Quantitative Untersuchung der Motilität des Blutparasiten Trypanosoma brucei brucei durch 4D-Tracking mittels digitaler In-line Holographie

In der vorliegenden Arbeit wurde die Motilität des Blutparasiten Trypanosoma brucei brucei untersucht. Dieser vor allem in Subsahara-Afrika verbreitete Organismus wird von der Tsetse-Fliege auf Menschen und Tiere übertragen und löst die unbehandelt tödlich verlaufende Afrikanische Schlafkrankheit aus. Nur wenige Medikamente sind bekannt, diese zeichnen sich jedoch meistens durch das Auftreten schwerer Nebenwirkungen aus. Der Organismus ist lange bekannt und seine Eigenmotilität wird seit langem mit seiner Pathogenität in Verbindung gebracht, trotzdem fehlen bislang weitgehend quantitative Untersuchungen zur Fortbewegung, vor allem der im infizierten Organismus vorkommenden Blutstromformen. Eine Strategie des Parasiten um die Immunantwort des Wirtes zu umgehen ist das „Abwaschen“ an der Zelloberfläche gebundener Antikörper durch gerichtetes Schwimmen. Desweiteren ist die Eigenbewegung von großer Bedeutung für die Zellteilung und damit erfolgreiche Vermehrung des Organismus sowie für die Verteilung im Wirt, da im Endstadium der Krankheit durch den Parasiten aktiv die Blut-Hirn-Schranke passiert wird. Die Kenntnis des zugrundeliegenden Fortbewegungsmechanismus ist also von grundlegender Bedeutung zum Verständnis der Pathogenese und damit zur Entwicklung von Strategien zur medikamentösen Bekämpfung des Erregers im infizierten Wirt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Motilitätsverhalten von Trypanosomen unterschiedlicher Lebenszyklusstadien bei verschiedenen Temperaturen mikroskopisch untersucht. Dazu wurde ein portables, holographisches Mikroskop entwickelt, dass die Vermessung von Trypanosomen bei physiologischen Temperaturen mit hoher Auflösung und Stabilität erlaubt. Die erhaltenen 3D-Daten erlauben erstmals eine quantitative Analyse frei schwimmender Trypanosomen über große Volumina und Zeiträume. Aus den Daten wurden zwei deutlich unterscheidbare Schwimmzustände abgeleitet, für die charakteristische Schwimmparameter, wie mittlere Schwimmgeschwindigkeiten und –winkel sowie typische Ausbreitungsverhalten abgeleitet werden konnten. Die Schwimmzustände konnten durch Referenzmessungen mit Motilitätsmutanten und unter Verwendung spezieller Probenkammern erfolgreich zwei unterschiedlichen Bewegungsmodi der die Trypanosomen antreibenden Struktur, dem Flagellum, zugeordnet werden. Die erhaltenen Daten zeigen deutlich die Adaption der Lebenszyklusstadien an ihre jeweils physiologische Temperatur und stützen eines der postulierten Modelle für die Trypanosomenbewegung, das run-and-tumble-Modell. Sie stellen somit einen wichtigen Beitrag zur Diskussion des Fortbewegungsmechanismus von Trypanosomen dar

Endogenous TRAIL-R4 critically impacts apoptotic and non-apoptotic TRAIL-induced signaling in cancer cells

Binding of TRAIL to its death domain-containing receptors TRAIL-R1 and TRAIL-R2 can induce cell death and/or pro-inflammatory signaling. The importance of TRAIL and TRAIL-R1/R2 in tumor immune surveillance and cancer biology has meanwhile been well documented. In addition, TRAIL has been shown to preferentially kill tumor cells, raising hope for the development of targeted anti-cancer therapies. Apart from death-inducing receptors, TRAIL also binds to TRAIL-R3 and TRAIL-R4. Whereas TRAIL-R3 is lacking an intracellular domain entirely, TRAIL-R4 contains a truncated death domain but still a signaling-competent intracellular part. It is assumed that these receptors have anti-apoptotic, yet still not well understood regulatory functions. To analyze the significance of the endogenous levels of TRAIL-R4 for TRAIL-induced signaling in cancer cells, we stably knocked down this receptor in Colo357 and MDA-MB-231 cells and analyzed the activation of apoptotic and non-apoptotic pathways in response to treatment with TRAIL. We found that TRAIL-R4 affects a plethora of signaling pathways, partly in an opposite way. While knockdown of TRAIL-R4 in Colo357 strongly increased apoptosis and reduced clonogenic survival, it inhibited cell death and improved clonogenic survival of MDA-MB-231 cells after TRAIL treatment. Furthermore, TRAIL-R4 turned out to be an important regulator of the expression of a variety of anti-apoptotic proteins in MDA-MB-231 cells since TRAIL-R4-KD reduced the cellular levels of FLIPs, XIAP and cIAP2 but upregulated the levels of Bcl-xL. By inhibiting Bcl-xL with Navitoclax, we could finally show that this protein mainly accounts for the acquired resistance of MDA-MB-231 TRAIL-R4-KD cells to TRAIL-induced apoptosis. Analyses of non-apoptotic signaling pathways revealed that in both cell lines TRAIL-R4-KD resulted in a constitutively increased activity of AKT and ERK, while it reduced AKT activity after TRAIL treatment

A Quantitative 3D Motility Analysis of Trypanosoma brucei by Use of Digital In-line Holographic Microscopy

We present a quantitative 3D analysis of the motility of the blood parasite Trypanosoma brucei. Digital in-line holographic microscopy has been used to track single cells with high temporal and spatial accuracy to obtain quantitative data on their behavior. Comparing bloodstream form and insect form trypanosomes as well as mutant and wildtype cells under varying external conditions we were able to derive a general two-state-run-and-tumble-model for trypanosome motility. Differences in the motility of distinct strains indicate that adaption of the trypanosomes to their natural environments involves a change in their mode of swimming

Swimming behavior of Pseudomonas aeruginosa studied by holographic 3D tracking.

Holographic 3D tracking was applied to record and analyze the swimming behavior of Pseudomonas aeruginosa. The obtained trajectories allow to qualitatively and quantitatively analyze the free swimming behavior of the bacterium. This can be classified into five distinct swimming patterns. In addition to the previously reported smooth and oscillatory swimming motions, three additional patterns are distinguished. We show that Pseudomonas aeruginosa performs helical movements which were so far only described for larger microorganisms. Occurrence of the swimming patterns was determined and transitions between the patterns were analyzed

Schematic representations of the digital in-line holographic microscopy setup.

<p>(A) The holographic device used in this study consists of the laser source, adjustment mirrors, apertures, a beam expander, the objective, a pinhole and a CMOS camera. B) schematic geometry of the beam path behind the 500 nm pinhole with geometric dimensions relevant for the reconstruction process.</p

Representation of <i>P.aeruginosa</i> trajectories showing different swimming patterns.

<p>(A) 3D representation of trajectories of <i>P. aeruginosa</i>. The optical path and thus the real space orientation of the 3D cubus is illustrated. (B) xy-projection of trajectories of <i>P. aeruginosa</i> as viewed along the optical path. In some trajectories loops can be observed which are marked with black arrows. (C) Schematical representation of 5 different swimming patterns observed for <i>P. aeruginosa</i> after tracking of 35 individual bacteria. The different patterns are termed (1) meander, (2) oscillation, (3) helix, (4) pseudohelix and (5) twisting. (D) Probability to observe the classified swimming patterns meander, oscillation, helix, pseudohelix and twisting within a trajectory. Values represent the average over 35 trajectories with the corresponding standard error.</p