Targeting Bid for mitoprotection - Bid crystallization, new mechanisms and inhibitory compounds

Mitochondriale Prozesse des Zelltods spielen eine entscheidende Rolle für den progressiven Verlust von Neuronen bei neurodegenerativen Erkrankungen (M. Alzheimer, M. Parkinson) und nach akuter Hirnschädigung durch Schädel-Hirn-Trauma oder zerebraler Ischämie. Eine Schlüsselfunktion nimmt hierbei das pro-apoptotische Bcl-2 Protein Bid ein. Durch die Aktivierung und mitochondriale Translokation von Bid kommt es zur Schädigung und Fragmentierung von Mitochondrien und letztlich zur Freisetzung von weiteren pro-apoptotischen Faktoren (AIF, Cytochrom C, Smac/DIABLO), die den Untergang der Neurone steuern. Um in Zukunft Bid als potentielles Target für die Therapie von akuten und chronischen neurologischen sowie nicht neurologischen Erkrankungen nutzen zu können, müssen die bisher ungeklärten Mechanismen der Bid-induzierten mitochondrialen Schädigung, sowie die Interaktionen von aktiviertem Bid mit weiteren am Zelltod beteiligten Proteine aufgeklärt werden. Ziel dieser Arbeit war daher die Untersuchung Bid-abhängiger, mitochondrialer Zelltod Mechanismen und beteiligter Protein-Wechselwirkungen. Darüber hinaus stand die Entwicklung neuer Leitstrukturen für protektive Bid-Inhibitoren sowie die Etablierung erster Kristallisationsansätze verschiedener Bid Konstrukte im Fokus dieser Arbeit. Als Modellsyteme mitochondrialer Prozesse des Zelltods dienten vor allem immortalisierte hippokampale Neurone (HT-22 Zellen), in denen eine Behandlung mit Glutamat den durch oxidativen Stress gekennzeichneten Zelltod induziert. Als weiteres Schädigungsmodell wurde die Überexpression von aktiviertem Bid (tBid) eingesetzt. Zum Nachweis von Proteininteraktionen wurden weiterhin eine primäre neuronale Zellkultur und ein in vivo-Modell der zerebralen Ischämie verwendet, sowie verschiedene Untersuchung mit rekombinanten Proteinen durchgeführt. Neue niedermolekulare Bid-Inhibitoren aus drei strukturell verschiedenen Substanzklassen wurden mittels Zellviabilitätsmessungen auf neuroprotektive Effekte geprüft. Sieben Substanzen zeigten nicht nur deutliche Protektion gegenüber dem Glutamat- und tBid-induzierten Zelltod, sondern konnten ebenso die Bid-abhängige mitochondriale Schädigung verhindern. Weiterhin bietet die Arbeit Einblicke in die Kristallisation von rekombinantem Bid Protein, welche als Basis für ein grundlegendes Verständnis der molekularen Proteinfunktion sowie der Struktur-basierten Wirkstoffentwicklung dient. Durch Verfolgung wichtiger Strategien im Konstruktdesign konnte eines der verwendeten Bid Konstrukte erfolgreich kristallisiert werden und lieferte eine Strukturauflösung von 3.75 bis 3.95 Ǻ unter Synchrotronstrahlung. Weiterhin wurde der Effekt der rekombinanten Proteine Bid, cBid und Bax auf Fluoreszenz-Liposomen getestet, um die Mechanismen der Bid-abhängigen mitochondrialen Membranpermeabilisierung zu untersuchen. Es konnte hier eine Schlüsselrolle für das mitochondriale Lipid Cardiolipin gezeigt werden, in dessen Abhängigkeit Caspase-8 aktiviertes Bid (cBid) eine Membrandestabilisierung vermittelte, welche durch die Koexistenz von Bax gesteigert werden konnte. Letztlich konnte erstmals eine direkte Interaktion zwischen Bid und dem mitochondrialen Porin VDAC1 in kultivierten Neuronen sowie in einem in vivo Modell der zerebralen Ischämie nachweisen. Die Inhibition von VDAC1 mittels Einsatz des Anionen-Kanal-Blockers DIDS sowie der Verwendung von VDAC1 siRNA konnte sowohl die Funktion als auch die Integrität der Mitochondrien nach Glutamat- und tBid-induzierter Schädigung schützen und bestätigte somit die essentielle Rolle von VDAC1 im Bid-abhängigen Zelltod. Weitere Untersuchungen zeigten erstmalig, dass beide Proteine, Bid und VDAC1, gleichermaßen im neuronalen Zelltod involviert sind und offensichtlich zusammen eine Schädigung der mitochondrialen Membran induzieren. Im Gegensatz dazu konnte gezeigt werden, dass die Isoform VDAC2 nur eine untergeordnete Rolle im Bid-induzierten Zelltod in Neuronen spielt. Die nachgewiesene Bid-VDAC1 Wechselwirkung besitzt hohe Relevanz für die mitochondrialen Prozesse des Zelltods. Damit verbindet die vorliegende Arbeit die bisher kontrovers betrachten Mechanismen der mitochodrialen Membranschädigung, die zuvor entweder auf die alleinige Aktivität der Bcl-2 Proteine oder auf VDACs zurückgeführt wurde. Mit der Identifizierung neuer potentieller Bid-Inhibitoren sowie durch Etablierung wichtiger Grundlagen für die Aufklärung der Kristallstruktur von Bid, stellt die Arbeit einen wesentlichen Beitrat für die strukturbasierte Wirkstoffentwicklung und Therapie verschiedener neurologischer und nicht neurologischer Erkrankungen dar, in welchen Bid-abhängige mitochondriale Prozesse des Zelltods eine wesentliche Rolle spielen

iTReX: Interactive exploration of mono- and combination therapy dose response profiling data

High throughput screening methods, measuring the sensitivity and resistance of tumor cells to drug treatments have been rapidly evolving. Not only do these screens allow correlating response profiles to tumor genomic features for developing novel predictors of treatment response, but they can also add evidence for therapy decision making in precision oncology. Recent analysis methods developed for either assessing single agents or combination drug efficacies enable quantification of dose-response curves with restricted symmetric fit settings. Here, we introduce iTReX, a user-friendly and interactive Shiny/R application, for both the analysis of mono- and combination therapy responses. The application features an extended version of the drug sensitivity score (DSS) based on the integral of an advanced five-parameter dose-response curve model and a differential DSS for combination therapy profiling. Additionally, iTReX includes modules that visualize drug target interaction networks and support the detection of matches between top therapy hits and the sample omics features to enable the identification of druggable targets and biomarkers. iTReX enables the analysis of various quantitative drug or therapy response readouts (e.g. luminescence, fluorescence microscopy) and multiple treatment strategies (drug treatments, radiation). Using iTReX we validate a cost-effective drug combination screening approach and reveal the application’s ability to identify potential sample-specific biomarkers based on drug target interaction networks. The iTReX web application is accessible at (https://itrex.kitz-heidelberg.de).Peer reviewe

Drug sensitivity profiling of 3D tumor tissue cultures in the pediatric precision oncology program INFORM

The international precision oncology program INFORM enrolls relapsed/refractory pediatric cancer patients for comprehensive molecular analysis. We report a two-year pilot study implementing ex vivo drug sensitivity profiling (DSP) using a library of 75–78 clinically relevant drugs. We included 132 viable tumor samples from 35 pediatric oncology centers in seven countries. DSP was conducted on multicellular fresh tumor tissue spheroid cultures in 384-well plates with an overall mean processing time of three weeks. In 89 cases (67%), sufficient viable tissue was received; 69 (78%) passed internal quality controls. The DSP results matched the identified molecular targets, including BRAF, ALK, MET, and TP53 status. Drug vulnerabilities were identified in 80% of cases lacking actionable (very) high-evidence molecular events, adding value to the molecular data. Striking parallels between clinical courses and the DSP results were observed in selected patients. Overall, DSP in clinical real-time is feasible in international multicenter precision oncology programs

Drug sensitivity profiling of 3D tumor tissue cultures in the pediatric precision oncology program INFORM

The international precision oncology program INFORM enrolls relapsed/refractory pediatric cancer patients for comprehensive molecular analysis. We report a two-year pilot study implementing ex vivo drug sensitivity profiling (DSP) using a library of 75-78 clinically relevant drugs. We included 132 viable tumor samples from 35 pediatric oncology centers in seven countries. DSP was conducted on multicellular fresh tumor tissue spheroid cultures in 384-well plates with an overall mean processing time of three weeks. In 89 cases (67%), sufficient viable tissue was received; 69 (78%) passed internal quality controls. The DSP results matched the identified molecular targets, including BRAF, ALK, MET, and TP53 status. Drug vulnerabilities were identified in 80% of cases lacking actionable (very) high-evidence molecular events, adding value to the molecular data. Striking parallels between clinical courses and the DSP results were observed in selected patients. Overall, DSP in clinical real-time is feasible in international multicenter precision oncology programs.Peer reviewe

Drug-perturbation-based stratification of blood cancer

As new generations of targeted therapies emerge and tumor genome sequencing discovers increasingly comprehensive mutation repertoires, the functional relationships of mutations to tumor phenotypes remain largely unknown. Here, we measured ex vivo sensitivity of 246 blood cancers to 63 drugs alongside genome, transcriptome, and DNA methylome analysis to understand determinants of drug response. We assembled a primary blood cancer cell encyclopedia data set that revealed disease-specific sensitivities for each cancer. Within chronic lymphocytic leukemia (CLL), responses to 62% of drugs were associated with 2 or more mutations, and linked the B cell receptor (BCR) pathway to trisomy 12, an important driver of CLL. Based on drug responses, the disease could be organized into phenotypic subgroups characterized by exploitable dependencies on BCR, mTOR, or MEK signaling and associated with mutations, gene expression, and DNA methylation. Fourteen percent of CLLs were driven by mTOR signaling in a non-BCR-dependent manner. Multivariate modeling revealed immunoglobulin heavy chain variable gene (IGHV) mutation status and trisomy 12 as the most important modulators of response to kinase inhibitors in CLL. Ex vivo drug responses were associated with outcome. This study overcomes the perception that most mutations do not influence drug response of cancer, and points to an updated approach to understanding tumor biology, with implications for biomarker discovery and cancer care.Peer reviewe

Targeting Bid for mitoprotection - Bid crystallization, new mechanisms and inhibitory compounds

Mitochondriale Prozesse des Zelltods spielen eine entscheidende Rolle für den progressiven Verlust von Neuronen bei neurodegenerativen Erkrankungen (M. Alzheimer, M. Parkinson) und nach akuter Hirnschädigung durch Schädel-Hirn-Trauma oder zerebraler Ischämie. Eine Schlüsselfunktion nimmt hierbei das pro-apoptotische Bcl-2 Protein Bid ein. Durch die Aktivierung und mitochondriale Translokation von Bid kommt es zur Schädigung und Fragmentierung von Mitochondrien und letztlich zur Freisetzung von weiteren pro-apoptotischen Faktoren (AIF, Cytochrom C, Smac/DIABLO), die den Untergang der Neurone steuern. Um in Zukunft Bid als potentielles Target für die Therapie von akuten und chronischen neurologischen sowie nicht neurologischen Erkrankungen nutzen zu können, müssen die bisher ungeklärten Mechanismen der Bid-induzierten mitochondrialen Schädigung, sowie die Interaktionen von aktiviertem Bid mit weiteren am Zelltod beteiligten Proteine aufgeklärt werden. Ziel dieser Arbeit war daher die Untersuchung Bid-abhängiger, mitochondrialer Zelltod Mechanismen und beteiligter Protein-Wechselwirkungen. Darüber hinaus stand die Entwicklung neuer Leitstrukturen für protektive Bid-Inhibitoren sowie die Etablierung erster Kristallisationsansätze verschiedener Bid Konstrukte im Fokus dieser Arbeit. Als Modellsyteme mitochondrialer Prozesse des Zelltods dienten vor allem immortalisierte hippokampale Neurone (HT-22 Zellen), in denen eine Behandlung mit Glutamat den durch oxidativen Stress gekennzeichneten Zelltod induziert. Als weiteres Schädigungsmodell wurde die Überexpression von aktiviertem Bid (tBid) eingesetzt. Zum Nachweis von Proteininteraktionen wurden weiterhin eine primäre neuronale Zellkultur und ein in vivo-Modell der zerebralen Ischämie verwendet, sowie verschiedene Untersuchung mit rekombinanten Proteinen durchgeführt. Neue niedermolekulare Bid-Inhibitoren aus drei strukturell verschiedenen Substanzklassen wurden mittels Zellviabilitätsmessungen auf neuroprotektive Effekte geprüft. Sieben Substanzen zeigten nicht nur deutliche Protektion gegenüber dem Glutamat- und tBid-induzierten Zelltod, sondern konnten ebenso die Bid-abhängige mitochondriale Schädigung verhindern. Weiterhin bietet die Arbeit Einblicke in die Kristallisation von rekombinantem Bid Protein, welche als Basis für ein grundlegendes Verständnis der molekularen Proteinfunktion sowie der Struktur-basierten Wirkstoffentwicklung dient. Durch Verfolgung wichtiger Strategien im Konstruktdesign konnte eines der verwendeten Bid Konstrukte erfolgreich kristallisiert werden und lieferte eine Strukturauflösung von 3.75 bis 3.95 Ǻ unter Synchrotronstrahlung. Weiterhin wurde der Effekt der rekombinanten Proteine Bid, cBid und Bax auf Fluoreszenz-Liposomen getestet, um die Mechanismen der Bid-abhängigen mitochondrialen Membranpermeabilisierung zu untersuchen. Es konnte hier eine Schlüsselrolle für das mitochondriale Lipid Cardiolipin gezeigt werden, in dessen Abhängigkeit Caspase-8 aktiviertes Bid (cBid) eine Membrandestabilisierung vermittelte, welche durch die Koexistenz von Bax gesteigert werden konnte. Letztlich konnte erstmals eine direkte Interaktion zwischen Bid und dem mitochondrialen Porin VDAC1 in kultivierten Neuronen sowie in einem in vivo Modell der zerebralen Ischämie nachweisen. Die Inhibition von VDAC1 mittels Einsatz des Anionen-Kanal-Blockers DIDS sowie der Verwendung von VDAC1 siRNA konnte sowohl die Funktion als auch die Integrität der Mitochondrien nach Glutamat- und tBid-induzierter Schädigung schützen und bestätigte somit die essentielle Rolle von VDAC1 im Bid-abhängigen Zelltod. Weitere Untersuchungen zeigten erstmalig, dass beide Proteine, Bid und VDAC1, gleichermaßen im neuronalen Zelltod involviert sind und offensichtlich zusammen eine Schädigung der mitochondrialen Membran induzieren. Im Gegensatz dazu konnte gezeigt werden, dass die Isoform VDAC2 nur eine untergeordnete Rolle im Bid-induzierten Zelltod in Neuronen spielt. Die nachgewiesene Bid-VDAC1 Wechselwirkung besitzt hohe Relevanz für die mitochondrialen Prozesse des Zelltods. Damit verbindet die vorliegende Arbeit die bisher kontrovers betrachten Mechanismen der mitochodrialen Membranschädigung, die zuvor entweder auf die alleinige Aktivität der Bcl-2 Proteine oder auf VDACs zurückgeführt wurde. Mit der Identifizierung neuer potentieller Bid-Inhibitoren sowie durch Etablierung wichtiger Grundlagen für die Aufklärung der Kristallstruktur von Bid, stellt die Arbeit einen wesentlichen Beitrat für die strukturbasierte Wirkstoffentwicklung und Therapie verschiedener neurologischer und nicht neurologischer Erkrankungen dar, in welchen Bid-abhängige mitochondriale Prozesse des Zelltods eine wesentliche Rolle spielen

iTReX: Interactive exploration of mono- and combination therapy dose response profiling data

High throughput screening methods, measuring the sensitivity and resistance of tumor cells to drug treatments have been rapidly evolving. Not only do these screens allow correlating response profiles to tumor genomic features for developing novel predictors of treatment response, but they can also add evidence for therapy decision making in precision oncology. Recent analysis methods developed for either assessing single agents or combination drug efficacies enable quantification of dose-response curves with restricted symmetric fit settings. Here, we introduce iTReX, a user-friendly and interactive Shiny/R application, for both the analysis of mono- and combination therapy responses. The application features an extended version of the drug sensitivity score (DSS) based on the integral of an advanced five-parameter dose-response curve model and a differential DSS for combination therapy profiling. Additionally, iTReX includes modules that visualize drug target interaction networks and support the detection of matches between top therapy hits and the sample omics features to enable the identification of druggable targets and biomarkers. iTReX enables the analysis of various quantitative drug or therapy response readouts (e.g. luminescence, fluorescence microscopy) and multiple treatment strategies (drug treatments, radiation). Using iTReX we validate a cost-effective drug combination screening approach and reveal the application’s ability to identify potential sample-specific biomarkers based on drug target interaction networks. The iTReX web application is accessible at (https://itrex.kitz-heidelberg.de).Peer reviewe

BID links ferroptosis to mitochondrial cell death pathways

Ferroptosis has been defined as an oxidative and iron-dependent pathway of regulated cell death that is distinct from caspase-dependent apoptosis and established pathways of death receptor-mediated regulated necrosis. While emerging evidence linked features of ferroptosis induced e.g. by erastin-mediated inhibition of the Xc(-) system or inhibition of glutathione peroxidase 4 (Gpx4) to an increasing number of oxidative cell death paradigms in cancer cells, neurons or kidney cells, the biochemical pathways of oxidative cell death remained largely unclear. In particular, the role of mitochondrial damage in paradigms of ferroptosis needs further investigation. In the present study, we find that erastin-induced ferroptosis in neuronal cells was accompanied by BID transactivation to mitochondria, loss of mitochondrial membrane potential, enhanced mitochondrial fragmentation and reduced ATP levels. These hallmarks of mitochondrial demise are also established features of oxytosis, a paradigm of cell death induced by Xc(-) inhibition by millimolar concentrations of glutamate. Bid knockout using CRISPR/Cas9 approaches preserved mitochondrial integrity and function, and mediated neuroprotective effects against both, ferroptosis and oxytosis. Furthermore, the BID-inhibitor BI-6c9 inhibited erastin-induced ferroptosis, and, in turn, the ferroptosis inhibitors ferrostatin-1 and liproxstatin-1 prevented mitochondrial dysfunction and cell death in the paradigm of oxytosis. These findings show that mitochondrial transactivation of BID links ferroptosis to mitochondrial damage as the final execution step in this paradigm of oxidative cell death