Humane hämatopoetische Stammzellen - Einflüsse von Proteinasen, Inhibitoren und dreidimensionalen Kulturbedingungen

Für viele Leukämiepatienten ist eine Stammzelltransplantation die lebensrettende Thera-piemaßnahme. Spenderzellen werden heutzutage hauptsächlich durch Leukapherese gewon-nen, nachdem sie durch G-CSF-Behandlung aus ihrer schützenden Knochenmarknische ins periphere Blut mobilisiert wurden. Zwischen 5 und 40 % der Spender sind jedoch nicht in der Lage, ausreichend hohe Mengen hämatopoetischer Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) zu mobilisieren. Daher ist eine genaue Aufklärung der molekularen Prozesse im Zuge der indu-zierten HSPC-Mobilisierung erforderlich, um ihre Effektivität zu erhöhen. Ein zentrales Ereig-nis hierbei ist der Aufbau einer proteolytischen Mikroumgebung in der Nische, welche durch Auflösung der Zell-Zell- und Zell-Matrixkontakte sowie durch Degradation biologisch aktiver Moleküle den Austritt der HSPCs aus dem Knochenmark ermöglicht. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass neben den bereits bekannten Matrixmetalloproteinasen MMP-2, -8, -9 und -14 weitere MMP-Mitglieder zum Aufbau des proteolytischen Milieus beitragen könnten. MMP-3, -7, -11 und -13 wurden von Nischenzellen exprimiert. MMP-7 und -13 prozessierten den HSPC-Retentionsfaktor SDF-1α in gleicher Weise wie MMP-9, wodurch seine chemotakti-sche Wirkung beeinträchtigt werden könnte. Eine weitere HSPC-regulierende Proteasengrup-pe stellen Cystein-Cathepsine dar, die durch endogene Inhibitoren der Cystatin-Familie regu-liert werden können. Eine mögliche Funktion der Cystatine in der Stammzellnische wurde im Rahmen dieser Arbeit untersucht. Cystatin C wurde in hohen Konzentrationen durch Kno-chenmarkstromazellen ausgeschieden, wobei die Sekretion durch direkte Stimulation mit G-CSF beeinflusst werden konnte. Die adhäsiven und invasiven Eigenschaften hämatopoetischer Zellen gegenüber mesenchymalen Stromazellen (MSCs) konnten durch Cystatin C reduziert werden, allerdings nur bei einem Überschuss des Inhibitors. Eine weitere Quelle für Stammzellen bietet das Nabelschnurblut, jedoch müssen die HSPCs meist aufgrund niedriger Zellzahl für eine Transplantation ex vivo expandiert werden. In dieser Arbeit wurde ein 3D Modell zur Expansion von CD34+ HSPCs in Kokultur mit MSCs aus dem Knochenmark etabliert. Eine gemischte Zellsuspension wurde in Hanging-Drop-Platten ausgesät. Die MSCs segregierten in kurzer Zeit zu einem kompakten Sphäroid, umgeben von rasch expandierenden HSPCs. Überraschenderweise stellte sich die 3D Methode im Vergleich zur HSPC-Proliferation über einem 2D Zellrasen aus MSCs als weniger effizient heraus, wobei die expandierten Stammzellen auch an Qualität unterlegen waren. Die Ergebnisse lassen die Schlussfolgerung zu, dass bestimmte biophysikalische Voraussetzungen erfüllt sein müssen, damit MSCs ihre HSPC unterstützende Funktion optimal ausüben können

Application of integrated transcriptomic, proteomic and metabolomic profiling for the delineation of mechanisms of drug induced cell stress

International audience; High content omic techniques in combination with stable human in vitro cell culture systems have the potential to improve on current pre-clinical safety regimes by providing detailed mechanistic information of altered cellular processes. Here we investigated the added benefit of integrating transcriptomics, proteomics and metabolomics together with pharmacokinetics for drug testing regimes. Cultured human renal epithelial cells (RPTEC/TERT1) were exposed to the nephrotoxin Cyclosporine A (CsA) at therapeutic and supratherapeutic concentrations for 14 days. CsA was quantified in supernatants and cellular lysates by LC-MS/MS for kinetic modeling. There was a rapid cellular uptake and accumulation of CsA, with a non-linear relationship between intracellular and applied concentrations. CsA at 15 µM induced mitochondrial disturbances and activation of the Nrf2-oxidative-damage and the unfolded protein-response pathways. All three omic streams provided complementary information, especially pertaining to Nrf2 and ATF4 activation. No stress induction was detected with 5 µM CsA; however, both concentrations resulted in a maximal secretion of cyclophilin B. The study demonstrates for the first time that CsA-induced stress is not directly linked to its primary pharmacology. In addition we demonstrate the power of integrated omics for the elucidation of signaling cascades brought about by compound induced cell stress

Lymphocyte Circadian Clocks Control Lymph Node Trafficking and Adaptive Immune Responses

Lymphocytes circulate through lymph nodes (LN) in search for antigen in what is believed to be a continuous process. Here, we show that lymphocyte migration through lymph nodes and lymph occurred in a non-continuous, circadian manner. Lymphocyte homing to lymph nodes peaked at night onset, with cells leaving the tissue during the day. This resulted in strong oscillations in lymphocyte cellularity in lymph nodes and efferent lymphatic fluid. Using lineage-specific genetic ablation of circadian clock function, we demonstrated this to be dependent on rhythmic expression of promigratory factors on lymphocytes. Dendritic cell numbers peaked in phase with lymphocytes, with diurnal oscillations being present in disease severity after immunization to induce experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). These rhythms were abolished by genetic disruption of T cell clocks, demonstrating a circadian regulation of lymphocyte migration through lymph nodes with time-of-day of immunization being critical for adaptive immune responses weeks later

Application of integrated transcriptomic, proteomic and metabolomic profiling for the delineation of mechanisms of drug induced cell stress.

High content omic techniques in combination with stable human in vitro cell culture systems have the potential to improve on current pre-clinical safety regimes by providing detailed mechanistic information of altered cellular processes. Here we investigated the added benefit of integrating transcriptomics, proteomics and metabolomics together with pharmacokinetics for drug testing regimes. Cultured human renal epithelial cells (RPTEC/TERT1) were exposed to the characterized nephrotoxin Cyclosporine A (CsA) at therapeutic and supra therapeutic concentrations for 14 days. CsA was quantified in supernatants and cellular lysates by LC-MS/MS for kinetic modeling. There was a rapid cellular uptake and accumulation of CsA, with a non-linear relationship between intracellular and applied concentrations. CsA at 15 µM induced mitochondrial disturbances and activation of the Nrf2-oxidative-damage and the unfolded protein- response pathways. All three omic streams provided complementary information, especially pertaining to Nrf2 and ATF4 activation. No stress induction was detected with 5 µM CsA; however, both concentrations resulted in a maximal secretion of cyclophilin B. The study demonstrates for the first time that CsA-induced stress is not directly linked to its primary pharmacology. In addition we demonstrate the power of integrated omics for the elucidation of signaling cascades brought about by compound induced cell stress.JRC.I.1-Chemical Assessment and Testin