringió al sistema nervioso periférico. Como la actividad aconitasa es especialmente sensible al estrés oxidativo y se encuentra reducida en las moscas actina-GAL4>UAS-fhRNAi-2 en hiperoxia (Llorens et al. 2007), utilizamos este fenotipo para evaluar el efecto antioxidante de la IDE y observamos que dicho compuesto pudo recuperar la actividad aconitasa hasta los niveles del control. Estos resultados de rescate de los fenotipos de AF en el modelo de Drosophila constituyen una validación para su uso en futuros rastreos de moléculas terapéuticas. 3. Rastreo genético de modificadores de fenotipos inducidos por falta de frataxina en Drosophila Una de las ventajas del uso de Drosophila como organismo modelo es la posibilidad de realizar rastreos genéticos a gran escala. Por este motivo, llevamos a cabo un rastreo de genes modificadores en nuestro modelo de AF en Drosophila. Seleccionamos 209 genes candidatos que incluían (1) rutas implicadas en la patogénesis de la enfermedad como la homeostasis de los metales, el estrés oxidativo y la autofagia; (2) proteínas que se encontraron diferencialmente expresadas en las moscas con déficit de frataxina en un estudio de proteómica realizado en el laboratorio y (3) modificadores obtenidos mediante rastreos genéticos en modelos en Drosophila de otras enfermedades neurodegenerativas. La línea fhRNAi-2 / fhRNAi-2 ; actin-GAL4 / TM6B , tub-GAL80 se cruzó con una serie de líneas disponibles comercialmente con mutaciones funcionales por RNAi (Vienna Drosophila Resource Center), falta de función y sobrexpresión (Bloomington Stock Center, Indiana University) de los genes elegidos. Los descendientes de estos cruces, de genotipo adecuado, fueron evaluados respecto a su capacidad de escalada en búsqueda de alelos modificadores que mejoraran o empeoraran dicho fenotipo. Entre los modificadores identificados se encontraron diversos genes que participan en la ruta de TOR (Target of Rapamycin) y en la homeostasis de metales y por tanto, seleccionamos estas dos rutas para un estudio más detallado de su participación en la patogénesis de la AF. 3.1. La ruta de TOR interacciona genéticamente con frataxina (Calap-Quintana et al. 2015, figura 1) La ruta de TORC1 (Target of Rapamycin Complex 1) sirve como reguladora central del metabolismo celular, crecimiento, proliferación y supervivencia e integra señales intracelulares y extracelulares sobre la disponibilidad de nutrientes. La mayoría de estas señales se integran mediante el complejo TSC1/TSC2 (Tuberous Sclerosis Complex 1/2) que inhibe a Rheb (Rhas homolog enriched in brain ortholog) y este a su vez activa a TORC1. La síntesis proteica es promovida por la activación del factor de transcripción eIF-4E (eukaryotic translation initiation factor 4E) y de la kinasa S6K por medio de TORC1. Entre los modificadores del rastreo genético llevado a cabo en el modelo de AF en Drosophila, cuatro pertenecían a la ruta de TORC1: Tsc1, S6K, eIF-4E y Lrrk (Leucine-rich repeat kinase), activador de eIF-4E. En conjunto, se observó que la inhibición de la ruta de TORC1 producía una mejora del fenotipo motor del modelo de AF en mosca, señalando la implicación de esta ruta en la patogénesis de la enfermedad. Además, estos resultados sugieren una posible estrategia terapéutica para la AF mediante la inhibición de la ruta de TORC1, por ejemplo con compuestos como la rapamicina. 3.2. Rutas implicadas en la homeóstasis de los metales interaccionan genéticamente con frataxina (Soriano et al., enviado para su publicación). Debido a la participación del hierro en la fisiopatología de la AF, se incluyeron genes implicados en la homeostasis de los metales en la lista de candidatos para el rastreo genético. En este trabajo, para aumentar la confianza de los modificadores identificados, se incluyó un segundo fenotipo además de la capacidad de escalada. En concreto, se evaluó la mejoría o empeoramiento del defecto observado en el ojo de las moscas GMR-GAL4>UAS-fhRNAi-1. En concreto, en estos individuos la falta de frataxina se ha dirigido al ojo en desarrollo lo que produce un fenotipo de ojo “rugoso” que se puede observar externamente. Mediante esta estrategia se identificaron genes modificadores que participan en la homeostasis del hierro, transportadores de cobre y zinc así como en la detoxificación producida por metales. Al reducir la expresión de las proteínas reguladoras de hierro Irp-1A e Irp-1B y de los transportadores de hierro regulados por ellas, transferrinas 1 y 2 y malvolio, mejoraron los fenotipos de ojo y de capacidad de escalada. También mejoraron ambos fenotipos al reducir los niveles de seis transportadores de zinc así como de la chaperona de cobre (Atox1) y del transportador de cobre (dCutC). La sobrexpresión de MTF-1, un factor de transcripción que regula la detoxificación de los metales, también rescataba los fenotipos de ojo y escalada. Sin embargo las metalotioneínas, que son activadas por MTF-1 actuaron como supresores cuando se reducía su expresión. Al haberse identificado genes modificadores de los fenotipos inducidos por falta de frataxina implicados en el transporte y la regulación de la homeóstasis de los metales, se procedió a estudiar esta ruta más en detalle. 4. Acumulación de metales en el modelo de AF en Drosophila (Soriano et al., enviado para su publicación). En muestras procedentes de pacientes de AF, se caracterizó una redistribución del hierro, cobre y zinc que no iba acompañada de un aumento de los niveles totales de estos metales. Sin embargo en el modelo de AF en Drosophila sí que observamos la acumulación de hierro, zinc, cobre y manganeso. Además, el quelante de zinc TPEN así como los quelantes de cobre TTM y BSC mejoraron la capacidad de escalada de las moscas actina-GAL4>UAS-fhRNAi-2. Para estudiar el mecanismo por el cual los modificadores identificados en el rastreo genético producían la supresión de los fenotipos de las moscas con deficiencia de frataxina, estudiamos su efecto en la acumulación de hierro. Observamos que esta se reducía en el caso de malvolio, las transferrinas e Irp1 pero también para dos de los transportadores de zinc, ZnT41F y fear of intimacy (foi) y para la sobrexpresión de MTF-1. Aunque las metalotioneinas se suelen asociar a la detoxificación de los metales y del daño oxidativo que producen éstos, también se las ha asociado con un efecto prooxidante (Suzuki et al. 1996). Los niveles de estrés oxidativo se encuentran incrementados en las moscas modelo de la AF. La reducción genética de la metalotioneína MtnA, al igual que la sobrexpresión de MTF-1,además de mejorar la capacidad de escalada, rescataron los niveles de estrés oxidativo. Este resultado apoya la hipótesis del efecto prooxidante de las metalotioneínas. Y en conjunto, hemos identificado que la homeostasis de los metales está implicada en la patogénesis de la AF, y que la quelación del zinc y el cobre tiene potencial terapéutico para la enfermedad. Conclusiones 1. La expresión del gen humano FXN rescata el déficit de actividad aconitasa producido por la falta de la frataxina endógena en Drosophila, indicando la equivalencia funcional de ambas proteínas. 2. El quelante de hierro deferiprona mejora los fenotipos inducidos por la falta de frataxina (supervivencia y habilidad motora) en el modelo de AF en Drosophila por medio de la quelación de la acumulación de hierro mitocondrial. 3. El antioxidante idebenona mejora los fenotipos inducidos por la falta de frataxina en el modelo de AF en Drosophila y rescata la reducción de la actividad aconitasa en hiperoxia. 4. Los niveles de zinc, cobre, manganeso y aluminio se encuentran aumentados en el modelo de AF en Drosophila y la quelación de zinc y cobre mejoran el fenotipo motor inducido por la falta de frataxina. 5. La reducción en la expresión de genes implicados en el transporte del hierro, cobre y zinc y la sobrexpresión del factor de transcripción MTF-1 mejoran los fenotipos (desarrollo del ojo externo y habilidad motora) del modelo de AF en Drosophila. 6. Los miembros de la ruta de TORC1 TSC1, S6K, Lrrk y eIF-4E interaccionan genéticamente con frataxina de tal forma que la inhibición genética de dicha ruta suprime el déficit en la capacidad de escalada que muestran las moscas modelo de AF. Bibliografía Adinolfi S, Trifuoggi M, Politou AS, Martin S, Pastore A. 2002. A structural approach to understanding the iron-binding properties of phylogenetically different frataxins. Hum. Mol. Genet. 11:1865–1877. Anderson PR, Kirby K, Hilliker AJ, Phillips JP. 2005. RNAi-mediated suppression of the mitochondrial iron chaperone, frataxin, in Drosophila. Hum. Mol. Genet. 14:3397–3405. Babcock M, de Silva D, Oaks R, Davis-Kaplan S, Jiralerspong S, Montermini L, Pandolfo M, Kaplan J. 1997. Regulation of mitochondrial iron accumulation by Yfh1p, a putative homolog of frataxin. Science 276:1709–1712. Boddaert N, Le Quan Sang KH, Rötig A, Leroy-Willig A, Gallet S, Brunelle F, Sidi D, Thalabard J-C, Munnich A, Cabantchik ZI. 2007. Selective iron chelation in Friedreich ataxia: biologic and clinical implications. Blood 110:401–408. Bradley JL, Blake JC, Chamberlain S, Thomas PK, Cooper JM, Schapira AH. 2000. Clinical, biochemical and molecular genetic correlations in Friedreich’s ataxia. Hum. Mol. Genet. 9:275–282. Calap-Quintana P, Soriano S, Llorens JV, Al-Ramahi I, Botas J, Moltó MD, Martínez-Sebastián MJ. 2015. TORC1 Inhibition by Rapamycin Promotes Antioxidant Defences in a Drosophila Model of Friedreich’s Ataxia. PloS One 10:e0132376. Campuzano V, Montermini L, Moltò MD, Pianese L, Cossée M, Cavalcanti F, Monros E, Rodius F, Duclos F, Monticelli A, et al. 1996. Friedreich’s ataxia: autosomal recessive disease caused by an intronic GAA triplet repeat expansion. Science 271:1423–1427. Cañizares J, Blanca JM, Navarro JA, Monrós E, Palau F, Moltó MD. 2000. dfh is a Drosophila homolog of the Friedreich’s ataxia disease gene. Gene 256:35–42. Gibson TJ, Koonin EV, Musco G, Pastore A, Bork P. 1996. Friedreich’s ataxia protein: phylogenetic evidence for mitochondrial dysfunction. Trends Neurosci. 19:465–468. Kakhlon O, Manning H, Breuer W, Melamed-Book N, Lu C, Cortopassi G, Munnich A, Cabantchik ZI. 2008. Cell functions impaired by frataxin deficiency are restored by drug-mediated iron relocation. Blood 112:5219–5227. Koutnikova H, Campuzano V, Foury F, Dollé P, Cazzalini O, Koenig M. 1997. Studies of human, mouse and yeast homologues indicate a mitochondrial function for frataxin. Nat. Genet. 16:345–351. Li K, Besse EK, Ha D, Kovtunovych G, Rouault TA. 2008. Iron-dependent regulation of frataxin expression: implications for treatment of Friedreich ataxia. Hum. Mol. Genet. 17:2265–2273. Llorens JV, Navarro JA, Martínez-Sebastián MJ, Baylies MK, Schneuwly S, Botella JA, Moltó MD. 2007. Causative role of oxidative stress in a Drosophila model of Friedreich ataxia. FASEB J. Off. Publ. Fed. Am. Soc. Exp. Biol. 21:333–344. Meier T, Perlman SL, Rummey C, Coppard NJ, Lynch DR. 2012. Assessment of neurological efficacy of idebenone in pediatric patients with Friedreich’s ataxia: data from a 6-month controlled study followed by a 12-month open-label extension study. J. Neurol. 259:284–291. Miranda CJ, Santos MM, Ohshima K, Smith J, Li L, Bunting M, Cossée M, Koenig M, Sequeiros J, Kaplan J, et al. 2002. Frataxin knockin mouse. FEBS Lett. 512:291–297. Navarro JA, Llorens JV, Soriano S, Botella JA, Schneuwly S, Martínez-Sebastián MJ, Moltó MD. 2011. Overexpression of human and fly frataxins in Drosophila provokes deleterious effects at biochemical, physiological and developmental levels. PloS One 6:e21017. Palau F, Espinós C. 2006. Autosomal recessive cerebellar ataxias. Orphanet J. Rare Dis. 1:47. Pastore A, Puccio H. 2013. Frataxin: a protein in search for a function. J. Neurochem. 126 Suppl 1:43–52. Pook MA, Al-Mahdawi S, Carroll CJ, Cossée M, Puccio H, Lawrence L, Clark P, Lowrie MB, Bradley JL, Cooper JM, et al. 2001. Rescue of the Friedreich’s ataxia knockout mouse by human YAC transgenesis. Neurogenetics 3:185–193. Puccio H, Simon D, Cossée M, Criqui-Filipe P, Tiziano F, Melki J, Hindelang C, Matyas R, Rustin P, Koenig M. 2001. Mouse models for Friedreich ataxia exhibit cardiomyopathy, sensory nerve defect and Fe-S enzyme deficiency followed by intramitochondrial iron deposits. Nat. Genet. 27:181–186. Rötig A, de Lonlay P, Chretien D, Foury F, Koenig M, Sidi D, Munnich A, Rustin P. 1997. Aconitase and mitochondrial iron-sulphur protein deficiency in Friedreich ataxia. Nat. Genet. 17:215–217. Seguin A, Bayot A, Dancis A, Rogowska-Wrzesinska A, Auchère F, Camadro J-M, Bulteau A-L

Gypsy endogenous retrovirus maintains potential infectivity in several species of Drosophilids

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>Sequences homologous to the <it>gypsy </it>retroelement from <it>Drosophila melanogaster </it>are widely distributed among drosophilids. The structure of <it>gypsy </it>includes an open reading frame resembling the retroviral gene <it>env</it>, which is responsible for the infectious properties of retroviruses.</p> <p>Results</p> <p>In this study we report molecular and phylogeny analysis of the complete <it>env </it>gene from ten species of the <it>obscura </it>group of the genus <it>Drosophila </it>and one species from the genus <it>Scaptomyza</it>.</p> <p>Conclusion</p> <p>The results indicate that in most cases <it>env </it>sequences could produce a functional Env protein and therefore maintain the infectious capability of <it>gypsy </it>in these species.</p

Overexpression of Human and Fly Frataxins in Drosophila Provokes Deleterious Effects at Biochemical, Physiological and Developmental Levels

10 pages, 5 figures. 21779322[PubMed] PMCID: PMC3136927BACKGROUND: Friedreich's ataxia (FA), the most frequent form of inherited ataxias in the Caucasian population, is caused by a reduced expression of frataxin, a highly conserved protein. Model organisms have contributed greatly in the efforts to decipher the function of frataxin; however, the precise function of this protein remains elusive. Overexpression studies are a useful approach to investigate the mechanistic actions of frataxin; however, the existing literature reports contradictory results. To further investigate the effect of frataxin overexpression, we analyzed the consequences of overexpressing human (FXN) and fly (FH) frataxins in Drosophila. METHODOLOGY/PRINCIPAL FINDINGS: We obtained transgenic flies that overexpressed human or fly frataxins in a general pattern and in different tissues using the UAS-GAL4 system. For both frataxins, we observed deleterious effects at the biochemical, histological and behavioral levels. Oxidative stress is a relevant factor in the frataxin overexpression phenotypes. Systemic frataxin overexpression reduces Drosophila viability and impairs the normal embryonic development of muscle and the peripheral nervous system. A reduction in the level of aconitase activity and a decrease in the level of NDUF3 were also observed in the transgenic flies that overexpressed frataxin. Frataxin overexpression in the nervous system reduces life span, impairs locomotor ability and causes brain degeneration. Frataxin aggregation and a misfolding of this protein have been shown not to be the mechanism that is responsible for the phenotypes that have been observed. Nevertheless, the expression of human frataxin rescues the aconitase activity in the fh knockdown mutant. CONCLUSION/SIGNIFICANCE: Our results provide in vivo evidence of a functional equivalence for human and fly frataxins and indicate that the control of frataxin expression is important for treatments that aim to increase frataxin levels.This work was supported by grants from Fondo Investigaciones Sanitarias (ISCIII06- PI0677) and La Fundació la Marató TV3 (exp 101932) of Spain. JVL is supported by the European Friedreich's Ataxia Consortium for Translational Studies. SS is a recipient of a fellowship from Ministerio de Ciencia e Innovación of Spain.Peer reviewe

Fecal Microbiota Transplantation Derived from Alzheimer&rsquo;s Disease Mice Worsens Brain Trauma Outcomes in Wild-Type Controls

Traumatic brain injury (TBI) causes neuroinflammation and neurodegeneration, both of which increase the risk and accelerate the progression of Alzheimer&rsquo;s disease (AD). The gut microbiome is an essential modulator of the immune system, impacting the brain. AD has been related with reduced diversity and alterations in the community composition of the gut microbiota. This study aimed to determine whether the gut microbiota from AD mice exacerbates neurological deficits after TBI in control mice. We prepared fecal microbiota transplants from 18 to 24 month old 3&times;Tg-AD (FMT-AD) and from healthy control (FMT-young) mice. FMTs were administered orally to young control C57BL/6 (wild-type, WT) mice after they underwent controlled cortical impact (CCI) injury, as a model of TBI. Then, we characterized the microbiota composition of the fecal samples by full-length 16S rRNA gene sequencing analysis. We collected the blood, brain, and gut tissues for protein and immunohistochemical analysis. Our results showed that FMT-AD administration stimulates a higher relative abundance of the genus Muribaculum and a decrease in Lactobacillus johnsonii compared to FMT-young in WT mice. Furthermore, WT mice exhibited larger lesion, increased activated microglia/macrophages, and reduced motor recovery after FMT-AD compared to FMT-young one day after TBI. In summary, we observed gut microbiota from AD mice to have a detrimental effect and aggravate the neuroinflammatory response and neurological outcomes after TBI in young WT mice

Metal homeostasis regulators suppress FRDA phenotypes in a drosophila model of the disease

Friedreich's ataxia (FRDA), the most commonly inherited ataxia in populations of European origin, is a neurodegenerative disorder caused by a decrease in frataxin levels. One of the hallmarks of the disease is the accumulation of iron in several tissues including the brain, and frataxin has been proposed to play a key role in iron homeostasis. We found that the levels of zinc, copper, manganese and aluminum were also increased in a Drosophila model of FRDA, and that copper and zinc chelation improve their impaired motor performance. By means of a candidate genetic screen, we identified that genes implicated in iron, zinc and copper transport and metal detoxification can restore frataxin deficiency-induced phenotypes. Taken together, these results demonstrate that the metal dysregulation in FRDA includes other metals besides iron, therefore providing a new set of potential therapeutic targets.This work was supported by grants from the European Community’s Seventh Framework Program FP7/2007-2013 [grant agreement no. 242193 EFACTS], the Fundació la Marató TV3 of Spain [exp 101932] and the Prometeo Program from Generalitat Valenciana [PROMETEOII/2014/067]. Work in the Botas laboratory was supported by the R01-NS42179 NIH grant. S.S. was a recipient of a fellowship from Ministerio de Ciencia e Innovación of Spain; P.C.-Q. is a recipient of a fellowship from Generalitat Valenciana of Spain, J.V.L. was supported by a research contract from the European Community’s Seventh Framework Program FP7/2007-2013 [grant agreement no. 242193 EFACTS] and L.G. is the beneficiary of a postdoctoral grant from the AXA Research Fund.Peer reviewe

Metal Homeostasis Regulators Suppress FRDA Phenotypes in a Drosophila Model of the Disease

Friedreich's ataxia (FRDA), the most commonly inherited ataxia in populations of European origin, is a neurodegenerative disorder caused by a decrease in frataxin levels. One of the hallmarks of the disease is the accumulation of iron in several tissues including the brain, and frataxin has been proposed to play a key role in iron homeostasis. We found that the levels of zinc, copper, manganese and aluminum were also increased in a Drosophila model of FRDA, and that copper and zinc chelation improve their impaired motor performance. By means of a candidate genetic screen, we identified that genes implicated in iron, zinc and copper transport and metal detoxification can restore frataxin deficiency-induced phenotypes. Taken together, these results demonstrate that the metal dysregulation in FRDA includes other metals besides iron, therefore providing a new set of potential therapeutic targets

Deferiprone and idebenone rescue frataxin depletion phenotypes in a Drosophila model of Friedreich's ataxia

Friedreich's ataxia (FRDA), the most common inherited ataxia, is a neurodegenerative disease caused by a reduction in the levels of the mitochondrial protein frataxin, the function of which remains a controversial matter. Several therapeutic approaches are being developed to increase frataxin expression and reduce the intramitochondrial iron aggregates and oxidative damage found in this disease. In this study, we tested separately the response of a Drosophila RNAi model of FRDA ( Llorens et al., 2007) to treatment with the iron chelator deferiprone (DFP) and the antioxidant idebenone (IDE), which are both in clinical trials. The FRDA flies have a shortened life span and impaired motor coordination, and these phenotypes are more pronounced in oxidative stress conditions. In addition, under hyperoxia, the activity of the mitochondrial enzyme aconitase is strongly reduced in the FRDA flies. This study reports that DFP and IDE improve the life span and motor ability of frataxin-depleted flies. We show that DFP eliminates the excess of labile iron in the mitochondria and thus prevents the toxicity induced by iron accumulation. IDE treatment rescues aconitase activity in hyperoxic conditions. These results validate the use of our Drosophila model of FRDA to screen for therapeutic molecules to treat this disease.This work was supported by a grant from La Fundació la Marató TV3 [exp 101932] of Spain. S.S. is a recipient of a fellowship from Ministerio de Ciencia e Innovación of Spain; J.V.L. is supported by the European Friedreich's Ataxia Consortium for Translational Studies; L.B-S. was a recipient of the fellowship “Cinc Segles-Empresa” from Valencia University, Spain; P.C-Q. is supported by a grant from La Fundació la Marató TV3 of Spain and L.G. holds a Sara Borrell contract from the Spanish ISCIII-MSPS [CD09/00030].Peer Reviewe

Rapamycin increases ATP levels both in control and <i>fh</i>RNAi flies.

<p>Rapamycin is able to increase ATP levels in control and <i>fh</i>RNAi flies even with the addition of the autophagy inhibitor 3-MA or in flies carrying a constitutively active allele of S6K (<i>S6k</i>^<i>CA</i>). In flies carrying a 4E-BP loss of function allele (<i>4E-BP</i>^<i>LOF</i>), rapamycin cannot increase ATP levels. Control (<i>y</i>^<i>1</i><i>w*</i>; <i>actin-Gal4</i> flies), <i>fh</i>RNAi (<i>UAS-fh</i>RNAi; <i>actin-Gal4</i> flies), control/<i>S6k</i>^<i>CA</i> (control flies carrying the <i>S6k</i>^<i>CA</i> allele), control/ <i>4E-BP</i>^<i>LOF</i> (control flies carrying the <i>4E-BP</i>^<i>LOF</i> allele), <i>fh</i>RNAi <i>/S6k</i>^<i>CA</i> (model flies carrying the <i>S6k</i>^<i>CA</i> allele), <i>fh</i>RNAi/<i>4E-BP</i>^<i>LOF</i> (model flies carrying the <i>4E-BP</i>^<i>LOF</i> allele). ns: non-significant, *<i>P</i><0.05, **<i>P</i><0.01, ***<i>P</i><0.001. Error bars represent SEM.</p

Genetic reduction of TORC1 signalling improves the motor performance of frataxin knockdown flies.

<p>(A) Gene modifiers of frataxin knockdown identified in <i>Drosophila</i> and their position within the TORC1 signalling pathway. (B-D) Improvement of motor performance of <i>fh</i>RNAi flies by the effect of a dominant negative allele of <i>S6k</i> (B), a loss of function allele of <i>eIF</i>-<i>4E</i> (C) and a shRNA against <i>Lrrk</i> (D). Motor performance is expressed as the percentage of flies that climbed to a height of 11.5 cm. Control (<i>w¹¹¹⁸</i>; <i>actin</i>-<i>Gal4</i> flies), <i>fh</i>RNAi (<i>UAS</i>-<i>fh</i>RNAi; <i>actin</i>-<i>Gal4</i> flies), <i>fh</i>RNAi/Modifier (<i>fh</i>RNAi flies carrying the corresponding allele of the modifier). Asterisks represent the statistical significance between the <i>fh</i>RNAi and <i>fh</i>RNAi/Modifier flies for every day. *<i>P<</i>0.05, **<i>P<</i>0.01, ***<i>P<</i>0.001. Error bars represent SEM.</p