Structure and Dynamics of Intramembrane Protease Substrates by NMR Spectroscopy

In dieser Arbeit wurden die Substrate zweier Intramembranproteasen untersucht. Beim ersten Substrat handelte es sich um die Transmembrandomäne des Amyloid Precursor Protein (APP), ein Substrat der γ-Sekretase. Es ist im Zusammenhang mit Morbus Alzheimer bekannt. Das zweite Substrat war die Transmembrandomäne der Serin/Threonin-Protein Phosphatase PGAM5, die von PARL prozessiert und mit Morbus Parkinson in Verbindung gebracht wird. Intramembranproteasen, die an einer Vielzahl biologischer Prozesse beteiligt sind, schneiden ihre Substrate in der Ebene der Membran. Bisher wurden die Spaltungsprozesse selbst noch nicht auf struktureller Ebene untersucht, aber man geht davon aus, dass die Struktur und die Dynamik ihrer Substrate von entscheidender Bedeutung sind. Im Gegensatz zu löslichen Proteasen wird in Intramembranproteasen keine Konsensussequenz erkannt, trotzdem reagieren sie empfindlich auf Punktmutationen in der Substratsequenz. APP, das erste untersuchte Substrat, wird von der γ-Sekretase zunächst an der ε- Schnittstelle geschnitten und dann in mehreren Schritten weiter verkürzt, bis ein kurzes Fragment entsteht, das Aβ genannt wird. Dabei sind verschiedene Prozessierungswege möglich, die zu unterschiedlichen Produkten führen. Die zwei Hauptprodukte sind Aβ40 und Aβ42, wobei letzteres die im Zusammenhang mit Morbus Alzheimer bekannten Amyloid-Plaques im Gehirn bildet. Bei den beiden in dieser Arbeit untersuchten FAD Mutationen wurde festgestellt, dass der Anteil von Aβ42 im Vergleich zu Aβ40 zunimmt. Da beide Mutationen bei Patienten mit erblichem Morbus Alzheimer gefunden wurden, wird die Veränderung dieses Gleichgewichts als einer der Gründe für die früh einsetzende und schnell zum Tod führende Krankheit vermutet. Mit hochaufgelöster Kernresonanzspektroskopie wurden der Wildtyp der APP Transmembrandomäne sowie vier Punktmutationen intensiv untersucht. Dabei handelte es sich einerseits um die zwei FAD Mutanten nahe der ε-Schnittstelle (V44M und I45T), andererseits um zwei Mutationen am zentralen G37G38-Motiv. Eine Prolinmutante (G38P) wurde eingeführt, um die Transmembrandomäne an dieser Stelle zu destabilisieren. Zur Stabilisierung wurde das gleiche Glycin gegen Leucin (G38L) ausgetauscht. Es wurden verschiedene NMR Spektren aufgenommen, aus denen Strukturparameter abgeleitet werden konnten. Zum einen waren dies sekundäre chemische Verschiebungen, die die Sekundärstruktur beschreiben. Zum anderen konnten dreidimensionale Strukturen auf Basis der NMR Daten errechnet werden. Zusätzlich wurde der Wasserstoff-Deuterium Austausch gemessen, der Rückschlüsse auf die Stabilität von Wasserstoffbrücken zulässt. Die Analysen wurden in TFE/H2O durchgeführt, da das aktive Zentrum des Enzyms mit Wasser gefüllt ist. TFE/H2O ist deshalb besonders gut geeignet, um die Bedingungen im Inneren des Enzyms abzubilden. Die vier Mutanten unterscheiden sich in ihrer Struktur kaum vom Wildtyp. An der ε-Schnittstelle waren keine Unterschiede zu erkennen, die die unterschiedliche Spaltung erklären könnten. Auffällig war, dass es sich zwar in allen Fällen um durchgehende α-Helices handelte, diese aber aus zwei Bereichen bestanden. Dabei bildete das G37G38-Motiv eine Art Scharnier zwischen beiden Abschnitten, sodass die Gesamtstruktur nicht gerade, sondern geknickt war. Der Winkel zwischen den beiden Segmenten war dabei auf einen bestimmten Bereich beschränkt. Auch die relative Orientierung, also die Richtung des Knicks, war eingeschränkt. Sowohl die Stärke des Knicks, als auch die Vorzugsrichtungen wurden von jeder Mutation anders beeinflusst. Auf der Grundlage von MD-Simulationen von M. Hitzenberger wurde daraufhin postuliert, dass das Substrat an diesem G37G38-Scharnier knicken muss, um das aktive Zentrum der γ-Sekretase erreichen zu können. Hitzenberger hatte den initialen Komplex von Enzymen und Substrat untersucht. Die NMR Strukturen des APP TMD Wildtyp passten gut zu diesem Modell, wohingegen die Strukturen der Mutanten mit den TMDs der γ-Sekretase kollidierten. Für PARL, eine Rhomboid Protease, wird angenommen, dass es Substrate ebenfalls anhand ihrer Struktur und Dynamik erkennt, da hier ebenfalls keine Konsensussequenz erkannt wird. Die Transmembrandomäne des PARL Substrats PGAM5 WT und vier Punktmutationen wurden ebenfalls mittels NMR untersucht. Im Falle von PGAM5 wurden drei Reste mutiert, die zwischen verschiedenen Organismen konserviert sind, da angenommen wurde, dass diese eine essentielle Funktion erfüllen. Alle drei Aminosäuren wurden gegen Leucin ausgetauscht (C12L, G17L, G18L). Als vierte Mutation wurde eine Serin-Mutante untersucht (C12S). Auch hier wurden verschiedene sekundäre chemische Verschiebungen ermittelt und die dreidimensionalen Strukturen berechnet. Zusätzlich wurde ebenfalls der Wasserstoff- Deuterium Austausch gemessen. Dabei zeigte sich, dass die TMD von PGAM5 genauso wie die von APP aus zwei helikalen Bereichen bestand. Bei PGAM5 waren diese allerdings durch einen unstrukturierten Bereich verbunden. Deshalb ergab sich aus dem Vergleich der fünf Peptide, anders als bei APP, keine klar definierte Vorzugsrichtung. Allerdings waren Präferenzen zu erkennen. Mittels Röntgenstrukturanalyse war für ein anderes Rhomboid, GlpG gezeigt worden, dass der Bereich um die Schnittstelle hoch dynamisch sein muss, sobald er die Membran verlässt. Das in der Literatur postulierte Modell geht davon aus, dass sich der entsprechende Bereich der Helix vollständig entwinden muss, bevor er ins aktive Zentrum gelangen kann. Die berechneten Strukturen von PGAM5 lassen vermuten, dass in diesem Falle ein ähnlicher Mechanismus zugrunde liegt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Transmembrandomänen sowohl von APP als Substrat der γ-Sekretase als auch von PGAM5 aus zwei Segmenten bestanden. Im Falle von APP TMD war deren relative Anordnung vergleichsweise stark eingeschränkt, während sich für PGAM5 hingegen keine klare Präferenz ergab. Basierend auf diesen Ergebnissen konnte anhand der NMR Daten eine Hypothese für Substrate der γ-Sekretase formuliert werden: Nur die Struktur des kann in die von der MD Simulation vorgegebene Richtung abknicken, wohingegen die Strukturen der vier Mutanten gedreht werden müssen, um mit dem Enzym interagieren zu können. Diese Drehung könnte dann dazu führen, dass das Substrat anders prozessiert wird

Helical stability of the GnTV transmembrane domain impacts on SPPL3 dependent cleavage

Signal-Peptide Peptidase Like-3 (SPPL3) is an intramembrane cleaving aspartyl protease that causes secretion of extracellular domains from type-II transmembrane proteins. Numerous Golgi-localized glycosidases and glucosyltransferases have been identified as physiological SPPL3 substrates. By SPPL3 dependent processing, glycan-transferring enzymes are deactivated inside the cell, as their active site-containing domain is cleaved and secreted. Thus, SPPL3 impacts on glycan patterns of many cellular and secreted proteins and can regulate protein glycosylation. However, the characteristics that make a substrate a favourable candidate for SPPL3-dependent cleavage remain unknown. To gain insights into substrate requirements, we investigated the function of a GxxxG motif located in the transmembrane domain of N-acetylglucosaminyltransferase V (GnTV), a well-known SPPL3 substrate. SPPL3-dependent secretion of the substrate’s ectodomain was affected by mutations disrupting the GxxxG motif. Using deuterium/hydrogen exchange and NMR spectroscopy, we studied the effect of these mutations on the helix flexibility of the GnTV transmembrane domain and observed that increased flexibility facilitates SPPL3-dependent shedding and vice versa. This study provides first insights into the characteristics of SPPL3 substrates, combining molecular biology, biochemistry, and biophysical techniques and its results will provide the basis for better understanding the characteristics of SPPL3 substrates with implications for the substrates of other intramembrane proteases

Helical stability of the GnTV transmembrane domain impacts on SPPL3 dependent cleavage

Signal-Peptide Peptidase Like-3 (SPPL3) is an intramembrane cleaving aspartyl protease that causes secretion of extracellular domains from type-II transmembrane proteins. Numerous Golgi-localized glycosidases and glucosyltransferases have been identified as physiological SPPL3 substrates. By SPPL3 dependent processing, glycan-transferring enzymes are deactivated inside the cell, as their active site-containing domain is cleaved and secreted. Thus, SPPL3 impacts on glycan patterns of many cellular and secreted proteins and can regulate protein glycosylation. However, the characteristics that make a substrate a favourable candidate for SPPL3-dependent cleavage remain unknown. To gain insights into substrate requirements, we investigated the function of a GxxxG motif located in the transmembrane domain of N-acetylglucosaminyltransferase V (GnTV), a well-known SPPL3 substrate. SPPL3-dependent secretion of the substrate’s ectodomain was affected by mutations disrupting the GxxxG motif. Using deuterium/hydrogen exchange and NMR spectroscopy, we studied the effect of these mutations on the helix flexibility of the GnTV transmembrane domain and observed that increased flexibility facilitates SPPL3-dependent shedding and vice versa. This study provides first insights into the characteristics of SPPL3 substrates, combining molecular biology, biochemistry, and biophysical techniques and its results will provide the basis for better understanding the characteristics of SPPL3 substrates with implications for the substrates of other intramembrane proteases

Untargeted NMR Spectroscopic Analysis of the Metabolic Variety of New Apple Cultivars

Metabolome analyses by NMR spectroscopy can be used in quality control by generating unique fingerprints of different species. Hundreds of components and their variation between different samples can be analyzed in a few minutes/hours with high accuracy and low cost of sample preparation. Here, apple peel and pulp extracts of a variety of apple cultivars were studied to assess their suitability to discriminate between the different varieties. The cultivars comprised mainly newly bred varieties or ones that were brought onto the market in recent years. Multivariate analyses of peel and pulp extracts were able to unambiguously identify all cultivars, with peel extracts showing a higher discriminative power. The latter was increased if the highly concentrated sugar metabolites were omitted from the analysis. Whereas sugar concentrations lay within a narrow range, polyphenols, discussed as potential health promoting substances, and acids varied remarkably between the cultivars

Mitochondrial physiology

As the knowledge base and importance of mitochondrial physiology to evolution, health and disease expands, the necessity for harmonizing the terminology concerning mitochondrial respiratory states and rates has become increasingly apparent. The chemiosmotic theory establishes the mechanism of energy transformation and coupling in oxidative phosphorylation. The unifying concept of the protonmotive force provides the framework for developing a consistent theoretical foundation of mitochondrial physiology and bioenergetics. We follow the latest SI guidelines and those of the International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) on terminology in physical chemistry, extended by considerations of open systems and thermodynamics of irreversible processes. The concept-driven constructive terminology incorporates the meaning of each quantity and aligns concepts and symbols with the nomenclature of classical bioenergetics. We endeavour to provide a balanced view of mitochondrial respiratory control and a critical discussion on reporting data of mitochondrial respiration in terms of metabolic flows and fluxes. Uniform standards for evaluation of respiratory states and rates will ultimately contribute to reproducibility between laboratories and thus support the development of data repositories of mitochondrial respiratory function in species, tissues, and cells. Clarity of concept and consistency of nomenclature facilitate effective transdisciplinary communication, education, and ultimately further discovery

Mitochondrial physiology

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Large-Scale Recombinant Production of the SARS-CoV-2 Proteome for High-Throughput and Structural Biology Applications

The highly infectious disease COVID-19 caused by the Betacoronavirus SARS-CoV-2 poses a severe threat to humanity and demands the redirection of scientific efforts and criteria to organized research projects. The international COVID19-NMR consortium seeks to provide such new approaches by gathering scientific expertise worldwide. In particular, making available viral proteins and RNAs will pave the way to understanding the SARS-CoV-2 molecular components in detail. The research in COVID19-NMR and the resources provided through the consortium are fully disclosed to accelerate access and exploitation. NMR investigations of the viral molecular components are designated to provide the essential basis for further work, including macromolecular interaction studies and high-throughput drug screening. Here, we present the extensive catalog of a holistic SARS-CoV-2 protein preparation approach based on the consortium’s collective efforts. We provide protocols for the large-scale production of more than 80% of all SARS-CoV-2 proteins or essential parts of them. Several of the proteins were produced in more than one laboratory, demonstrating the high interoperability between NMR groups worldwide. For the majority of proteins, we can produce isotope-labeled samples of HSQC-grade. Together with several NMR chemical shift assignments made publicly available on covid19-nmr.com, we here provide highly valuable resources for the production of SARS-CoV-2 proteins in isotope-labeled form

Cleavage of mitochondrial homeostasis regulator PGAM5 by the intramembrane protease PARL is governed by transmembrane helix dynamics and oligomeric state

The intramembrane protease PARL acts as a crucial mitochondrial safeguard by cleaving the mitophagy regulators PINK1 and PGAM5. Depending on the stress level, PGAM5 can either stimulate cell survival or cell death. In contrast to PINK1, which is constantly cleaved in healthy mitochondria and only active when the inner mitochondrial membrane is depolarized, PGAM5 processing is inversely regulated. However, determinants of PGAM5 that indicate it as a conditional substrate for PARL have not been rigorously investigated, and it is unclear how uncoupling the mitochondrial membrane potential affects its processing compared to that of PINK1. Here, we show that several polar transmembrane residues in PGAM5 distant from the cleavage site serve as determinants for its PARL-catalyzed cleavage. Our NMR analysis indicates that a short N-terminal amphipathic helix, followed by a kink and a C-terminal transmembrane helix harboring the scissile peptide bond are key for a productive interaction with PARL. Furthermore, we also show that PGAM5 is stably inserted into the inner mitochondrial membrane until uncoupling the membrane potential triggers its disassembly into monomers, which are then cleaved by PARL. In conclusion, we propose a model in which PGAM5 is slowly processed by PARL-catalyzed cleavage that is influenced by multiple hierarchical substrate features, including a membrane potential-dependent oligomeric switch