Identification of distinct SET/TAF-Iβ domains required for core histone binding and quantitative characterisation of the interaction

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>The assembly of nucleosomes to higher-order chromatin structures is finely tuned by the relative affinities of histones for chaperones and nucleosomal binding sites. The myeloid leukaemia protein SET/TAF-Iβ belongs to the NAP1 family of histone chaperones and participates in several chromatin-based mechanisms, such as chromatin assembly, nucleosome reorganisation and transcriptional activation. To better understand the histone chaperone function of SET/TAF-Iβ, we designed several SET/TAF-Iβ truncations, examined their structural integrity by circular Dichroism and assessed qualitatively and quantitatively the histone binding properties of wild-type protein and mutant forms using GST-pull down experiments and fluorescence spectroscopy-based binding assays.</p> <p>Results</p> <p>Wild type SET/TAF-Iβ binds to histones H2B and H3 with K_dvalues of 2.87 and 0.15 μM, respectively. The preferential binding of SET/TAF-Iβ to histone H3 is mediated by its central region and the globular part of H3. On the contrary, the acidic C-terminal tail and the amino-terminal dimerisation domain of SET/TAF-Iβ, as well as the H3 amino-terminal tail, are dispensable for this interaction.</p> <p>Conclusion</p> <p>This type of analysis allowed us to assess the relative affinities of SET/TAF-Iβ for different histones and identify the domains of the protein required for effective histone recognition. Our findings are consistent with recent structural studies of SET/TAF-Iβ and can be valuable to understand the role of SET/TAF-Iβ in chromatin function.</p

The ratio of SRPK1/SRPK1a regulates erythroid differentiation in K562 leukaemic cells

AbstractSRPK1, the prototype of the serine/arginine family of kinases, has been implicated in the regulation of multiple cellular processes such as pre-mRNA splicing, chromatin structure, nuclear import and germ cell development. SRPK1a is a much less studied isoform of SRPK1 that contains an extended N-terminal domain and so far has only been detected in human testis. In the present study we show that SRPK1 is the predominant isoform in K562 cells, with the ratio of the two isoforms being critical in determining cell fate. Stable overexpression of SRPK1a induces erythroid differentiation of K562 cells. The induction of globin synthesis was accompanied by a marked decrease in proliferation and a significantly reduced clonogenic potential. Small interfering RNA-mediated down-regulation of SRPK1 in K562 cells results similarly in a decrease in proliferative capacity and induction of globin synthesis. A decreased SRPK1/SRPK1a ratio is also observed upon hemin/DMSO-induced differentiation of K562 cells as well as in normal human erythroid progenitor cells. Mass spectrometric analysis of SRPK1a-associated proteins identified multiple classes of RNA-binding proteins including RNA helicases, heterogeneous nuclear ribonucleoproteins, ribosomal proteins, and mRNA-associated proteins. Several of the SRPK1a-copurifying proteins have been previously identified in ribosomal and pre-ribosomal complexes, thereby suggesting that SRPK1a may play an important role in linking ribosomal assembly and/or function to erythroid differentiation in human leukaemic cells

Phosphoproteomics Screen Reveals Akt Isoform-Specific Signals Linking RNA Processing to Lung Cancer

The three Akt isoforms are functionally distinct. Here we show that their phosphoproteomes also differ, suggesting that their functional differences are due to differences in target specificity. One of the top cellular functions differentially regulated by Akt isoforms is RNA processing. IWS1, an RNA processing regulator, is phosphorylated by Akt3 and Akt1 at Ser720/Thr721. The latter is required for the recruitment of SETD2 to the RNA Pol II complex. SETD2 trimethylates histone H3 at K36 during transcription, creating a docking site for MRG15 and PTB. H3K36me3-bound MRG15 and PTB regulate FGFR-2 splicing, which controls tumor growth and invasiveness downstream of IWS1 phosphorylation. Twenty-one of the twenty-four non-small-cell-lung carcinomas we analyzed express IWS1. More importantly, the stoichiometry of IWS1 phosphorylation in these tumors correlates with the FGFR-2 splicing pattern and with Akt phosphorylation and Akt3 expression. These data identify an Akt isoform-dependent regulatory mechanism for RNA processing and demonstrate its role in lung cancer

Study of the biological role and the distribution of SR protein kinases in leukaemic cells

Serine/arginine protein kinases (SR-Protein Kinases) represent a novel class of enzymes that specifically phosphorylate RS or SR dipeptides. They show a remarkable specificity as mutations of Ser to Thr or Arg to Lys in the RS domain of their substrates, completely abrogate phosphorylation. SRPKs have been conserved throughout evolution and so far approximately 15 distinct genes encoding members of this family have been identified in the genomes of mammals, yeast, fruit fly, nematode, and plants. Mammalian SRPK1 was initially purified and cloned by Gui and Fu (1994), on the basis of its ability to phosphorylate members of the SR family of splicing factors in vitro. Since then, SRPK1 has been implicated in the regulation of multiple cellular processes such as chromatin structure, nuclear import and germ cell development. SRPK1a is an alternative spliced form of SRPK1 that contains an extended N-terminal domain of 171 aminoacids. SRPK1a is much less studied than its isoform SRPK1 and up to the present study it had only been detected in human testis. K562 cells have been used in the past as a model system to study CML. In addition, they contain high levels of SRPKs, while SRPK1 has been suggested to act downstream of BCR-Abl, in the same signalling pathway. Taken together these observations lead us to study SRPK1 and SRPK1a in leukaemic cells. Contrary to previous work showing cytoplasmic localization of SRPKs in HeLa cells, we demonstrate in the present study that SRPK1 and SRPK1a mainly partition between the nucleus and the Golgi apparatus in human and mouse leukemic cells. A fraction of the membrane-associated kinase is localised in detergent-resistant lipid rafts. Furthermore, hemin/DMSO or sodium butyrate-induced differentiation of K562 cells and hexamethylenebisacetamide (HMBA)-induced differentiation of MEL cells results in the exclusion of SRPKs from the cell nucleus and their accumulation at the Golgi membrane and the cytoplasm. Proapoptotic K562 cells, after short treatment with imatinib, also display a non-nuclear localization of SRPKs, similar to the one observed in differentiated cells. Moreover, we show that SRPK1 is the predominant isoform in K562 cells, with the expression ratio of the two isoforms being critical in determining cell fate. Stable overexpression of SRPK1a results in its accumulation at the Golgi membrane and the cytoplasm and induces erythroid differentiation of K562 cells. The induction of globin synthesis was accompanied by a marked decrease in proliferation and a significantly reduced clonogenic potential. These findings suggest that SRPK1a may play an important role in linking signaling to erythroid differentiation in human leukemic cells. In order to further probe into the biological roles of SRPKs in leukaemic cells, we studied the in vivo action of several quinoxaline derivatives that were found to selectively inhibit in vitro the phosphorylation activity of SRPK1. 2,3-di(thiophen-2-yl)benzo[g]quinoxaline and a yet uncharacterized compound (ID:14385) exhibited a strong apoptotic activity in K562 and MEL cells. Most interestingly, their action is restricted only against erythroleukaemic cells, whereas they show no effect on several other cancer cell lines, such as 293Τ, U87 και JM1 cells. K562 cells that overexpress SRPK1a show remarkable resistance against the apoptotic action of these inhibitors. This may be due either to the overexpression of the enzyme or the differentiation state of these cells. In line with the last hypothesis, we observed that hemin/DMSO-differentiated K562 cells show equal or even more persistent resistance against the apoptotic action of the same substances. In addition K562 cells overexpressing SRPK1a and hemin/DMSO-differentiated K562 cells were able to overcome the effect of other apoptotic inducers, such as imatinib. Taken together these data suggest that differentiation may activate an anti-apoptotic pathway in leukaemic cells.Οι κινάσες πρωτεϊνών σερίνης-αργινίνης (SR-Protein Kinases) αποτελούν μια καινούργια οικογένεια πρωτεϊνικών κινασών που φωσφορυλιώνουν εξειδικευμένα SR ή RS διπεπτίδια. Η εξειδίκευση αυτών των ενζύμων είναι πολύ μεγάλη αφού μεταλλάξεις της σερίνης σε θρεονίνη ή της αργινίνης σε λυσίνη στην RS περιοχή των υποστρωμάτων τους, παρεμποδίζουν εντελώς την φωσφορυλίωση. Οι SRPKs είναι διατηρημένες στην εξέλιξη και έως τώρα έχουν απομονωθεί πάνω από 15 γονίδια που κωδικοποιούν μέλη αυτής της οικογένειας στο γένωμα των θηλαστικών, της ζύμης, της Drosophila, του C. elegans και των φυτών. Η SRPK1 αποτελεί το πρώτο μέλος της οικογένειας αυτής. Κλωνοποιήθηκε από τους Gui και Fu (1994) με βάση την ικανότητά της να φωσφορυλιώνει παράγοντες ματίσματος του mRNA που περιέχουν SR ακολουθίες στο μόριό τους. Έκτοτε, έχει βρεθεί ότι εμπλέκεται στη ρύθμιση αρκετών ακόμη διεργασιών μέσα στο κύτταρο, όπως η διαμόρφωση της δομής της χρωματίνης, η είσοδος πρωτεϊνών στον πυρήνα και η ανάπτυξη των σπερματικών κυττάρων. Η SRPK1a αποτελεί προϊόν εναλλακτικού ματίσματος του γονιδίου της SRPK1 και περιέχει μία εμβόλιμη ακολουθία 171 αμινοξέων στο Ν-τελικό της άκρο που δεν υπάρχει στην SRPK1. Η SRPK1a έχει μελετηθεί πολύ λιγότερο από την SRPK1 και έως την παρούσα εργασία είχε ανιχνευτεί μόνο στους ανθρώπινους όρχεις. Το γεγονός ότι τα Κ562 κύτταρα, που αποτελούν την πιο μελετημένη κυτταρική σειρά της χρόνιας μυελογενούς λευχαιμίας, εμφανίζουν σχετικά υψηλά επίπεδα SRPKs, σε συνδυασμό με την παρατήρηση ότι οι SRPKs πιθανά βρίσκονται στο ίδιο σηματοδοτικό μονοπάτι με την BCR-Abl έκαναν ιδιαίτερα ενδιαφέρουσα τη μελέτη του βιολογικού ρόλου της ομάδας αυτής των ενζύμων στα ερυθρολευχαιμικά κύτταρα. Αντίθετα με προηγούμενες μελέτες, οι οποίες δείχνουν μία κυρίαρχη εντόπιση των SRPKs στο κυτταρόπλασμα κυττάρων HeLa, στην παρούσα εργασία παρουσιάζεται μία κατανομή των SRPK1 και SRPK1a μεταξύ του πυρήνα και του συμπλέγματος Golgi, σε ανθρώπινα και ποντικίσια ερυθρολευχαιμικά κύτταρα. Ένα κλάσμα τις κινάσης μάλιστα, που εντοπίζεται σε μεμβρανικές δομές, βρίσκεται σε λιπιδικές μικροπεριοχές ανθεκτικές σε απορρυπαντικά. Επιπλέον, η επαγωγή της διαφοροποίησης των Κ562 κυττάρων με αιμίνη/DMSO ή βουτυρικό νάτριο, όπως και η επαγωγή της διαφοροποίησης των MEL κυττάρων με HMBA, οδηγεί στον αποκλεισμό των SRPKs από τον πυρήνα των κυττάρων και τον περιορισμό της εντόπισής τους στο σύστημα Golgi και το κυτταρόπλασμα. Αντίστοιχη κατανομή με τα διαφοροποιημένα κύτταρα έχουμε και στην περίπτωση της επαγωγής της απόπτωσης των Κ562 κυττάρων με imatinib. Παράλληλα με τα παραπάνω, δείξαμε ότι η SRPK1 είναι η κυρίαρχη ισομορφή στα Κ562 κύτταρα, ενώ ο λόγος της έκφρασης των δύο ισομορφών SRPK1a/SRPK1 αποτελεί κρίσιμο παράγοντα για την τύχη του κυττάρου. Σταθερή υπερέκφραση της SRPK1a στα κύτταρα αυτά, οδηγεί στη συσσώρευση της στη μεμβράνη του Golgi και το κυτταρόπλασμα και στην επαγωγή της διαφοροποίησης των Κ562 κυττάρων προς ερυθροκύτταρα. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την επαγωγή της έκφρασης γ-σφαιρίνης, η οποία συνοδεύεται από αξιοσημείωτη μείωση του ρυθμού ανάπτυξης των κυττάρων και σημαντική ελάττωση της ικανότητάς τους να σχηματίζουν αποικίες. Τα δεδομένα αυτά μας οδήγησαν στο συμπέρασμα ότι η SRPK1a ίσως κατέχει ένα σημαντικό ρόλο στα μονοπάτια μεταφοράς σήματος που οδηγούν στη διαφοροποίηση προς ερυθροκύτταρα των ανθρώπινων λευχαιμικών κυττάρων. Επεκτείνοντας τη μελέτη μας στο βιολογικό ρόλο των SRPKs στα ερυθρολευχαιμικά κύτταρα, θελήσαμε να καταγράψουμε την in vivo επίδραση σε Κ562 και MEL κύτταρα ενώσεων που αποτελούν in vitro αναστολείς της SRPK1. Δύο από τα παράγωγα της κινοξαλίνης που δοκιμάστηκαν, βρέθηκε ότι αποτελούν ισχυρό επαγωγέα της απόπτωσης τόσο των Κ562 όσο και των MEL κυττάρων. Μάλιστα η δράση τους αυτή είναι εκλεκτική μόνο απέναντι σε ερυθρολευχαιμικές σειρές. Τα Κ562 κύτταρα που υπερεκφράζουν την SRPK1a εμφανίζουν ανθεκτικότητα απέναντι στην κυτταροτοξική δράση των παραπάνω αναστολέων. Η ιδιότητά τους αυτή μπορεί να οφείλεται είτε στην υπερέκφραση του ενζύμου, είτε στο ότι τα κύτταρα αυτά παρουσιάζουν χαρακτήρα μερικώς διαφοροποιημένων κυττάρων. Στην τελευταία υπόθεση συνηγορεί το γεγονός ότι διαφοροποιημένα Κ562 κύτταρα με αιμίνη/DMSO παρουσιάζουν παρόμοια και ίσως μεγαλύτερη ανθεκτικότητα απέναντι στους ίδιους αναστολείς. Το γεγονός ότι τα διαφοροποιημένα Κ562 κύτταρα αλλά και αυτά που υπερεκφράζουν την SRPK1a εμφανίζουν ανθεκτικότητα απέναντι και σε άλλους κυτταροτοξικούς παράγοντες, όπως το imatinib, δείχνει ότι κατά τη διαφοροποίηση ίσως ενεργοποιείται ένας γενικότερος αντι-αποπτωτικός μηχανισμός

Chromatin-bound protein colocalization analysis using bedGraph2Cluster and PanChIP

Summary: Computational pipelines for chromatin immunoprecipitation sequencing analysis can neglect colocalization events that occur in a mere subset of the genome. Here, we detail a streamlined approach for assessing colocalization of chromatin-bound proteins using the bedGraph2Cluster and PanChIP algorithms. Using histone modifications as an example, bedGraph2Cluster performs clustering analysis on chromatin binding patterns of target proteins. PanChIP then compares these clusters with a reference library of chromatin binding patterns and measures the overlap in peaks, capturing the heterogeneity in chromatin binding and colocalization patterns.For complete details on the use and execution of this protocol, please refer to Sanidas et al. (2022).1 : Publisher’s note: Undertaking any experimental protocol requires adherence to local institutional guidelines for laboratory safety and ethics

The Downregulation of GFI1 by the EZH2-NDY1/KDM2B-JARID2 Axis and by Human Cytomegalovirus (HCMV) Associated Factors Allows the Activation of the HCMV Major IE Promoter and the Transition to Productive Infection

<div><p>Earlier studies had suggested that epigenetic mechanisms play an important role in the control of human cytomegalovirus (HCMV) infection. Here we show that productive HCMV infection is indeed under the control of histone H3K27 trimethylation. The histone H3K27 methyltransferase EZH2, and its regulators JARID2 and NDY1/KDM2B repress GFI1, a transcriptional repressor of the major immediate-early promoter (MIEP) of HCMV. Knocking down EZH2, NDY1/KDM2B or JARID2 relieves the repression and results in the upregulation of GFI1. During infection, the incoming HCMV rapidly downregulates the GFI1 mRNA and protein in both wild-type cells and in cells in which EZH2, NDY1/KDM2B or JARID2 were knocked down. However, since the pre-infection levels of GFI1 in the latter cells are significantly higher, the virus fails to downregulate it to levels permissive for MIEP activation and viral infection. Following the EZH2-NDY1/KDM2B-JARID2-independent downregulation of GFI1 in the early stages of infection, the virus also initiates an EZH2-NDY1/ΚDM2Β-JARID2-dependent program that represses GFI1 throughout the infection cycle. The EZH2 knockdown also delays histone H3K27 trimethylation in the immediate early region of HCMV, which is accompanied by a drop in H3K4 trimethylation that may contribute to the shEZH2-mediated repression of the major immediate early HCMV promoter. These data show that HCMV uses multiple mechanisms to allow the activation of the HCMV MIEP and to prevent cellular mechanisms from blocking the HCMV replication program.</p></div