Isolamento e Caracterização Bioquímica e Estrutural de Fosfolipases A2 Ácidas do Veneno da Serpente Bothrops brazili

Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação: Mestrado em Biologia Experimental (PGBIOEXP) da Fundação Universidade Federal de Rondônia (UNIR) como requisito final para a obtenção do título de Mestre em Biologia Experimental. Orientador: Prof. Dr. Andreimar Martins Soares.A serpente Bothrops brazili está distribuída por toda a região amazônica e seu veneno, como nas demais serpentes deste gênero, é rico em proteínas e peptídeos bioativos. As fosfolipases A2 (PLA2s, EC 3.1.1.4) são importantes enzimas presentes no veneno de serpentes e estão relacionadas a um amplo espectro de efeitos farmacológicos tais como inflamação aguda, miotoxicidade e nocicepção. O presente trabalho teve como objetivo efetuar o isolamento e a caracterização bioquímica e estrutural de duas novas PLA2s ácidas do veneno de B. brazili, denominadas de Braziliase-I e Braziliase-II. Para tanto, o veneno foi fracionado em três etapas cromatográficas que se mostraram eficientes na purificação: troca iônica, interação hidrofóbica e fase reversa. A homogeneidade e pureza das proteínas foram avaliadas por SDS-PAGE, onde se observou a presença de uma única banda de aproximadamente 14 kDa. As massas moleculares foram determinadas por espectrometria com valores de 13.894,38 Da para Braziliase-I e 13.869,63 Da para Braziliase-II. As estruturas primárias das duas PLA2s foram determinadas, podendo-se verificar que se tratam de PLA2s da classe Asp49, sendo observada uma elevada identidade com PLA2s ácidas isoladas do veneno de outras serpentes. A atividade enzimática foi avaliada utilizando-se o substrato fluorescente NBD-PC e demonstrou que ambas possuem maior atividade entre pHs de 6,8 a 11 e que perdem atividade na temperatura de 80ºC e na presença de EDTA. A modelagem molecular das Braziliase-I e II foi feita utilizando-se a PLA2 CB (3R0L) de Crotalus durissus terrificus como modelo. A dinâmica molecular realizada mostrou elevada qualidade no modelo gerado e também fez melhorias em ambos os modelos. Dos resíduos encontrados em regiões desfavoráveis (gráfico de Ramachandran), os mesmos estavam localizados em regiões de elevada flexibilidade. O modelo final foi capaz de adquirir a conformação típica de uma PLA2 de veneno de serpente. A atividade edematogênica foi realizada em modelo murino com ambas as PLA2s (Braziliase-I e Braziliase-II) que mostraram ser capazes de promover edema, induzindo um aumento de 27,6% e 22,8% nos primeiros 30 minutos e regredindo logo após. A atividade miotóxica foi avaliada para Braziliase-I e II que demonstraram não serem miotoxinas. Por meio de ensaio de agregação plaquetária detectou-se que ambas as PLA2s isoladas indicaram apresentar atividade antiplaquetária sobre a agregação induzida por ADP e a Braziliase-II sobre a agregação induzida por colágeno também. Por fim, o isolamento e a caracterização das PLA2s constituem etapas fundamentais para o estudo da função dessas proteínas na fisiopatologia do envenenamento e na viabilidade destas enzimas como alvos potenciais para pesquisa de novos fármacos de ação antibacteriana, antiplasmodial, antifúngica, antiplaquetária, antitumoral entre outras

Micropropagação, propagação por sementes e banco de germoplasma de Mandevilla velutina (Mart.) Woodson

Mandevilla velutina (Mart.) Woodson (Apocynaceae) é uma planta medicinal de espécie nativa de regiões do Cerrado brasileiro com propriedades anti-ofídicas. Devido a alta exploração e devastação deste bioma, M. velutina está em perigo de extinção. Como uma iniciativa para a conservação desta espécie ameaçada e economicamente importante, um protocolo de micropropagação foi desenvolvido e genótipos foram colocados no Banco de Germoplasma "Cerrado In vitro". Para a propagação in vitro de M. velutina, segmentos nodais foram inoculados no meio Murashige and Skoog (MS) suplementado com diferentes concentrações de BA, zeatina, 2ip, DTT e TDZ. A melhor resposta de multiplicação foi obtida em meio suplementado com 0.44 µM BA na razão 1: 6.7. Plântulas cultivadas em MS/2 suplementado com 26.85 µM NAA enraizaram com sucesso (50.5%). Quando plântulas enraizadas e não enraizadas foram aclimatizadas em condições de solo, grande perda foi observada entre plântulas não enraizadas, enquanto as enraizadas tiveram 100% de sobrevivência. Foi possível a manutenção de 43% de M. velutina em condições saudáveis por seis meses, sem subculturas usando meio MS suplementado com 2% de sacarose, 13.8 mM de espermidina, 2% de sorbitol e 2% de dextrose.Mandevilla velutina (Mart.) Woodson (Apocynaceae) is a medicinal plant species with antivenom properties, native from Brazilian Savanna regions (Cerrado), which due to overexploitation and habitat deforestation is in danger of extinction. As an initiative for conserving this endangered but economically important plant species, a micropropagation protocol was developed and genotypes were stored in the Germplasm Bank "Cerrado In vitro". For the in vitro propagation of M. velutina, nodal segments were inoculated on Murashige and Skoog (MS) medium supplemented with different concentrations of BA, Zeatin, 2ip, DTT and TDZ. Best multiplication ratio was achieved when to the medium 0.44 µM BA, ranging 1: 6.7, were added. Plantlets cultured on MS/2 medium supplemented with 26.85 µM NAA rooted successfully (50.5%). Although rooted and un-rooted plantlets acclimatized to soil conditions, great losses were observed within un-rooted plantlets, while the rooted presented 100 % survival. It was possible to maintain 43% of the M. velutina germplasm under healthy conditions for six months, with no subcultures, using the MS medium supplemented with 2% sucrose, 13.8 mM spermidine, 2% sorbitol and 2% dextrose

Inibidores de quimotripsina do veneno de Bothrops atrox (Serpentes: Viperidae): Caracterização, atividade antimicrobiana e anti-Trypanosoma cruzi

Dissertação apresentada a Universidade Federal de Rondônia, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Biologia Experimental para obtenção do título de Mestre.Orientador: Dr. Andreimar Martins SoaresOs venenos de serpentes são compostos por uma complexa mistura de toxinas e outras substâncias bioativas abrangendo um amplo espectro de atividades biológicas e farmacológicas. Cerca de 90% do peso seco desses venenos é constituído de proteínas e peptídeos, englobando uma grande variedade de enzimas como proteases (metalo e serino), fosfolipases A2, L-aminoácido oxidases, esterases e inibidores de serinoproteases. Os inibidores de serinoproteases do tipo quimotripsina presentes no veneno de serpentes têm demonstrado potencial aplicação na regulação de enzimas proteolíticas e por atuar como possíveis agentes antimicrobianos. O principal objetivo deste trabalho é identificar inibidores de quimotripsina presentes no veneno da serpente Bothrops atrox, com ação antimicrobiana e anti-Trypanosoma cruzi. Inicialmente, 10 mg do veneno de B. atrox foram solubilizados e aquecidos em uma solução ácida a 80ºC por 30 min, e o sobrenadante aplicado na coluna C18 acoplada ao sistema HPLC, obtendo-se a eluição de cinco frações. Estas frações foram desidratadas e testadas em ensaios de inibição da quimotripsina, sendo que todas inibiram a ação desta enzima. As cinco frações foram analisadas por espectrometria MALDI-TOF MS onde observou-se a presença de peptídeos e proteínas entre as faixas de 733,63 a 48.443,3 Da, constatando-se que todas as frações apresentam proteínas com massa molecular semelhante a inibidores de serinoprotease do tipo quimotripsina. Na fração 1 foram detectadas um grupo de proteínas na faixa de 7.000 Da e outra de 9.107,70 Da com atividade inibitória de crescimento de Staphylococcus aureus e formas epimastigotas de Trypanosoma cruzi. A fração 2 apresentou proteínas na faixa de 13 a 14 kDa, que demonstrou a maior atividade contra o crescimento de S. aureus e T. cruzi, comparada as demais frações. Na fração 3, também foi observado a presença de duas proteínas: 8.528,68 e 23.555,52 Da, com atividade inibitória de S. aureus e T. cruzi. E a recromatografia da fração 3 apresentou por espectrometria de massa uma molécula com a massa de 8.527,88 Da e inibição de quimotripsina de 78%. As demais frações demonstraram uma maior variedade de peptídeos e proteínas, necessitando de etapas adicionais de purificação para o isolamento dos inibidores de quimotripsina. Neste estudo, relatou-se a primeira descrição de inibidores de quimotripsina presentes no veneno da serpente B. atrox com ação antimicrobiana contra S. aureus e anti-Trypanosoma cruzi, e estes achados abrem expectativas de utilização destes inibidores como agentes potencialmente terapêuticos

Plant-antivenom: Database of anti-venom medicinal plants

Plant-antivenom is a computational Websystem about medicinal plants with anti-venom properties. The system consists of a database of these plants, including scientific publications on this subject and amino acid sequences of active principles from venomous animals. The system relates these data allowing their integration through different search applications. For the development of the system, the first surveys were conducted in scientific literature, allowing the creation of a publication database in a library for reading and user interaction. Then, classes of categories were created, allowing the use of tags and the organization of content. This database on medicinal plants has information such as family, species, isolated compounds, activity, inhibited animal venoms, among others. Provision is made for submission of new information by registered users, by the use of wiki tools. Content submitted is released in accordance to permission rules defined by the system. The database on biological venom protein amino acid sequences was structured from the essential information from National Center for Biotechnology Information (NCBI). Plant-antivenom's interface is simple, contributing to a fast and functional access to the system and the integration of different data registered on it. Plant-antivenom system is available on the Internet at http://gbi.fmrp.usp.br/plantantivenom

Structural and Functional Studies of a Bothropic Myotoxin Complexed to Rosmarinic Acid: New Insights into Lys49-PLA2 Inhibition

Snakebite envenoming is an important public health problem in many tropical and subtropical countries, and is considered a neglected tropical disease by the World Health Organization. Most severe cases are inflicted by species of the families Elapidae and Viperidae, and lead to a number of systemic and local effects in the victim. One of the main problems regarding viperidic accidents is prominent local tissue damage whose pathogenesis is complex and involves the combined actions of a variety of venom components. Phospholipases A2 (PLA2s) are the most abundant muscle-damaging components of these venoms. Herein, we report functional and structural studies of PrTX-I, a Lys49-PLA2 from Bothops pirajai snake venom, and the influence of rosmarinic acid (RA) upon this toxin's activities. RA is a known active component of some plant extracts and has been reported as presenting anti-myotoxic properties related to bothopic envenomation. The myotoxic activity of Lys49-PLA2s is well established in the literature and although no in vivo neurotoxicity has been observed among these toxins, in vitro neuromuscular blockade has been reported for some of these proteins. Our in vitro studies show that RA drastically reduces both the muscle damage and the neuromuscular blockade exerted by PrTX-I on mice neuromuscular preparations (by ∼80% and ∼90%, respectively). These results support the hypothesis that the two effects are closely related and lead us to suggest that they are consequences of the muscle membrane-destabilizing activity of the Lys49-PLA2. Although the C-terminal region of these proteins has been reported to comprise the myotoxic site, we demonstrate by X-ray crystallographic studies that RA interacts with PrTX-I in a different region. Consequently, a new mode of Lys49-PLA2 inhibition is proposed. Comparison of our results with others in the literature suggests possible new ways to inhibit bothropic snake venom myotoxins and improve serum therapy

Fast venomic analysis of Crotalus durissus terrificus from northeastern Argentina

The complete knowledge of the toxins that make up venoms is the base for the treatment of snake accidents victims and the selection of specimens for the preparation of venom pools for antivenom production. In this work, we used a fast and direct venomics approach to identify the toxin families in the C.d. terrificus venom, a Southern American Neotropical rattlesnake. The RP-HPLC separation profile of pooled venom from adult specimens followed by mass spectrometry analysis revealed that C.d. terrificus’ venom proteome is composed of 12 protein families, which are unevenly distributed in the venom, e.g., there are few major proteins in the venom's composition phospholipase A2, serine proteinase, crotamine and L-amino acid oxidase. At the same time, the proteome analysis revealed a small set of proteins with low quantity (less than 1.5%), both enzymes (metaloprotease, phospholipase B and 5′-nucleotidase) and proteins (Bradykinin potentiating and C-type natriuretic peptides, C-type lectin convulxin and nerve growth factor). To sum up, this research is the first venomic report of C.d.terrificus venom from Argentina. This proved to be crotamine positive venom that has a lower metalloprotease content than C.d. terrificus venoms from other regions. This information could be used in the discovery of future pharmacological agents or targets in antivenom therapy.Fil: Fusco, Luciano Sebastian. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Nordeste. Instituto de Química Básica y Aplicada del Nordeste Argentino. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Exactas Naturales y Agrimensura. Instituto de Química Básica y Aplicada del Nordeste Argentino; ArgentinaFil: Neto, Emidio B.. Governo do Estado de Sao Paulo. Secretaria da Saude. Instituto Butantan; BrasilFil: Francisco, Aleff F.. Instituto de Biociencias; BrasilFil: Alfonso, Jorge. Fundación Oswaldo Cruz; BrasilFil: Soares, Andreimar. Fundación Oswaldo Cruz; BrasilFil: Pimenta, Daniel C.. Governo do Estado de Sao Paulo. Secretaria da Saude. Instituto Butantan; BrasilFil: Leiva, Laura Cristina Ana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Nordeste. Instituto de Química Básica y Aplicada del Nordeste Argentino. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Exactas Naturales y Agrimensura. Instituto de Química Básica y Aplicada del Nordeste Argentino; Argentin

Venenos e toxinas ofídicas purificadas como ferramenta biotecnológica para o controle de Ralstonia solanacearum

The objective of this work was to evaluate the in vitro antibacterial activity of snake venoms and purified toxins on the phytopathogenic bacterium Ralstonia solanacearum. The evaluations were performed with 17 crude venoms (13 from Bothrops, 3 from Crotalus, and 1 from Lachesis) and seven toxins (1 from Bothrops and 6 from Crotalus). Antibacterial activity was assessed in MB1 medium containing solubilized treatments (1 μL mL‑1). A total of 100 μL bacterial suspension (8.4 x 109 CFU mL-1) was used. After incubation at 28°C, the number of bacterial colonies at 24, 48, and 72 hours after inoculation was evaluated. SDS-PAGE gel at 15% was used to analyze the protein patterns of the samples, using 5 μg protein of each sample in the assay. Furthermore, the minimum inhibitory concentration (MIC) and lethal concentration (LC50) values were determined by the Probit method. Venoms and toxins were able to reduce more than 90% of R. solanacearum growth. These results were either equivalent to those of the positive control chloramphenicol or even better. While MIC values ranged from 4.0 to 271.5 µg mL-1, LC50 ranged from 28.5 µg mL-1 to 4.38 mg mL-1. Ten crude venoms (7 from Bothrops and 3 from Crotalus) and two purified toxins (gyroxin and crotamine) are promising approaches to control the phytopathogenic bacterium R. solanacearum.O objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade antibacteriana in vitro de venenos e toxinas purificadas de serpentes sobre a bactéria fitopatogênica Ralstonia solanacearum. As avaliações foram realizadas em 17 venenos brutos (13 de Bothrops, 3 de Crotalus e 1 de Lachesis) e sete toxinas (1 de Bothrops e 6 de Crotalus). A atividade antibacteriana foi avaliada em meio MB1 que continha os tratamentos solubilizados (1 μL mL-1). Utilizou-se o total de 100 μL de suspensão bacteriana (8,4 x 109 UFC mL-1). Após incubação a 28°C, avaliou-se o número de colônias bacterianas às 24, 48 e 72 horas após a inoculação. O gel SDS-PAGE a 15% foi usado para analisar o perfil proteico das amostras, tendo-se utilizado 5 μg de proteína no ensaio. Além disso, os valores de concentração inibitória mínima (CIM) e concentração letal (CL50) foram determinados pelo método Probit. Os venenos e as toxinas foram capazes de reduzir mais de 90% do crescimento de R. solanacearum. Esses resultados foram ou equivalentes aos do controle positivo cloranfenicol ou até melhores. Enquanto os valores de CIM variaram de 4,0 a 271,5 µg mL-1, a CL50 variou de 28,5 µg mL-1 a 4,38 mg mL-1. Dez venenos brutos (7 de Bothrops e 3 de Crotalus) e duas toxinas (giroxina e crotamina) são abordagens promissoras para o controle da bactéria fitopatogênica R. solanacearum

O papel de um instrumento de apoio à comunicação matemática numa turma do 4.º ano

Relatório de Estágio apresentado à Escola Superior de Educação de Lisboa para obtenção de grau de mestre em Ensino do 1.º e 2.º Ciclos do Ensino BásicoA criação de ambientes de sala de aula onde os alunos são agentes efetivos da sua aprendizagem e têm espaço para participar e expor os seus conhecimentos, sabendo que vão ser ouvidos pelo professor e colegas, é, cada vez mais, uma recomendação curricular da atualidade e objeto de estudo. Este relatório dá conta da intervenção realizada numa turma do 4.º ano de escolaridade, com o propósito de promover a aprendizagem, valorizando, sistematicamente, a comunicação. Em simultâneo, explana-se a investigação realizada nesta turma, que envolveu a avaliação do impacto da construção de um instrumento de apoio aos momentos de Comunicação Matemática, no contexto de uma rotina semanal da turma, a Apresentação do Problema da Semana. Com a pretensão de dar resposta às questões (i) quais os contributos de um instrumento de apoio à organização e estruturação dos momentos de comunicação matemática? e (ii) de que forma esse mesmo instrumento contribui para o desenvolvimento de estratégias de resolução de problemas?, investigou-se a evolução da turma quanto à comunicação das resoluções dos problemas e à variedade das estratégias utilizadas, antes e após a construção coletiva do instrumento de apoio. A análise de resultados, feita através da análise das produções dos alunos e das respostas a um questionário que instigou a reflexão sobre o papel do instrumento de apoio ao longo das várias apresentações do problema da semana, permitiu perceber uma crescente variedade de estratégias utilizadas e uma maior preocupação, por parte dos alunos, em organizar e estruturar os momentos de comunicação matemática, bem como em mobilizar um discurso com correção matemática. Este é um estudo que se limita a uma turma, não sendo as suas conclusões generalizáveis, mas que pode contribuir com uma estratégia para melhorar a comunicação matemática dos alunos, de uma forma que os envolve de forma direta e que prevê a sua participação e papel ativo na aprendizagem.ABSTRACT Creating classroom environments where students are effective agents of their learning process and have space to participate and exhibit their skills, knowing that they will be heard by the teacher and classmates, is an increasingly curricular recomendation and object of stdy nowadays. This report gives an account of the intervention carried out on a 4th grade level class, with the purpose of promoting learning, valuing, systematically, the communication. At the same time, explains research performed in this class, which involved the evaluation of the impact of the construction of an instrument in support of Mathematical Communication moments, in the context of a weekly routine of the class, The Presentation of rhe Problem of the Week. With the pretense of responding to questions (i) what are the contributions of an instrument of support to the organization and structuring of moments of mathematical communication? and (ii) how this same instrument contributes to the development of problem solving strategies?, it was investigated the evolution of the class regarding the communication of the resolutions of the problems and the variety of strategies used in problem solving, before and after the collective construction of the instrument. The analysis of results, through the analysis of students’ productions and the replies to a questionnaire that instigated the reflection about the role of the instrument of support along the various presentations of the problem of the week, allowed to realize a growing variety of strategies used and greater concern, on the part of students, to organise and structure the moments of mathematical communication as well as in mobilizing a discourse with mathematical correction. This is a study that is limited to a class, which makes its conclusions not generalizable, but that can contribute with a strategy to improve students’ math communication, in a way that involves them directly and provides their participation and active role in their own learning process.N/

In memoriam: Prof. Dr. José Roberto Giglio and his contributions to toxinology

Submitted by EMERSON LEAL ([email protected]) on 2016-04-04T14:44:51Z No. of bitstreams: 1 In memoriam Prof. Dr. Jose.pdf: 303269 bytes, checksum: 22b9867660d9bf2b01fd2105d6246c9d (MD5)Approved for entry into archive by EMERSON LEAL ([email protected]) on 2016-04-14T14:25:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 In memoriam Prof. Dr. Jose.pdf: 303269 bytes, checksum: 22b9867660d9bf2b01fd2105d6246c9d (MD5)Made available in DSpace on 2016-04-14T14:25:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 In memoriam Prof. Dr. Jose.pdf: 303269 bytes, checksum: 22b9867660d9bf2b01fd2105d6246c9d (MD5) Previous issue date: 2014Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Estudos de Biomoléculas Aplicadas à Saúde, Porto Velho, RO, Brazil / Universidade Federal de Rondônia. Porto Velho, RO, Brazil.Prof. Dr. José R. Giglio (1934 e 2014) made a highly significant contribution to the field of Toxinology. During 48 years devoted to research and teaching Prof Giglio published more than 160 articles, with more than 4400 citations, in international journals, trained a vast amount of graduate and undergraduate students, and developed an international network of collaborators. Throughout these years, he worked with dedication and deep commitment to science, leaving an immortalized legacy. During his professional career he contributed mostly in the isolation, and biochemical and functional characterization of various protein toxins derived from animal venoms such as snakes, scorpions and spiders, in addition to his studies searching for alternative therapies for poisoning. Even after his departure, his presence and influence remains among his former students and in the outstanding legacy of his scientific contributions