β-arrestins and advanced glycation end-products respectively regulate and modulate cell contraction induced by G protein coupled receptor activation.

Résumé : La contraction cellulaire est une activité centrale dans plusieurs processus physiologiques. Entre autre, elle joue un rôle dans la régulation de la perméabilité vasculaire et de la pression artérielle. Il est également établi qu’une contraction anormale des cellules du muscle lisse vasculaire (VSMC) est souvent associée à l’hypertension et ses complications. Il est donc suggéré que l’étude des mécanismes impliqués dans la transduction de signaux menant à la contraction cellulaire et les mécanismes impliqués dans la régulation de celle-ci pourrait permettre d’identifier de nouvelles cibles potentielles afin d’envisager de nouveaux traitements pour cette maladie. Étant donné le rôle connu du système angiotensinergique dans l’activité contractile des VSMC et les nombreux indices suggérant une dérégulation de ce système dans de développement de l’hypertension; la présente thèse a été consacrée, dans un premier temps, à identifier de nouveaux mécanismes de signalisation impliqués dans la contraction cellulaire induite par l’angiotensine II. Ainsi, il est montré, pour la première fois, que les β-arrestines; des protéines adaptatrices impliquées dans la désensibilisation et la signalisation des récepteurs couplés aux protéines G, participent à la contraction cellulaire associée à l’activation du récepteur de l’angiotensine de type 1, et ce, en exerçant des effets opposés sur la phosphorylation de la chaîne légère de la myosine. Dans un second temps, étant donné qu’en condition diabétique une dysfonction vasculaire est observée et que cette dernière serait reliée à des changements dans le phénotype fonctionnel des VSMC; la deuxième partie de cette thèse traite des effets de l’exposition aux produits de glycation avancée (AGE) sur le phénotype et l’activité contractile des VSMC. Effet, les AGE, issus de la réaction entre les protéines et le glucose et dont la formation est particulièrement favorisée en contexte diabétique, pourraient être impliqués dans la dysfonction vasculaire observée. Ainsi, il est montré, pour la première fois, que l’exposition des VSMC aux AGE inhibe l’expression de leur phénotype contractile en affectant leurs propriétés mécaniques et diverses fonctions cellulaires telles que la signalisation, la contraction et l’organisation du cytosquelette. Dans un contexte plus large, cette thèse confirme également l’importance d’intégrer les approches biophysiques à la biologie cellulaire. En effet, les résultats obtenus par microscopie à force atomique sont uniques puisqu’ils offrent une nouvelle perspective concernant l’activité cellulaire via la caractérisation du phénotype mécanique de la cellule et la mesure de la contraction au niveau d’une seule cellule. || Abstract : Cell contraction plays a key role in a variety of physiological processes, among those; it regulates vascular permeability and blood pressure. It is known that abnormal contraction of vascular smooth muscle cells (VSMC) is often associated with hypertension and its complications. Therefore, it is suggested that studying mechanisms involved in signal transduction leading to cell contraction and mechanisms regulating the cell ability to contract may allow identifying new therapeutic targets in order to suggest new treatments for hypertension. Knowing the role of the angiotensin system in VSMC contractility and the numerous evidences suggesting a dysregulation of this system in the development of hypertension; this thesis first sought to identify new signaling mechanisms involved in cell contraction induced by angiotensin II. Therefore, it is shown here, for the first time, that β- arrestins; which are scaffolding proteins involved in the desensitisation and the signalling of protein G-coupled receptors, participate in cell contractile activity induced by angiotensin receptor type 1 activation by reciprocally regulating myosin activity through its light chain phosphorylation. Secondly, knowing that a vascular dysfunction is observed in diabetes which could be attributed to changes in VSCM functional phenotype; this thesis also investigated the effect of advanced glycation end-products (AGE) exposure on the contractile phenotype and function of VSMC. Indeed, AGE, which are the product of a reaction between proteins and glucose, are increased significantly in diabetes and are suspected to be involved in the vascular dysfunction observed in this metabolic disease. Therefore, it shown, for the first time, that AGE stimulation of the VSMC A7r5 interfere with the expression of their contractile phenotype by changing their mechanical properties and various cellular functions such as signal transduction, contraction and cytoskeletal organisation. Finally, this thesis also underlines the utility of integrating biophysical tools into studying cellular biology. Indeed, the various results obtained using atomic force microscopy are unique in a way that they provide new insights into studying cellular activity trough the measurement of single cell contraction and characterisation its mechanical phenotyp

Rôle de la chymase dans la réponse pressive et la conversion de la Big endothéline-1 chez la souris

La voie classique de production de l'ET-1 à partir de la Big ET-1 requiert l'activité des enzymes de conversion de l'endothéline (ECE). Différentes études in vitro ont aussi montré que la Big ET-1 pouvait être transformée par la chymase, une protéase à sérine, en un intermédiaire de 31 acides aminés, l'ET-1 (1-31). Il est donc suggéré que la production in vivo d'ET-1 (1-31) via l'activité de la chymase représente une voie alternative indépendante de l'ECE dans la conversion de la Big ET-1. Le but de ce mémoire était donc d'étudier le rôle de la chymase dans la conversion de la Big ET-1 in vivo. Pour ce faire une approche pharmacologique a été privilégiée chez la souris C57/BL6J anesthésiée et instrumentée. Ainsi, les réponses pressives des Big ET-1, d'ET-1 (1-31) et d'ET-1 ont été déterminées. Malgré une réponse pressive maximale similaire pour les trois peptides, l'ET-1 était six fois plus puissant que l'ET-1 (1-31) et la Big ET-1. De plus, les réponses pressives des trois endothélines ont été respectivement diminuées ou amplifiées par les antagonistes sélectifs des récepteurs ETa (BQ-123) ou ETb (BQ-788). Les réponses pressives à la Big ET-1 ont été diminuées par le thiorphan, un inhibiteur de la NEP, et le CGS 35066, un inhibiteur de l'ECE. D'un autre côté, les réponses à l'ET-1(1-31) ont été abolies seulement par le thiorphan. Ces résultats suggèrent donc que l'ECE et la NEP sont responsables des effets presseurs de la Big ET-1, alors que seule la NEP est impliquée dans ceux de l'ET-1 (1-31). De plus, le Suc-Val-Pro-Phe(P)-(0Ph)2, un inhibiteur de la chymase, a réduit de plus de 50% la réponse à la Big ET-1 sans affecter celle de l'ET-1 (1-31). Ces résultats suggèrent que la chymase est une enzyme importante dans la réponse pressive à la Big ET-1. Des immunoessais spécifiques couplés au HPLC ont permis de montrer une augmentation significative des taux plasmatiques d'ET-1 (1-31) et d'ET-1 suivant l'administration intraveineuse de Big ET-1. Ces augmentations ont été abolies chez les animaux prétraitées au Suc-Val-Pro-Phe(P)-(0Ph)2 confirmant le rôle de la chymase dans la conversion de la Big ET-1. La spécificité du Suc-Val-Pro-Phe(P)-(0Ph)2 et l'activité chymase ont également été évaluées dans divers organes (cœur, poumons et aortes) à l'aide d'essais fluorogéniques. Enfin, l'expression relative de la NEP, l'ECE-la et les mMCP-4 et 5 ont été établies dans ces mêmes organes avec l'aorte exprimant les plus hauts niveaux d'ARNm des deux isoformes de la chymase par rapport à l'ECE-la. En conclusion, la chymase serait impliquée dans les propriétés cardiovasculaires de la Big ET-1 administrée systémiquement, dans sa conversion en ET-1 (1-31) et dans les variations plasmatiques de l'ET-1

Rôle de la chymase dans la réponse pressive et la conversion de la Big endothéline-1 chez la souris

La voie classique de production de l'ET-1 à partir de la Big ET-1 requiert l'activité des enzymes de conversion de l'endothéline (ECE). Différentes études in vitro ont aussi montré que la Big ET-1 pouvait être transformée par la chymase, une protéase à sérine, en un intermédiaire de 31 acides aminés, l'ET-1 (1-31). Il est donc suggéré que la production in vivo d'ET-1 (1-31) via l'activité de la chymase représente une voie alternative indépendante de l'ECE dans la conversion de la Big ET-1. Le but de ce mémoire était donc d'étudier le rôle de la chymase dans la conversion de la Big ET-1 in vivo. Pour ce faire une approche pharmacologique a été privilégiée chez la souris C57/BL6J anesthésiée et instrumentée. Ainsi, les réponses pressives des Big ET-1, d'ET-1 (1-31) et d'ET-1 ont été déterminées. Malgré une réponse pressive maximale similaire pour les trois peptides, l'ET-1 était six fois plus puissant que l'ET-1 (1-31) et la Big ET-1. De plus, les réponses pressives des trois endothélines ont été respectivement diminuées ou amplifiées par les antagonistes sélectifs des récepteurs ETa (BQ-123) ou ETb (BQ-788). Les réponses pressives à la Big ET-1 ont été diminuées par le thiorphan, un inhibiteur de la NEP, et le CGS 35066, un inhibiteur de l'ECE. D'un autre côté, les réponses à l'ET-1(1-31) ont été abolies seulement par le thiorphan. Ces résultats suggèrent donc que l'ECE et la NEP sont responsables des effets presseurs de la Big ET-1, alors que seule la NEP est impliquée dans ceux de l'ET-1 (1-31). De plus, le Suc-Val-Pro-Phe(P)-(0Ph)2, un inhibiteur de la chymase, a réduit de plus de 50% la réponse à la Big ET-1 sans affecter celle de l'ET-1 (1-31). Ces résultats suggèrent que la chymase est une enzyme importante dans la réponse pressive à la Big ET-1. Des immunoessais spécifiques couplés au HPLC ont permis de montrer une augmentation significative des taux plasmatiques d'ET-1 (1-31) et d'ET-1 suivant l'administration intraveineuse de Big ET-1. Ces augmentations ont été abolies chez les animaux prétraitées au Suc-Val-Pro-Phe(P)-(0Ph)2 confirmant le rôle de la chymase dans la conversion de la Big ET-1. La spécificité du Suc-Val-Pro-Phe(P)-(0Ph)2 et l'activité chymase ont également été évaluées dans divers organes (cœur, poumons et aortes) à l'aide d'essais fluorogéniques. Enfin, l'expression relative de la NEP, l'ECE-la et les mMCP-4 et 5 ont été établies dans ces mêmes organes avec l'aorte exprimant les plus hauts niveaux d'ARNm des deux isoformes de la chymase par rapport à l'ECE-la. En conclusion, la chymase serait impliquée dans les propriétés cardiovasculaires de la Big ET-1 administrée systémiquement, dans sa conversion en ET-1 (1-31) et dans les variations plasmatiques de l'ET-1

STIM1 participates in the contractile rhythmicity of HL-1 cells by moderating T-type Ca2+ channel activity

AbstractSTIM1 plays a crucial role in Ca2+ homeostasis, particularly in replenishing the intracellular Ca2+ store following its depletion. In cardiomyocytes, the Ca2+ content of the sarcoplasmic reticulum must be tightly controlled to sustain contractile activity. The presence of STIM1 in cardiomyocytes suggests that it may play a role in regulating the contraction of cardiomyocytes. The aim of the present study was to determine how STIM1 participates in the regulation of cardiac contractility. Atomic force microscopy revealed that knocking down STIM1 disrupts the contractility of cardiomyocyte-derived HL-1 cells. Ca2+ imaging also revealed that knocking down STIM1 causes irregular spontaneous Ca2+ oscillations in HL-1 cells. Action potential recordings further showed that knocking down STIM1 induces early and delayed afterdepolarizations. Knocking down STIM1 increased the peak amplitude and current density of T-type voltage-dependent Ca2+ channels (T-VDCC) and shifted the activation curve toward more negative membrane potentials in HL-1 cells. Biotinylation assays revealed that knocking down STIM1 increased T-VDCC surface expression and co-immunoprecipitation assays suggested that STIM1 directly regulates T-VDCC activity. Thus, STIM1 is a negative regulator of T-VDCC activity and maintains a constant cardiac rhythm by preventing a Ca2+ overload that elicits arrhythmogenic events