Membrane Cholesterol Regulates Lysosome-Plasma Membrane Fusion Events and Modulates Trypanosoma cruzi Invasion of Host Cells

Trypanosoma cruzi, is the etiological agent of a neglected tropical malady known as Chagas' disease, which affects about 8 million people in Latin America. 30–40% of affected individuals develop a symptomatic chronic infection, with cardiomyopathy being the most prevalent condition. T. cruzi utilizes an interesting strategy for entering cells: T. cruzi enhances intracellular calcium levels, which in turn trigger the exocytosis of lysosomal contents. Lysosomes then donate their membrane for the formation of the parasitophorous vacuole. Membrane rafts, cholesterol-enriched microdomains in the host cell plasma membrane, have also been implicated in T. cruzi invasion process. Since both plasma membrane and lysosomes collaborate in parasite invasion, we decided to study the importance of these membrane domains for lysosomal recruitment and fusion during T. cruzi invasion into host cells. Our results show that drug dependent depletion of plasma membrane cholesterol changes raft organization and induces excessive lysosome exocytosis in the earlier stages of treatment, leading to a depletion of lysosomes near the cell cortex, which in turn compromises T. cruzi invasion. Based on these results, we propose that cholesterol depletion leads to unregulated exocytic events of pre-docked lysosomes, reducing lysosome availability at the cell cortex and consequently compromising T. cruzi infection

Lengua vulgar dialectal – Seseo gallego-portugués

Conjunto de 30 fichas formado por 1 separador y 29 fichas que forman unidad. El separador, de cartulina y color azul, lleva por título “Seseo gallego portugués”, orlado en verde. Se aporta información acerca del seseo portugués y del reajuste de las sibilantes en esta lengua, que desde el siglo XVI empezó a confundir “s” inicial y “ss” con “ç”, y “s” intervocálica con “z”, aunque se documentan áreas de distinción en las regiones históricas de Tras-os-Montes (noreste), Entre Douro e Minho (noroeste) y Beira occidental. Se documenta posible caso de ceceo en el Algarve y sur de Portugal. El conjunto trata sobre la distinción entre “s” sorda y sonora (así como la distinción entre interdental sorda y dental sonora) en las localidades cacereñas, cercanas a la frontera con Portugal, de Eljas, San Martín de Trevejo y Valverde del Fresno (documentado por Santos Agero), sobre la distinción de “s” y “z” en Miranda de Duero, sobre el topónimo “Cerdeira”, y sobre la convivencia de la “s” cóncava y la “s” convexa en San martín de Trevejo, como región de contacto. Las fichas 2-3, dobladas en cuatro una dentro de otra y con información por recto y vuelto, constituyen una carta mecanografiada por el filólogo portugués Manuel de Paiva Boléo fechada en Coimbra el 6 de mayo de 1942, con información requerida por Pidal acerca de la pronunciación de “s”, “ç”, “ss” y “c” en las “freguesias” de los “concelhos” de Almeida, Sabugal e Ílhavo (la ficha 3 viene numerada con un “3”, el vuelto de la ficha 2 y el recto de la 3 contienen anotaciones a lápiz de Pidal, y el vuelto de la ficha 3 anotaciones del propio Boléo). La ficha 4 es un mapa de Portugal (dibujado por Pidal) que representa las áreas dialectales del portugués, tomado de un mapa de José Leite de Vasconcelos impreso en: Soares, J. (1934): “Novo atlas escolar português” (2ª edición). Dimensiones del documento: 25,3 cm de alto x 13,2 cm de ancho. La ficha 8 es un fragmento de papel en el que Pidal anota dos preguntas dirigidas a Paiva de Boléo (referidas a la extensión de la “s” cóncava y al área de la distinción arcaica entre “s” y “ç” en Portugal) y una a Armando de Lacerda (sobre el ceceo en el sur de Portugal). Las fichas 9-11 han sido reutilizadas para el recto, además, los epígrafes de todas ellas vienen orlados en verde. Sobre la extensión del área portuguesa donde se distinguen “s” y “ç”, sobre el ceceo en Algarve o sur de Portugal y sobre la extensión de la “s” cóncava, desde Pombal hasta el norte peninsular. Las fichas 12-14 están pegadas por la esquina inferior derecha (las fichas 12 y 13 están escritas por las dos caras). Se documenta información acerca del seseo en Portugal y se exponen brevemente las realizaciones fonéticas de las grafías portuguesas: “s” inicial, “ss”, “ç”, “z” y “s” intervocálica, a comienzos del siglo XX, según Gonçalves Viana. También se pregunta por la existencia de ceceo en el Algarve. La ficha 15 es un mapa de la península ibérica (dibujado por Pidal y con notas) que muestra la zona de seseo en Portugal y Galicia, según el criterio de Navarro Tomás. En la esquina inferior derecha está dibujado un mapa en proporciones más pequeñas de la mitad norte de Portugal donde se distingue el área del seseo con “s” cóncava (más castellano-vasca) del área del seseo con “s” convexa (más lisbonense), según José Leite de Vasconcellos. Dimensiones del documento: 20,5 cm de alto x 26,3 cm de ancho. La ficha 16 es una carta mecanografiada por el filólogo portugués Santos Agero fechada en Lisboa el 6 de marzo de 1941, sobre la extensión de la “s” cóncava en Portugal. La ficha 17 contiene apuntes de Pidal en los que informa del infructuoso intento de solicitar informes sobre el seseo portugués al filólogo Rodrigo de Sá Nogueira, a quien Pidal escribió el 18 de julio de 1938. La ficha 20 es una carta mecanografiada por Rodrigo de Sá Nogueira, por las dos caras, fechada en Lisboa el 2 de agosto de 1938, que contiene la vaga respuesta que el filólogo portugués dio a Pidal acerca del tema expuesto arriba. La ficha 18 trata sobre el seseo en Galicia (observado como vulgarismo), en Portugal (donde se distingue la “s” apical al norte y la “s” dorsal al sur, tomando el río Mondego como frontera, y de nuevo se define el área de distinción ubicada al norte, en las regiones próximas a la frontera), en Francia (se da noticia de la “s” apical francesa que domina todo el sur del país galo, y se menciona a Suzanne Dobelmann, quien aportó los datos precisos sobre este fenómeno a Pidal, tal y como se recoge en el conjunto anterior “Lengua vulgar dialectal – “S” apical, seseo y “h-” aspirada. Catalán”) y en Extremadura (se documenta la zona seseante de Fuente del Maestre, según Navarro Tomás). Las fichas 22, 24-28 están escritas por Rafael Lapesa, como así lo indican las notas a lápiz de Pidal (las fichas 24-26 están escritas por las dos caras). Tratan sobre la pronunciación de la “j” gallega (generalmente como africada sorda, pero también realizada con fricación en algunas regiones) y el seseo gallego, y se recogen datos acerca de las particularidades fonéticas en ciudades portuguesas ubicadas en la zona noroccidental del país (datos que aparecerán representados en el mapa de la ficha 28). Además, las fichas 25-27 están envueltas por la ficha 28, doblada en cuatro, que consiste en un mapa de Galicia y la zona noroccidental de Portugal (dibujado por Lapesa y con notas de Pidal) en el que se marcan con diferente color las ciudades que sesean con “s” apical, las que confunden “s” y “ç”, “z” sin distinción de sorda y sonora etimológicas, las que confunden “ss” y “ç”, y “s” y “z” con diferencia etimológica entre sorda y sonora, las que distinguen entre “s” y “z”, “c” sin conservación de sonora etimológica, y las que distinguen entre “ss” y “ç”, y entre “s” y “z” sonoras. Dimensiones del documento: 22,6 cm de alto x 16,2 cm de ancho. La ficha 28, además, lleva escrita en el vuelto una nota a lápiz de Pidal que dice: “De Lapesa”. La ficha 29 es un mapa de la península ibérica (dibujado por Pidal y con notas suyas) en el que se han trazado varias isoglosas: la que separa el área de la aspiración de la “h-” inicial de aquella en que la “h” es muda, la que separa el área que distingue “s” y “z” de aquellas donde no hay distinción, y la que delimita el área de la “s” coronal al norte. Dimensiones del documento: 19,4 cm de alto x 25,5 cm de ancho. El mapa contiene las siguientes referencias: Vasconcellos, J. L. de y Gonçalves Viana, A. R. (1897): “Mappa dialectologico do continente português” – Ferreira-Deusdado, M. A. (1893): “Chorographia de Portugal” – Remédios, J. M. dos (1898): “Introdução à história da literatura portuguesa” – Vasconcellos, J. L. de (1929): “Opúsculos”, tomo IV: “Filologia. Parte II”. Referencias bibliográficas: Vasconcellos, J. L. de (1911): “Lições de philologia portuguesa” – Vasconcellos, J. L. de (1900): “Estudos de philologia mirandesa”, tomo I – Vasconcellos, J. L. de (1901): “Esquisse d’une dialectologie portugaise” – Serra Frazão, F. S. (1938): “Apontamentos da linguagem popular: Vocabulos. A geografia da linguagem dos serranos. Pronúncias”, en “Revista Lusitana”, tomo XXXVI, pp. 310-314 – Nunes, J. J. (1930): “Compêndio de gramática histórica portuguesa (fonética e morfologia)” (2ª edición) – Gonçalves Viana, A. R. (1883): “Essai de phonétique et de phonologie de la langue portugaise d’après le dialecte actuel de lisbonne”, en “Romania”, tomo XII, nº 45, pp. 29-98 – Gonçalves Viana, A. R. (1892): “Exposição da pronúncia normal portuguesa para uso de nacionais e estrangeiros” – Navarro Tomás, T., Espinosa, A. M. y Rodríguez Castellano, L. (1933): “La frontera del andaluz”, en “Revista de Filología Española”, tomo XX, pp. 225-277 – Menéndez Pidal, R. (1906): “El dialecto leonés”, en “Revista de Archivos, Bibliotecas y Museos”, tomo XIV, pp. 128-172 y 294-311 – Vasconcellos, J. L. de (1933): “Português dialectal da região de Xalma (Hespanha)”, en “Revista Lusitana”, tomo XXXI, pp. 164-275 – Fink, O. (1929): “Studien über die Mundarten der Sierra de Gata” – Entwistle, W. J. (1936): “The Spanish Language” – García de Diego, V. (1909): “Elementos de gramática histórica gallega” – Santiago y Gómez, J. de (1918): “Filología de la lengua gallega” – Vasconcellos, J. L. de (1928): “Opúsculos”, tomo II: “Dialectología. Parte I

Cristales y minerales

[ES] Trata sobre la formación de los minerales y la cristalografía.[EN] This work is about the minerals and the crystallography

Treatment with MβCD leads to changes in membrane raft organization of cardiomyocytes.

<p>Confocal images of control (A) and cardiomyocytes pre-treated with 10 mM MβCD (B) or HγCD (C). Cells were washed, fixed and then labeled with CTXb-Alexa 488, which recognizes GM1, a raft marker. In comparison to control cells, which show a homogenous strong labeling for GM1, cholesterol-depleted cardiomyocytes reveals a more discrete labeling. Cells treated with HγCD show GM1 labeling similar to control cells whereas cholesterol-replenished cells (D) exhibit both patterns of cholesterol-depleted (arrows) as well as control (asterisks) GM1 labeling. Scale bar: 0.9 µm.</p

Lysosomal exocytosis events after cholesterol depletion are not due to cell death.

<p>After treatment with MβCD or HγCD, in the absence (white bars) or presence (black bars) of calcium, cardiomyocytes were trypsinized, collected and incubated with HFS solution, containing propidium iodide (PI). Cells that became inviable after drug treatment acquired PI labeling in their nuclei due to membrane permeability, and were counted as dead cells by flow cytometer. Data are shown as mean of triplicates ±SD.</p

<i>T. cruzi</i> invasion of cells and association with LAMP-1 in cardiomyocytes decreases after cholesterol depletion.

<p>Cardiomyocytes pre-treated or not with different cyclodextrins were washed and challenged with <i>T. cruzi</i> trypomastigotes at a M.O.I of 50, for 40 minutes at 37°C, then fixed and processed for immunofluorescence detection of total intracellular parasites, as well as intracellular parasites associated with LAMP-1 (a lysosomal marker). Both <i>T. cruzi</i> internalization (A) and association with host LAMP-1 (B) diminishes after incubation with 10 and 15 mM of MβCD but not after treatment with 10 and 15 mM of HγCD. Cholesterol replenishment after treatment with 15 mM MβCD reverts the effect of the drug on parasite cell invasion (A), and at least partially on LAMP-1 association (B). The average number of cardiomyocytes ±SD per 10 counted fields in each coverslip is shown above the bars (A). Data are shown as mean of triplicates ±SD. Asteriks indicate statistically significant differences (p < 0.05, Student's t test) between control and treated cells. (C) Representative panels of <i>T. cruzi</i> invasion and association with host cell lysosomes, revealed by immunocytochemistry. Total cell and parasite nuclei, as well as parasite kinteoplast DNA were labeled with DAPI; lysosomes were labeled with anti-LAMP 1 antibody followed by secondary IgG labeled with Alexa Fluor 488; extracellular parasites in the field were labeled with anti-<i>T.cruzi</i> antibody followed by secondary IgG labeled with Alexa Fluor 546. From top to bottom: control cells, 15 mM MβCD treated cells, 15 mM HγCD treated cells and 15 mM MβCD treated cells followed by incubation with 0.05 mM of WSC. Blue arrows show total <i>T. cruzi</i> trypomastigotes in the field, yellow ellipsoids show lysosomal associated trypomastigotes, red triangles points out extracellular trypomastigotes and the last column shows the merge of the three previous. Scale bar: 10 µm.</p

Cholesterol depletion leads to changes in lysosomal distribution within cells.

<p>Representative panels of lysosomal distribution in control cardiomyocyte (A) and cardiomyocytes pre-treated either with 10 mM (B) or 15 mM MβCD (C), 10 mM or (D) 15 mM HγCD (E), or 15 mM MβCD followed by 0.05 mM WSC (F). MβCD treated cardiomyocytes show significant changes in lysosomal dispersion in cell cytoplasm. After drug treatment, cells were washed and incubated with <i>T. cruzi</i> TCTs, M.O.I. of 50 parasites per cell for 40 minutes at 37°C. After cell invasion, cells were washed, fixed and immunostained for LAMP-1 (green) DAPI (blue) and analyzed under fluorescence microscope. In comparison to untreated cardiomyocytes (A), which exhibit homogenous and well distributed LAMP-1 labeling, MβCD treated cardiomyocytes, (B) and (C), show a heterogeneous LAMP-1 labeling with lysosomes localized predominantly near cell nuclei. On the other hand, HγCD treated cardiomyocytes and cholesterol-replenished cells, (E), (F) and (D), present lysosomal distribution similar to control cells. Scale bar: 10 µm.</p

MβCD treatment is effective in sequestering cholesterol from the plasma membrane.

<p>(A) Control, (B) 15 mM MβCD treated and (C) 15 mM MβCD followed by 0.05 mM WSC treated cardiomyocytes show significant changes in Filipin labeling. Cholesterol-depleted cells (B) reveal very little Filipin labeling, whereas cholesterol-replenished cells show strong labeling for cholesterol, similar to control cells. (D) Cardiomyocytes treated with 5, 10 or 15 mM of MβCD reveal a substantial decrease in Filipin labeling in a dose-dependent manner whereas cholesterol replenishment with 0.05 mM of WSC returns Filipin fluorescence to control values. Normalized data are shown as mean of triplicates ±SD. Asteriks indicate statistically significant differences (* p < 0.05 and ** p < 0.01, One way ANOVA followed by Newman-Keuls) between control and treated cells. Scale bar: 10 µm.</p