Einfluss von Wirtsfaktoren auf die Nipahvirus-Infektion humaner und porciner Bronchial-Epithelzellen

Zusammenfassung Das hochpathogene, BSL-4 klassifizierte Nipahvirus (NiV) ist in der Lage, unterschiedliche Säugerspezies zu infizieren, darunter auch das Schwein und den Menschen. In Schweinen kommt es nach der NiV-Infektion zur Ausbildung einer akuten, respiratorischen Erkrankung und das Virus kann über Aerosole auf andere Säugerspezies übertragen werden. Beim Menschen kommt es nur selten zu respiratorischen Symptomen. Das klinische Merkmal einer NiV-Infektion im Menschen ist vornehmlich eine schwere, fiebrige Enzephalitis und die Mortalitätsrate ist im Unterschied zum Schwein sehr hoch. In dieser Promotionsarbeit wurden vergleichenden Untersuchungen zur NiV-Vermehrung und -Ausbreitung in primären, respiratorischen Epithelzellen von Schweinen und Menschen durchgeführt, um den molekularen Mechanismus des unterschiedlichen klinischen Krankheitsbildes aufzuklären. Für die Analysen im Respirationstrakt des Schweines wurden bronchiale Epithelzellen aus Schweinelungen (PBEpC) isoliert und charakterisiert. Für Vergleichsuntersuchungen im humanen Atemwegsepithel wurden kommerziell erhältliche primäre humane Bronchial-Epithelzellen (HBEpC) verwendet. Es wurden vergleichende Infektionsstudien durchgeführt, die den Eintritt und auch die Freisetzung der Viren aus respiratorischen Epithelzellen näher charakterisieren sollten. Es zeigte sich bei diesen Untersuchungen, dass humane Bronchial-Epithelzellen besser und schneller infizierbar waren als porcine Bronchial-Epithelzellen. Weiterhin konnte gefunden werden, das die NiV-Infektion zu einer Erhöhung des viralen Rezeptors (Ephrin B2) führt, was sich begünstigend auf den weiterer Verlauf der Infektion auswirken könnte. Das unterschiedliche Krankheitsbild kann nicht auf Adaptation der Viren beim Übergang vom Schwein auf den Menschen zurückgeführt werden, da die NiV-Isolate, welche von infizierten Schweinen und Menschen isoliert wurden, in ihrer Sequenz identisch sind (AbuBakar, 2003). Deshalb wurden im zweiten Teil dieser Arbeit verschiedene Wirtsfaktoren untersucht, welche für eine effiziente NiV-Vermehrung und -Ausbreitung notwendig sind. Zunächst wurde untersucht, welche Wirtsprotease das Fusionsprotein proteolytisch aktiviert, was eine wichtige Voraussetzung darstellt, damit die virale Membran mit der Wirtszellmembran fusionieren kann und NiV in die Zielzelle gelangt. Zwei Proteasen können für die Prozessierung des Fusionsproteins verantwortlich sein, Cathepsin L und/oder Cathepsin B (Pager et al., 2006 und Diederich et al., 2012). Untersuchungen zur Aktivität der Proteasen in den Bronchial-Epithelzellen und Inhibitorstudien verdeutlichten, dass Cathepsin B bei humanen und porcinen Bronchial-Epithelzellen für die Aktivierung des NiV-Fusionsproteins verantwortlich ist. Als zweiten wichtigen Wirtsfaktor wurde die Expression des viralen Rezeptors (Ephrin B2 und Ephrin B3) untersucht, welche unerlässlich für den Eintritt der Viren und für die Formation von mehrkernigen Riesenzellen (Synzytien) ist. Es zeigte sich, dass im Unterschied zu den porcinen Zellen, die humanen Bronchial-Epithelzellen mehr Ephrin B2- und zusätzlich noch Ephrin B3-mRNA besitzen. Wurde humanes Ephrin B2 in den porcinen Zellen überexprimiert, so resultierte dies in einer Erhöhung der Synzytien-Anzahl und mehr NiV-N-mRNA konnte im Überstand von infizierten porcinen Bronchial-Epithelzellen nachgewiesen werden. Dies lässt darauf schließen, dass eine höhere Rezeptorexpression die NiV-Infektion begünstigt. In nur 30 % der Patienten kam es zu einer respiratorischen Symptomatik, deshalb wurde im dritten Teil der Arbeit untersucht, wie variabel die Ephrin B2-Expression in unterschiedlichen humanen Spendern ist. Dabei zeigte sich, dass sich die Ephrin B2-Level in verschiedenen humanen Bronchial-Epithelzellen unterscheidet und dass in humanen Bronchial-Epithelzellen, welche weniger Ephrin B2 exprimieren auch eine schlechtere NiV-Infektion zu sehen ist. Zusammenfassend lässt sich somit sagen, dass die Ephrin B2-Level maßgeblich für eine effiziente NiV-Infektion verantwortlich sind

Cyclophilin inhibitors restrict Middle East respiratory syndrome coronavirus via interferon-λ in vitro and in mice

While severe coronavirus infections, including Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV), cause lung injury with high mortality rates, protective treatment strategies are not approved for clinical use. We elucidated the molecular mechanisms by which the cyclophilin inhibitors cyclosporin A (CsA) and alisporivir (ALV) restrict MERS-CoV to validate their suitability as readily available therapy in MERS-CoV infection. Calu-3 cells and primary human alveolar epithelial cells (hAECs) were infected with MERS-CoV and treated with CsA or ALV or inhibitors targeting cyclophilin inhibitor-regulated molecules including calcineurin, nuclear factor of activated T-cells (NFATs) or mitogen-activated protein kinases. Novel CsA-induced pathways were identified by RNA sequencing and manipulated by gene knockdown or neutralising antibodies. Viral replication was quantified by quantitative real-time PCR and 50% tissue culture infective dose. Data were validated in a murine MERS-CoV infection model. Both CsA and ALV reduced MERS-CoV titres and viral RNA replication in Calu-3 cells and hAECs, improving epithelial integrity. While neither calcineurin nor NFAT inhibition reduced MERS-CoV propagation, blockade of c-Jun N-terminal kinase diminished infectious viral particle release but not RNA accumulation. Importantly, CsA induced interferon regulatory factor 1 (IRF1), a pronounced type III interferon (IFNλ) response and expression of antiviral genes. Downregulation of IRF1 or IFNλ increased MERS-CoV propagation in the presence of CsA. Importantly, oral application of CsA reduced MERS-CoV replication in vivo, correlating with elevated lung IFNλ levels and improved outcome. We provide evidence that cyclophilin inhibitors efficiently decrease MERS-CoV replication in vitro and in vivo via upregulation of inflammatory antiviral cell responses, in particular IFNλ. CsA might therefore represent a promising candidate for treating MERS-CoV infection

Einfluss von Wirtsfaktoren auf die Nipahvirus-Infektion humaner und porciner Bronchial-Epithelzellen

Zusammenfassung Das hochpathogene, BSL-4 klassifizierte Nipahvirus (NiV) ist in der Lage, unterschiedliche Säugerspezies zu infizieren, darunter auch das Schwein und den Menschen. In Schweinen kommt es nach der NiV-Infektion zur Ausbildung einer akuten, respiratorischen Erkrankung und das Virus kann über Aerosole auf andere Säugerspezies übertragen werden. Beim Menschen kommt es nur selten zu respiratorischen Symptomen. Das klinische Merkmal einer NiV-Infektion im Menschen ist vornehmlich eine schwere, fiebrige Enzephalitis und die Mortalitätsrate ist im Unterschied zum Schwein sehr hoch. In dieser Promotionsarbeit wurden vergleichenden Untersuchungen zur NiV-Vermehrung und -Ausbreitung in primären, respiratorischen Epithelzellen von Schweinen und Menschen durchgeführt, um den molekularen Mechanismus des unterschiedlichen klinischen Krankheitsbildes aufzuklären. Für die Analysen im Respirationstrakt des Schweines wurden bronchiale Epithelzellen aus Schweinelungen (PBEpC) isoliert und charakterisiert. Für Vergleichsuntersuchungen im humanen Atemwegsepithel wurden kommerziell erhältliche primäre humane Bronchial-Epithelzellen (HBEpC) verwendet. Es wurden vergleichende Infektionsstudien durchgeführt, die den Eintritt und auch die Freisetzung der Viren aus respiratorischen Epithelzellen näher charakterisieren sollten. Es zeigte sich bei diesen Untersuchungen, dass humane Bronchial-Epithelzellen besser und schneller infizierbar waren als porcine Bronchial-Epithelzellen. Weiterhin konnte gefunden werden, das die NiV-Infektion zu einer Erhöhung des viralen Rezeptors (Ephrin B2) führt, was sich begünstigend auf den weiterer Verlauf der Infektion auswirken könnte. Das unterschiedliche Krankheitsbild kann nicht auf Adaptation der Viren beim Übergang vom Schwein auf den Menschen zurückgeführt werden, da die NiV-Isolate, welche von infizierten Schweinen und Menschen isoliert wurden, in ihrer Sequenz identisch sind (AbuBakar, 2003). Deshalb wurden im zweiten Teil dieser Arbeit verschiedene Wirtsfaktoren untersucht, welche für eine effiziente NiV-Vermehrung und -Ausbreitung notwendig sind. Zunächst wurde untersucht, welche Wirtsprotease das Fusionsprotein proteolytisch aktiviert, was eine wichtige Voraussetzung darstellt, damit die virale Membran mit der Wirtszellmembran fusionieren kann und NiV in die Zielzelle gelangt. Zwei Proteasen können für die Prozessierung des Fusionsproteins verantwortlich sein, Cathepsin L und/oder Cathepsin B (Pager et al., 2006 und Diederich et al., 2012). Untersuchungen zur Aktivität der Proteasen in den Bronchial-Epithelzellen und Inhibitorstudien verdeutlichten, dass Cathepsin B bei humanen und porcinen Bronchial-Epithelzellen für die Aktivierung des NiV-Fusionsproteins verantwortlich ist. Als zweiten wichtigen Wirtsfaktor wurde die Expression des viralen Rezeptors (Ephrin B2 und Ephrin B3) untersucht, welche unerlässlich für den Eintritt der Viren und für die Formation von mehrkernigen Riesenzellen (Synzytien) ist. Es zeigte sich, dass im Unterschied zu den porcinen Zellen, die humanen Bronchial-Epithelzellen mehr Ephrin B2- und zusätzlich noch Ephrin B3-mRNA besitzen. Wurde humanes Ephrin B2 in den porcinen Zellen überexprimiert, so resultierte dies in einer Erhöhung der Synzytien-Anzahl und mehr NiV-N-mRNA konnte im Überstand von infizierten porcinen Bronchial-Epithelzellen nachgewiesen werden. Dies lässt darauf schließen, dass eine höhere Rezeptorexpression die NiV-Infektion begünstigt. In nur 30 % der Patienten kam es zu einer respiratorischen Symptomatik, deshalb wurde im dritten Teil der Arbeit untersucht, wie variabel die Ephrin B2-Expression in unterschiedlichen humanen Spendern ist. Dabei zeigte sich, dass sich die Ephrin B2-Level in verschiedenen humanen Bronchial-Epithelzellen unterscheidet und dass in humanen Bronchial-Epithelzellen, welche weniger Ephrin B2 exprimieren auch eine schlechtere NiV-Infektion zu sehen ist. Zusammenfassend lässt sich somit sagen, dass die Ephrin B2-Level maßgeblich für eine effiziente NiV-Infektion verantwortlich sind

Activation of the Nipah Virus Fusion Protein in MDCK Cells Is Mediated by Cathepsin B within the Endosome-Recycling Compartment

Diederich S, Sauerhering L, Weis M, et al. Activation of the Nipah Virus Fusion Protein in MDCK Cells Is Mediated by Cathepsin B within the Endosome-Recycling Compartment. Journal of Virology. 2012;86(7):3736-3745.Proteolytic activation of the fusion protein of the highly pathogenic Nipah virus (NiV F) is a prerequisite for the production of infectious particles and for virus spread via cell-to-cell fusion. Unlike other paramyxoviral fusion proteins, functional NiV F activation requires endocytosis and pH-dependent cleavage at a monobasic cleavage site by endosomal proteases. Using prototype Vero cells, cathepsin L was previously identified to be a cleavage enzyme. Compared to Vero cells, MDCK cells showed substantially higher F cleavage rates in both NiV-infected and NiV F-transfected cells. Surprisingly, this could not be explained either by an increased F endocytosis rate or by elevated cathepsin L activities. On the contrary, MDCK cells did not display any detectable cathepsin L activity. Though we could confirm cathepsin L to be responsible for F activation in Vero cells, inhibitor studies revealed that in MDCK cells, cathepsin B was required for F-protein cleavage and productive replication of pathogenic NiV. Supporting the idea of an efficient F cleavage in early and recycling endosomes of MDCK cells, endocytosed F proteins and cathepsin B colocalized markedly with the endosomal marker proteins early endosomal antigen 1 (EEA-1), Rab4, and Rab11, while NiV F trafficking through late endosomal compartments was not needed for F activation. In summary, this study shows for the first time that endosomal cathepsin B can play a functional role in the activation of highly pathogenic NiV

Crystal structure of SARS-CoV-2 main protease provides a basis for design of improved α-ketoamide inhibitors.

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic caused by severe acute respiratory syndrome-coronavirus 2 (SARS-CoV-2) is a global health emergency. An attractive drug target among coronaviruses is the main protease (Mpro, also called 3CLpro) because of its essential role in processing the polyproteins that are translated from the viral RNA. We report the x-ray structures of the unliganded SARS-CoV-2 Mpro and its complex with an α-ketoamide inhibitor. This was derived from a previously designed inhibitor but with the P3-P2 amide bond incorporated into a pyridone ring to enhance the half-life of the compound in plasma. On the basis of the unliganded structure, we developed the lead compound into a potent inhibitor of the SARS-CoV-2 Mpro The pharmacokinetic characterization of the optimized inhibitor reveals a pronounced lung tropism and suitability for administration by the inhalative route

Nipah virus induces two inclusion body populations: Identification of novel inclusions at the plasma membrane.

Formation of cytoplasmic inclusion bodies (IBs) is a hallmark of infections with non-segmented negative-strand RNA viruses (order Mononegavirales). We show here that Nipah virus (NiV), a bat-derived highly pathogenic member of the Paramyxoviridae family, differs from mononegaviruses of the Rhabdo-, Filo- and Pneumoviridae families by forming two types of IBs with distinct localizations, formation kinetics, and protein compositions. IBs in the perinuclear region form rapidly upon expression of the nucleocapsid proteins. These IBperi are highly mobile and associate with the aggresome marker y-tubulin. IBperi can recruit unrelated overexpressed cytosolic proteins but do not contain the viral matrix (M) protein. Additionally, NiV forms an as yet undescribed IB population at the plasma membrane (IBPM) that is y-tubulin-negative but contains the M protein. Infection studies with recombinant NiV revealed that IBPM require the M protein for their formation, and most likely represent sites of NiV assembly and budding. The identification of this novel type of plasma membrane-associated IBs not only provides new insights into NiV biology and may open new avenues to develop novel antiviral approaches to treat these highly pathogenic viruses, it also provides a basis for a more detailed characterization of IBs and their role in virus assembly and replication in infections with other Mononegavirales

Protective CD8+ T Cell Response Induced by Modified Vaccinia Virus Ankara Delivering Ebola Virus Nucleoprotein

The urgent need for vaccines against Ebola virus (EBOV) was underscored by the large outbreak in West Africa (2014–2016). Since then, several promising vaccine candidates have been tested in pre-clinical and clinical studies. As a result, two vaccines were approved for human use in 2019/2020, of which one includes a heterologous adenovirus/Modified Vaccinia virus Ankara (MVA) prime-boost regimen. Here, we tested new vaccine candidates based on the recombinant MVA vector, encoding the EBOV nucleoprotein (MVA-EBOV-NP) or glycoprotein (MVA-EBOV-GP) for their efficacy after homologous prime-boost immunization in mice. Our aim was to investigate the role of each antigen in terms of efficacy and correlates of protection. Sera of mice vaccinated with MVA-EBOV-GP were virus-neutralizing and MVA-EBOV-NP immunization readily elicited interferon-γ-producing NP-specific CD8+ T cells. While mock-vaccinated mice succumbed to EBOV infection, all vaccinated mice survived and showed drastically decreased viral loads in sera and organs. In addition, MVA-EBOV-NP vaccinated mice became susceptible to lethal EBOV infection after depletion of CD8+ T cells prior to challenge. This study highlights the potential of MVA-based vaccines to elicit humoral immune responses as well as a strong and protective CD8+ T cell response and contributes to understanding the possible underlying mechanisms

Protective CD8+ T Cell Response Induced by Modified Vaccinia Virus Ankara Delivering Ebola Virus Nucleoprotein

The urgent need for vaccines against Ebola virus (EBOV) was underscored by the large outbreak in West Africa (2014–2016). Since then, several promising vaccine candidates have been tested in pre-clinical and clinical studies. As a result, two vaccines were approved for human use in 2019/2020, of which one includes a heterologous adenovirus/Modified Vaccinia virus Ankara (MVA) prime-boost regimen. Here, we tested new vaccine candidates based on the recombinant MVA vector, encoding the EBOV nucleoprotein (MVA-EBOV-NP) or glycoprotein (MVA-EBOV-GP) for their efficacy after homologous prime-boost immunization in mice. Our aim was to investigate the role of each antigen in terms of efficacy and correlates of protection. Sera of mice vaccinated with MVA-EBOV-GP were virus-neutralizing and MVA-EBOV-NP immunization readily elicited interferon-γ-producing NP-specific CD8+ T cells. While mock-vaccinated mice succumbed to EBOV infection, all vaccinated mice survived and showed drastically decreased viral loads in sera and organs. In addition, MVA-EBOV-NP vaccinated mice became susceptible to lethal EBOV infection after depletion of CD8+ T cells prior to challenge. This study highlights the potential of MVA-based vaccines to elicit humoral immune responses as well as a strong and protective CD8+ T cell response and contributes to understanding the possible underlying mechanisms