Febre Q: do diagnóstico à investigação ecoepidemiológica de Coxiella burnetii no contexto da infeção humana

Objetivo: A escassa informação disponível sobre o panorama etiológico e padrão epidemiológico nacional da febre Q, face ao seu crescente interesse no contexto europeu, levou à submissão de um projeto de investigação sobre o tema, que teve início em abril de 2011 com o apoio da Fundação para a Ciência e a Tecnologia (refª PTDC/SAUSAP/115266/2009). Constituíram objetivos principais do estudo: 1) analisar os casos de febre Q para melhor caraterizar o contexto epidemiológico e clínico da doença aguda e crónica; 2) caraterizar a diversidade genética do agente etiológico como potencial fator de virulência; 3) obter uma coleção de isolados de C. burnetii da população portuguesa e caraterizar o padrão de suscetibilidade aos antibióticos; 4) averiguar potenciais fatores de risco associados à transmissão de C. burnetii em Portugal. Neste artigo são resumidos os principais resultados obtidos até ao momento.Fundação para a Ciência e a Tecnologi

Mobile banking adoption in peripheral countries : the case of Portugal

The present study originates from the theme of innovation, more specifically the innovation of the business model. Over the past few years, business models have gained increasing importance in business and academia because of their extreme importance to the success of any company or entity. In the financial and banking industry, technology has been evolving without any precedents, so banks seek to develop and innovate their business models in order to contribute positively to consumer expectations. Mobile bankig is a successful example. However, a question arises on the demand side, is the consumer ready to adopt such innovation from the banks? This investigation seeks therefore to understand the factors that may explain the adoption of mobile banking as being a bank innovation. To verify the importance of the dimensions of the model, a quantitative exploratory study was carried out through the application of a questionnaire given to adult individuals with a bank account in Portugal. A research model was created resulting from the combination of the variables identified in the Diffusion of Innovation theory, with the variables of perceived risk and personal innovativeness. The results show that the adoption of mobile banking is supported by relative advantage, compatibility, perceived risk and, finally, personal innovativeness

The impact of politics in a call center: a moderated mediation of burnout, job commitment and justice sensativity.

This work aims to study the effect of Perceived Organizational Politics on Affective Commitment and the mediating and moderating processes through which this relationship occurs. Based on a sample of Call Center workers it was tested whether Burnout mediated the relationship between Perceived Organizational Politics (POP) and Affective Commitment. Results showed that Burnout does mediate that relationship. It was also studied whether Justice Sensitivity (JS) moderates the mediated relationship such that this relationship is stronger when JS is higher. This moderator effect was confirmed. However, this moderator effect wasn’t found to strengthen the relationship between POP and Affective Commitment through Burnout

Cannabis sativa e o seu uso medicinal

Trabalho Final de Mestrado Integrado, Ciências Farmacêuticas, 2022, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.Introdução: Cannabis sativa L. tem sido cultivada ao longo dos séculos pela sua vasta gama de aplicações, nomeadamente, como fonte de matéria-prima, para fins recreativos e religiosos e pelas suas propriedades medicinais. O presente trabalho tem como objetivo avaliar a utilidade do uso de Cannabis sativa flos e seus principais metabolitos secundários no tratamento do cancro, inflamação e dor através de uma revisão da literatura científica disponível. Métodos: Foi realizada uma pesquisa bibliográfica nas bases de dados PubMed, Cochrane e Web of Science, utilizando como palavra-chaves “cannabis sativa” AND “inflammation” / OR “cancer” / OR “pain”, no período temporal de 1 de janeiro de 2017 e 31 de dezembro de 2021. A metodologia PRISMA foi utilizada para selecionar os artigos científicos a serem considerados. Resultados: De um número inicial de 2664 estudos, aplicando os critérios de inclusão e exclusão definidos, foram considerados 26 estudos científicos, realizados essencialmente a nível pré-clínico, sendo 10 estudos relativos a atividade antitumoral in vitro; 10 visando a atividade anti-inflamatória in vitro e in vivo; e, relativamente à atividade na dor, 4 estudos in vitro e in vivo, 1 brief report e 1 estudo clínico piloto. Os resultados pré-clínicos mostraram a atividade antitumoral de C. sativa, flor em células tumorais de cancro da próstata, cérebro, pele, mama, pulmão, fígado e colorretal, tendo também o seu principal constituinte marcador, o canabidiol (CBD), demostrado este tipo de atividade. Na inflamação aguda, COVID-19, neuroinflamação e inflamação induzida por Cutibacterium acnes, preparações e constituintes de C. sativa flor mostraram atividade inibitória de moléculas pró-inflamatórias. No entanto, um extrato rico em CBD provocou um aumento das moléculas pró-inflamatórias, em modelo de inflamação intestinal e de COVID-19. Um efeito sinérgico foi observado, in vivo, para o Δ9-tetrahydrocannabinol (THC), com a administração de gabapentina, tendo-se verificado um aumento da janela terapêutica, potência e eficácia deste constituinte na redução da dor neuropática. Diferentes tipos de administração de C. sativa, flor, como a intraperitoneal, oral e a absorção bucal, produziram efeitos notórios na redução da dor. A absorção bucal mostrou particular interesse, pois permitiu eliminar o efeito colateral amnésico do THC. Conclusões: Apesar dos dados existentes são ainda necessários mais estudos pré-clínicos e clínicos paIntroduction: Cannabis sativa L. has been cultivated over the centuries for its wide range of applications, namely, as a source of feedstock, for recreational and religious purposes and for its medicinal properties. The present work aims to assess the usefulness of the use of Cannabis sativa flower and its constituent indicators in the treatment of cancer, inflammation and pain through a review of the available scientific literature. Methods: A bibliographic search was carried out in the PubMed, Cochrane and Web of Science databases, using the keyword “cannabis sativa” AND “inflammation” / OR “cancer” / OR “pain” and the time period of January 1, 2017 and December 31, 2021. The PRISMA methodology was used to select the scientific articles to be considered. Results: From an initial number of 2664 studies, applying the defined inclusion and exclusion criteria, 26 scientific studies were considered, carried out essentially at a pre-clinical level, of which 10 are related to in vitro antitumor activity; 10 are related to in vitro and in vivo anti-inflammatory activity; and, relating to pain activity, 4 in vitro and in vivo studies, 1 brief report and 1 pilot clinical study. Pre-clinical studies showed the antitumor activity of C. sativa, flower in prostate, brain, skin, breast, lung, liver and colorectal cancer tumor cells, also having its main marker constituent, cannabidiol (CBD), demonstrated this type of activity. In acute inflammation, COVID-19, neuroinflammation and Cutibacterium acnes-induced inflammation, C. sativa flower extracts and compounds down-regulated pro-inflammatory molecules. However, a CBD-rich extract caused an increase in pro-inflammatory molecules in a model of intestinal inflammation and COVID-19. A synergistic effect was observed, in vivo, for THC (Δ9-tetrahydrocannabinol) with the administration of gabapentin, with an increase in the therapeutic window, potency and efficacy of this constituent in reducing neuropathic pain. Different types of administration of C. sativa, flor, such as intraperitoneal, oral and buccal absorption, have produced remarkable effects in reducing pain. Oral absorption showed particular interest, as it allowed to eliminate the amnesic side effect of THC. Conclusions: Despite the existing data, more preclinical and clinical studies are still needed to confirm the concrete therapeutic utility of C. sativa flor

Anaplasma phagocytophilum and human granulocytic anaplasmosis in Portugal

Anaplasma phagocytophilum e anaplasmose granulocítica têm vindo a merecer um crescente interesse na comunidade científica, facto demonstrado pelo crescente número de publicações que surgiram nas duas últimas décadas, particularmente desde que foram documentados os primeiros casos de anaplasmose granulocítica humana (AGH). O reconhecimento da importância de A. phagocytophilum em termos de Saúde Pública na América do Norte e na Europa, associado à recente detecção do agente em Portugal, pôs em evidência a necessidade de estudos mais detalhados sobre a emergência deste Anaplasmataceae e de AGH no nosso país. Inicialmente baseado num treino metodológico em Unidades de Investigação especializadas em Anaplasmataceae, o presente trabalho permitiu a transferência da tecnologia correntemente aplicada ao estudo de A. phagocytophilum e consequentemente o desenvolvimento desta linha de investigação no Centro de Estudos de Vectores e Doenças Infecciosas, Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge (CEVDI/INSA). Ao estabelecer as bases para um estudo concertado em A. phagocytophilum e AGH, este trabalho tornou possível uma abordagem abrangente a aspectos essenciais da ecobiologia deste Anaplasmaceae e da doença que lhe está associada, focando-se na identificação de potenciais ixodídeos vectores, de mamíferos envolvidos no ciclo natural do agente, quer como reservatórios quer como hospedeiros susceptíveis, recolhendo evidências que apontam para a possibilidade de exposição do homem a este agente em Portugal. Os estudos levados a cabo nos ixodídeos demonstram o envolvimento de duas espécies de Ixodes no ciclo de A. phagocytophilum, concretamente Ixodes ricinus na Ilha da Madeira e I. ventalloi no continente. A detecção de ADN do agente em I. ricinus vem reforçar estudos anteriores, sugerindo a sua persistência na Ilha da Madeira. Esta tese acrescenta ainda um novo dado ao conhecimento da história natural de A. phagocytophilum, com a primeira detecção de infecção em I. ventalloi. O facto de alguns dos artrópodes infectados terem sido obtidos a partir de gatos domésticos, não só acrescenta este mamífero à lista nacional de hospedeiros vertebrados parasitados por I. ventalloi mas sugere também o seu potencial envolvimento no ciclo de transmissão de A. phagocytophilum. A análise molecular dos dados obtidos evidencia ainda a existência de diferentes genótipos deste Anaplasmaceae nos ixodideos portugueses. As sequências nucleotídicas obtidas sugerem a proximidade genética entre A. phagocytophilum detectado em I. ricinus na Ilha da Madeira e estirpes isoladas de humanos na América do Norte, bem como de sequências detectadas na Europa Central e do Norte. No entanto estes genótipos divergem das sequências nucleotídicas obtidas a partir do I. ventalloi no continente, que representa um novo genótipo de patogenia não determinada.São também apresentadas evidências serológicas da exposição a A. phagocytophilum ou a outro agente antigenicamente semelhante em ratinhos Mus spretus, cavalos e canídeos domésticos no continente. A análise molecular das amostras biológicas obtidas a partir das populações em estudo permitiu a detecção da primeira infecção activa por A. phagocytophilum em vertebrados portugueses, com a identificação de ADN do agente num dos cavalos seropositivos. Sendo as sequências nucleotídicas obtidas semelhantes à das estirpes associadas aos casos de infecção em humanos, é reforçada uma vez mais a possibilidade de AGH ocorrer em Portugal. Esta tese refere ainda a identificação de outra Anaplasmataceae filogenicamente próxima de A. phagocytophilum - A. platys, detectada em canídeos seropositivos, evidenciando a possibilidade de ocorrerem reacções cruzadas entre estes dois agentes. Estes dados salientam a importância da vigilância em termos veterinários da ocorrência não só de anaplasmose granulocítica mas também de trombocitopénia cíclica infecciosa canina como causa de doença associada a ixodídeos em Portugal. Para averiguar a possibilidade de exposição humana a A. phagocytophilum foram realizados estudos serológicos e moleculares retrospectivos e prospectivos, em amostras biológicas recebidas no CEVDI/INSA durante 2000-2006 para o diagnóstico laboratorial de pacientes com suspeita de doença associada a ixodídeos. Os resultados provam a existência de reacções serológicas positivas na população estudada, incluindo alguns casos que satisfazem os critérios serológicos para definição de AGH, embora sem evidência de infecção activa. Adicionalmente, alguns dos doentes seropositivos apresentaram evidência de infecção causada por outros agentes transmitidos por ixodídeos ou por bactérias relacionadas, nomeadamente borreliose de Lyme, febre Q e bartonelose. Embora estes resultados possam ser interpretados como falsos positivos resultantes de reacções cruzadas, a possibilidade de se tratarem de co-infecções ou exposições anteriores a vários agentes transmitidos por ixodídeos do género Ixodes também deverá ser considerada. Em suma, estes resultados apontam para a necessidade de desenvolver o diagnóstico de A. phagocytophilum, nomeadamente no que diz respeito à aplicação de técnicas directas de detecção do agente, bem como à integração dos dados do diagnóstico laboratorial em casos de suspeita de doença associada a Ixodes spp. Embora muitos dos aspectos focados neste trabalho requeiram uma investigação mais detalhada, esta tese contribui positivamente para a compreensão das questões fundamentais relacionadas com a ocorrência de A. phagocytophilum e o seu potencial como agente de doença em Portugal. Termina-se com a esperança de que estes primeiros passos ajudem a delinear novas linhas de investigação no âmbito do estudo da anaplasmose granulocítica e outras doenças emergentes associadas a espécies do género Ixodes.Anaplasma phagocytophilum and granulocytic anaplasmosis are of increasing interest to the scientific community as indicated by the expanding number of reports published in the past two decades, and especially since the emergence of the first cases of human granulocytic anaplasmosis (HGA). The growing recognition of the Public Health importance of A. phagocytophilum in North America and in Europe, along with its recent detection in Portugal has signalled the need for more detailed studies that address the emergence of HGA and its causative agent in our country. Initially based on an methodological training in research units dedicated to Anaplasmataceae, this work enabled the transfer of technology as currently applied to A. phagocytophilum research and made possible the development of a new line of investigation at Centro de Estudos de Vectores e Doenças Infecciosas, Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge (CEVDI/INSA). By establishing the foundations for concerted study on A. phagocytophilum and HGA, the work described herein has facilitated development of a broad approach toward fundamental issues in Anaplasmataceae ecobiology and disease by focusing attention on identification of potential ixodid vectors, mammals likely to be involved in the infectious agent’s life cycles either as reservoirs or affected hosts, and garnered the evidence indicating the potential for human exposure in Portugal. The studies conducted in ixodid ticks proves the involvement of two Ixodes species in A. phagocytophilum cycles, including Ixodes ricinus on Madeira Island and I. ventalloi on the mainland. The detection of A. phagocytophilum DNA in I. ricinus reinforces prior studies and suggests its persistence on Madeira Island. This thesis also adds new data to the understanding of the natural history of A. phagocytophilum by providing the first evidence of infections in I. ventalloi ticks. The fact that some infected arthropods infest domestic cats not only mandates the inclusion of these mammals on the national list of vertebrate hosts parasitized by I. ventalloi ticks, but also shows their potential complicity in A. phagocytophilum maintenance. Moreover, molecular data shows the existence of A. phagocytophilum variant genotypes in Portuguese ticks. Partial gene sequences from infected ticks demonstrates nucleotide polymorphisms that support a close relationship of A. phagocytophilum on Madeira Island I. ricinus to North American strains isolated from humans as well as genotypes detected in Central and Northern Europe. Yet, these variants diverge from those found in mainland I. ventalloi, which represents a new genotype of undetermined pathogenicity. Serological evidence of exposure to A. phagocytophilum or a close related agent is shown in Mus spretus mice, horses, and dogs in mainland. Molecular analysis of biological samples from these animal populations provides the first definitive evidence of A. phagocytophilum active infection in Portuguese vertebrates with detection of its DNA in one seropositive horse from mainland Portugal, where the A.phagocytophilum genotype found is closely related to strains isolated from humans, suggesting the potential for HGA in Portugal. This thesis further extends study to identification of another closely related Anaplasma species, and its potential for serological cross-reactions with A. phagocytophilum, as evident with the detection of A. platys DNA in seropositive dogs. These data also underscore the importance of veterinarians maintaining vigilance for detection of not only granulocytic anaplasmosis but also canine infectious cyclic thrombocytopenia as causes of tick-borne diseases in Portugal. Both prospective and retrospective serological and molecular investigations of human exposure to A. phagocytophilum were performed on samples received at CEVDI/INSA for the laboratory diagnosis of patients with suspected tick-borne diseases during 2000-2006. The results provide evidence for seropositive Portuguese patients, including cases that fulfil serological criteria for HGA, although active infections were not detected. Moreover some seropositive patients had additional evidence of other tick-borne agents or related bacteria infections, including Lyme borreliosis, Q fever and bartonellosis. Although possibly false positive cross-reactions to shared antigens, these reactions potentially could be the result of active dual infections, or past exposure to several agents transmitted by Ixodes species. Overall, these results argue for continued development of improved A. phagocytophilum diagnostics, especially direct detection techniques, and integrated analysis of diagnostic tests for patients with suspected Ixodes-borne disease. Although many aspects introduced and explored here will require expanded and more detailed investigations, this thesis contributes positively to a fundamental understanding of the extent to which A. phagocytophilum occurs in Portugal and its potential as a disease agent. It is hoped that these beginning studies will help to delineate new lines of research that more fully address granulocytic anaplasmosis and other emerging Ixodes-borne diseases

Polylactic acid 3D scaffolds as platforms for local-delivery and hyperthermia applications in bone tumours

The bone is one of the most frequent target sites of metastases. Presently, treatment management has a variety of limitations that need to be replaced by more effective strategies. In this context, three-dimensional (3D) printed scaffolds can be an adjuvant local therapy for bone metastases as well as accomplish several biological and mechanical requirements for bone regeneration with the additional possibility of design the architecture of the scaffold according to the patient’s needs. In this study, 3D-printed PLA scaffolds were multifunctionalized with: i) collagen (Col) and hydroxyapatite nanoparticles (nHA) aiming the promotion of bone regeneration, ii) magnetic nanoparticles (MNs) for magnetic hyperthermia purposes against bone tumour cells and iii) minocycline (MH) to prevent bone infection. The physicochemical properties, in vitro swelling ability, drug (MH) release, bioactivity, magnetic heating properties, antimicrobial properties and cell response of functionalized PLA scaffolds were investigated. Results showed that scaffolds were obtained with uniform square macroporous and a stable functionalization. Also, a properly low swelling ability for bone regeneration and bioactive properties specially with the presence of nHA was attained. MH functionalization resulted into an efficient antibacterial activity against Staphylococcus aureus, a pathogen often associated with bone-related infections, that was coupled with an adequate drug release profile leading to an effective prevention of bone infection. PLA scaffolds revealed to be no cytotoxic for cells (MG-63 osteoblasts) and had a higher osteogenic potential when loaded with nHA. SPIONs demonstrated magnetic heating ability, however at the tested concentrations did not reached hyperthermia temperatures (40-45ºC). Therefore, multifunctionalized 3D printed PLA scaffolds showed to be a promising strategy for bone regeneration associated with infection prevention and bone cancer treatment with the need to improve on the magnet heating ability of MNs to advance bone tumours management

Ixodes ventalloi Gil Collado, 1936: A Vector Role to be Explored

Ixodes Latreille, 1795 is the largest and broadest distributed genus of the family Ixodidae Murray, 1877. Its members are present in all zoogeographic regions, remote islands, and territories close to the poles. Plus, 63 species out of the 244 described have been recorded to feed on humans. Some are mega vectors, as those belonging to Ixodes ricinus-I. persulcatus complex, but others are so poorly studied that their vector role is difficult to access. This is the case of Ixodes ventalloi Gil Collado, 1936. This species is recorded in Northern Africa and Western Europe, mostly in Mediterranean basin countries, occurring along with other moisture-demanding ticks, as Haemaphysalis spp., I. frontalis, and I. ricinus. In fact, I. ventalloi not only shares vertebrate hosts (including humans) with the latter but may as well play a role in the enzootic cycle of some Ixodes-borne agents. This chapter updates information regarding this poorly studied tick, revising the available systematic, ecological, and microbiological data, discussing the potential public health relevance

Hox-code in Thymus identity

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013In jaw vertebrates, thymus is a primary hematopoietic organ responsible for T-cell differentiation. The thymus derives from the endoderm of the 3rd and 4th pharyngeal pouches (3/4 PP) in avian. However, in distinct species, the thymus can derive from other PP. Such anterior-posterior (AP) diversity of thymus positional origin has become of great interest to evolutionary developmental biology. The transcription factors Homeobox (Hox) genes are responsible for positional identity during development and are ruled out by a spatially collinear of gene expression along the AP-axis of the embryo and by phenotypic suppression by posterior genes. In this study we aimed to identify a potential Hox-code responsible for the positional identity of the thymus. For that, we first characterized the expression pattern of Hox-genes in the pharyngeal region of chick embryos, by whole-mount in situ hybridization, at stages prior to thymus formation. We observed that PP positional identity could be defined by an orderly expression of Hox genes with HoxA3 and HoxB1 defining the anterior frontiers of the 3 PP and 4PP, respectively. We hypothesised that HoxA3 and HoxB1 may be the potential Hox-code responsible for positional identity of thymic rudiment. To test our hypothesis we intend to ectopically express HoxA3 and HoxB1, in the 2PP and 3PP respectively. To genetically modify the PP endoderm, we already produced a pT2K-HoxA3eGFP construct to be used in the combined system of vectors, “Tol2-mediated gene transfer” and “Tetracycline-dependent conditional expression”. To test the efficiency of this system of vectors we transfected the HEK 293T cell line with the control-vectors and we monitored its efficacy by fluorescence microscopic observation and flow cytometry analysis. Long-term culture of transfected cells showed modest genomic integration of these vectors and “leakage” of the system when modulated by doxycycline.Em vertebrados que apresentam mandíbula, o timo é um órgão especializado do sistema imunitário adaptativo e o principal órgão hematopoiético responsável pela produção e diferenciação de células-T “auto-restritas” e “auto-tolerantes”. A produção destas células-T está dependente da interação entre as suas células percursoras, os timócitos, e as células epiteliais tímicas (CET), células especializadas do nicho tímico. O desenvolvimento do timo é acompanhado pelo desenvolvimento das glândulas paratiróides, pois partilham a mesma origem embrionária, as bolsas faríngicas (BF). Em galinha, foi demonstrado que os domínios presuntivos do timo e das glândulas paratiróides são identificados na endoderme da 3ª e 4ª BF pela expressão dos factores de transcrição Foxn1 e Gcm2, respectivamente. No entanto, entre as diferentes espécies de vertebrados, o timo pode derivar de diferentes bolsas faríngicas. Nos peixes cartilagíneos, considerados o grupo de espécies mais primitivo a desenvolver timo, como por exemplo o tubarão, o timo deriva conjuntamente das 2ª à 6ª BF. No caso dos anfíbios, a origem do timo é a 2ª BF e nos répteis desenvolve-se a partir da 2ª e da 3ª BF. Em aves, o timo deriva das 3ª e 4ª BF e nos mamíferos apenas da 3ª BF. A extraordinária diversidade, ao longo do eixo anterior-posterior (A-P), no número de BF com potencial para o desenvolvimento do timo tornou-se uma questão de grande interesse para a biologia evolutiva e do desenvolvimento e remete para o estudo de mecanismos moleculares conservados evolutivamente, que ocorrem em estadios precoces do desenvolvimento das BF, nomeadamente da 3ª e da 4ª bolsas. Os genes Homeobox (Hox) são factores de transcrição, evolutivamente conservados entre filos e são os genes responsáveis pela especificação do plano corporal, nomeadamente do eixo A-P. Estes genes por sua vez, são governados pelas regras da colinearidade espacial da sua expressão génica ao longo do eixo A-P do embrião e pela prevalência posterior ou supressão fenotípica dos genes posteriores. Diferentes estudos sobre o padrão de expressão dos genes Hox em ratinho e galinha sugerem a existência de um código formado por combinações específicas destes genes que determinam uma região específica do eixo A-P do embrião. De um ponto de vista evolutivo, a existência de um código-Hox a nível das BF, conservado entre vertebrados, poderia explicar a diversidade no número de BF com potencial para o desenvolvimento do timo. Múltiplos estudos em ratinho e galinha demonstraram o papel fundamental de HoxA3 na formação do 3º arco e 3ª bolsa faríngicos e nos seus derivados. Surpreendentemente, o fenótipo da mutação HoxA3 em ratinho é muito semelhante ao fenótipo apresentado por doentes com síndrome de DiGeorge: não apresentam timo nem glândulas paratiróides, apresentam hipoplasia da tiroide e múltiplos defeitos na estrutura dos 3º e 4º arcos faríngicos. Estas evidências sugerem um importante papel deste gene na identidade da bolsa de origem do timo e possivelmente na própria identidade posicional do timo. Neste projecto, o nosso príncipal objectivo foi a identificação de um possível código Hox responsável pela identidade posicional do timo na 3ª e 4ª BF no embrião de galinha. Para tal e com o objectivo de identificar quais os genes Hox expressos na endoderme da 3ª e 4ª BF, começamos por realizar hibridações in situ em embriões de galinha nos estadios E3 e E4, estadios anteriores à formação do timo. Foram caracterizados os padrões de expressão dos genes HoxA2, HoxA3, HoxB1, HoxB2, HoxB3 e HoxB4, alguns dos genes Hox expressos mais anteriormente no embrião. De forma a obtermos informação mais detalhada da expressão destes genes nos tecidos mais internos da região faríngica, os embriões foram processados pós-hibridação para cortes histológicos. Neste estudo foram também desenvolvidas novas sondas para os genes HoxA3, HoxB2 e HoxB4. A análise dos padrões de expressão génica na região faríngica revelou a expressão ordenada de genes HoxA ao longo do eixo A-P. Nomeadamente, observámos a expressão de HoxA2 a partir do 2º arco faríngico (AF) e especificamente na 2ª BF e expressão de HoxA3 a partir do 3º AF e especificamente na 3ª BF. Relativamente à expressão dos genes do grupo HoxB, não se observou uma expressão padronizada ao longo do eixo A-P. O padrão de expressão de HoxB1 foi observado unicamente na porção posterior da endoderme da 4ª BF. No caso dos genes HoxB2, HoxB3 e HoxB4, a sua expressão foi observada no mesênquima da região posterior à 4ª BF. Curiosamente, também foi observada expressão de HoxB4 ao nível da porção posterior da endoderme da 4ª BF. Estes resultados sugerem que a identidade posicional das diferentes BF pode ser definida por uma combinação específica de genes Hox. Em particular, sugerem que os genes HoxA3, HoxB1 e HoxB4 se encontram a definir as fronteiras anteriores da 3ª e 4ª BF. No entanto, estudos em ratinho demonstraram que HoxB4 está apenas envolvido na especificação da região ventral do embrião, sugerindo que este não está envolvido na identidade posicional das BF. Com estes resultados, levantamos assim a hipótese da combinação HoxA3+HoxB1- ser o código responsável pela identidade posicional do timo. Para testar esta hipótese, desenhámos um ensaio funcional in vivo em que a endoderme de diferentes BF é modificada geneticamente para expressar de forma ectópica os genes Hox. Especificamente, o nosso objectivo era sobre-expressar HoxA3 e HoxB1, na 2ª BF e 3ª BF, respectivamente, por forma a modificar a identidade posicional das mesmas. Para modificar geneticamente a endoderme, utilizamos um sistema de vectores que combina a “Transferência génica mediada por Tol2” e a “expressão condicional dependente de tetraciclina” (desenvolvido por Y. Takahashi e colaboradores). Para a utilização deste sistema no nosso trabalho, foram desenhados 2 novos vectores: pT2K-HoxA3eGFP, para a expressão de HoxA3 e pT2K-HoxB1eGFP para a expressão de HoxB1. Durante a realização desta tese, realizámos a construção do primeiro vector, encontrando-se o segundo em construção. Para testar a eficiência do sistema de vectores utilizamos uma linha celular humana, a linha HEK 293T. Esta foi transfectada com o sistema de vectores (controlo), em condições que permitissem avaliar a capacidade de integração genómica e a resposta deste sistema quando modulado por doxiciclina (doxy). A cultura de células transfectadas foi avaliada por observação ao microscópio de fluorescência e analisada por citometria de fluxo. Os resultados obtidos, ao longo de 14 dias, demonstraram uma rápida e drástica redução tanto na percentagem de células a expressar GFP como na intensidade média de fluorescência de GFP, sugerindo uma reduzida capacidade de integração dos vectores deste sistema no genoma. Para avaliar a resposta do sistema quando modulado pela presença/ausência de doxy, as células foram transfectadas na presença de doxy. Células transfectadas e cultivadas na presença de doxy apresentaram, aproximadamente, 20% de células GFP+ após 48h de cultura. Este resultado demostrou que este sistema não bloqueia eficientemente a expressão de GFP, sugerindo a existência de um “leakage” na modulação pela doxy. No entanto, foi observado, que a presença continuada de doxy levou à redução da intensidade média de fluorescência das células GFP+, após 10-14 dias em cultura, sugerindo que este “leakage” é responsável por níveis muito baixos de expressão génica. Foi também observado, que a remoção de doxy às 48h de cultura levou a um aumento da intensidade média de fluorescência das células GFP+. Estes dados sugerem que este sistema de vectores é modulado negativamente pela doxy, pois na sua presença, o sistema bloqueia a expressão de GFP. De futuro, com as construções de vectores finalizadas e as condições de utilização do sistema de vectores aferidas, iremos realizar os ensaios funcionais que permitam avaliar a possível mudança de identidade das bolsas por expressão ectópica dos genes HoxA3 e HoxB1 nas 2ª e 3ª BF, respectivamente. Resumidamente, as endodermes isoladas da 2ª e da 3ª BF serão geneticamente modificadas com os plasmídeos pT2K-HoxA3eGFP e pT2K-HoxB1eGFP (neste sistema de vectores), respectivamente. Serão depois cultivadas in vitro com mesênquima permissivo e posteriormente enxertadas na membrana corioalantóide para testar a formação dum timo (desenvolvimento in ovo). Com este ensaio esperamos mostrar o “ganho-de-potencialidade” da 2ª BF e a “perda-de-potencialidade” da 3ª BF, na formação do timo. A conjugação deste sistema de vectores com o ensaio funcional oferece uma abordagem experimental única para a identificação dum putativo código-Hox responsável pela identidade posicional do timo

Risk factors characterization for respiratory and ear infections on children younger than 36 months

In Portugal, respiratory and ear infections are the main reason for hospital visits in pediatric age and several risk factors have been pointed. The physiotherapist familiarity with these factors is crucial to act in health promotion. To characterize the risk factors for upper and lower respiratory and ear infections in children younger than 36 months attending daycare in Oporto.info:eu-repo/semantics/publishedVersio