RUNX1-dependent RAG1 deposition instigates human TCR-δ locus rearrangement

V(D)J recombination of TCR loci is regulated by chromatin accessibility to RAG1/2 proteins, rendering RAG1/2 targeting a potentially important regulator of lymphoid differentiation. We show that within the human TCR-α/δ locus

Analyse de la régulation des réarrangements précoces du TCRδ dans la lymphopoïèse normale et les anomalies oncogéniques associées dans les leucémies aiguës lymphoblastiques T

T cell development is a regulated thymic process during which TCRs δ, γ, β and α rearrangement occurs successively. This process needs somatic recombination V(D)J events which involves RAG1/2 protein, RSS sequences besides V, D and J segments and regulatory elements (enhancers) ensuring a cis-regulation of this process. The control of V(D)J recombination occurs thanks to different mechanisms including epigenetic mechanisms, transcription factor intervention and the RSS conformation/sequence (the 12/23 rule and the B12/23 restriction). T cell acute lymphoblastic leukaemias (T-ALL) are characterized by the proliferation of malignant T lymphoblasts arrested at early stages of maturation. They show common characteristics with T progenitor from which they derived. Most frequent cytogenetics anomalies are chromosomal translocations with TCRα/δ and TCRβ loci. Deregulation, due to chromosomal translocations, of many oncogenesis such as homeodomain gene TLX has been described in T-ALL. Molecular mechanisms of these anomalies, notably the V(D)J machinery role and intimate molecular mechanism of the differentiation blockage observed stay hardly known. TLX1 or TLX3 positive leukaemias are characterised by a maturation blockage at cortical stage. This stage is defined by a complete TCRβ rearrangement, without any TCRα rearrangement or detectable expression of TCRαβ on cell surface. Using a gene reporter assay, we showed a repressive activity of homeodomain TLX1/3 oncoprotein on Enhancer alpha (Eα) which results in a repression of the Eα activity, therefore no TCRα rearrangement. Then, protein interaction between ETS1 and TLX1/3 was demonstrated in vivo in TLX1/3 positive cell lines. Finally, we showed TLX1/3 protein recruitment, via ETS1, on Eα. Interestingly, TLX1direct inactivation using lentiviral strategy (shRNA TLX1) or indirect inactivation (TCRαβ ectopic expression) leads to T cell redifferentiation and a massive cell apoptosis. It is important to note that massive apoptosis was not observed when transduced cells were cultured in a stromal-cell-free standard culture system. In the mean time, TCRδ-TLX1 translocations are detected in the normal thymus. So, TCRδ-TLX1 translocations do not undergo oncogenic selection because of a feed-forward inhibitory effect exerted by TLX1 itself, inducing autorepression of Ea transcriptional activity. Screening for TCRβ and TCRα/δ translocations in 280 T-ALLs allowed identification of four unreported TCR translocated oncogene partner (GNAG, LEF1, NKX2-4 and IL2RB). Molecular mapping of genomic junctions from TCR translocations showed that the majority of oncogenic partner breakpoints are not recombinase mediated and that the regulatory elements predominantly used to drive oncogene expression differ markedly in TCRβ (exclusively enhancer driven) and TCRα/δ translocations, when use of an enhancer-independent cryptic internal promoter is frequent. Our data also imply that oncogene activation takes place at a very immature stage of thymic development whereas the bulk leukemic maturation arrest (DN stage) occurs at a much later (cortical) stage. Moreover, the TCRα/δ translocated cases predominantly demonstrated junctions involving Dδ2 and Dδ3 segments which led us to analyse early stages of human thymopoiesis. Firstly, we show that human TCRδ gene assembly is ordered: Dδ2 to Dδ3 rearrangement followed by a Dδ2-Dδ3 to Jδ1 rearrangement. Dδ2-Dδ3 rearrangement occurs at a specific CD34+ CD7+dim CD1a- early thymic precursor (ETP) stage. Most importantly, we show that RUNX1 is directly involved in this ordered early rearrangement through recruitment to the Dδ2-23RSS and interaction with RAG1. RUNX1 inactivation in CD34+ umbilical cord blood leads to a total absence of human Dδ2-Dδ3 rearrangement. Taken together, these data confirm the role of RUNX1 in ordering early human TCRδ rearrangements and point out for the first time that human tcrd locus is controlled by a B12/23 restriction as opposed to murine tcrd locus regulation. Finally, this results show that the T cell oncogenesis and T cell ontogeny are closely linked. Thus, the physiological T cell maturation process blockage is a central element of the oncogenic process and underlines the potential of T-ALL study for a better understanding of the T ontogeny and show target therapy perspectives.La maturation des cellules lymphoïdes T est un processus thymique hautement régulée où se mettent en place de manière ordonnée et successive les réarrangements des loci du TCRδ, γ, β et enfin α. Ceci nécessite des événements de recombinaisons somatiques V(D)J qui font intervenir les protéines RAG1/2, les séquences RSS jouxtant les segments V, D et J et des éléments régulateurs (enhancers) assurant une cis-régulation de ce processus. Le contrôle de la recombinaison V(D)J se fait grâce à divers mécanismes incluant des mécanismes épigénétiques, l'intervention de facteurs de transcription et la conformation/séquence des RSS (la règle 12/23 et la restriction B12/23). Les leucémies aiguës lymphoblastiques T (LAL-T) sont des proliférations malignes de blastes de phénotype thymique immature. Elles présentent des caractéristiques communes avec les progéniteurs T dont elles dérivent. Les anomalies cytogénétiques les plus fréquentes sont des translocations chromosomiques avec les loci TCRα/δ et TCRβ. La dérégulation, par translocation chromosomique, de nombreux oncogènes, comme le gène à homéodomaine TLX, ont été décrits dans les LAL-T. Les mécanismes moléculaires de ces anomalies, et notamment le rôle joué par la machinerie V(D)J ainsi que les mécanismes moléculaires intimes du blocage de différenciation observé restent cependant peu connus. Les leucémies, TLX1 ou TLX3 positive, se caractérisent par un blocage de maturation au stade cortical. Celui-ci se définit notamment par la présence de réarrangements complets du TCRβ, mais sans réarrangement du TCRα ni expression détectable du récepteur membranaire TCRαβ. Par un système de gène rapporteur, nous avons mis en évidence l'action répressive des protéines à homéodomaines TLX1 et TLX3 sur l'Enhancer Alpha (Eα). Puis l'interaction protéique entre ETS1 et TLX1/3 a été mise en évidence in vivo dans des lignées TLX positives. Enfin, nous montrons le recrutement des protéines TLX1/3, via ETS1, sur l'Eα. De manière intéressante, l'inactivation directe (knock-down par shRNA TLX1) ou indirecte (surexpression d'un TCRαβ exogène) de cette répression a pour conséquence une reprise de la différenciation T suivie d'une mort cellulaire par apoptose. De manière notable, cette apoptose est observé uniquement en condition de culture sur OP9DL1. Les cellules restent ainsi dépendantes du blocage de maturation dont la levée semble incompatible avec leur survie malgré l'accumulation de nombreux évènements oncogéniques. Parallèlement, en analysant les translocations TCRα/δ-TLX1 dans les LAL-T et dans le thymus d'individus sains, nous avons identifié un mécanisme d'auto-sélection clonal par addiction oncogénique. L'étude des translocations TCR-oncogènes sur une série de 280 LAL-T, nous a permis de confirmer la survenue des translocations TCRα/δ-oncogènes dans 19% de cas et TCRβ-oncogènes dans 14% des cas de LAL-T. Ce travail descriptif a permis l'identification de quatre nouveaux oncogènes impliqués dans les translocations TCR dans les LAL-T (LEF1, GNAQ, NKX2.4, IL2RB). Le clonage moléculaire des points de cassure a permis de mettre en évidence une absence d'intervention de la machinerie RAG au niveau de la cassure double brin de l'oncogène, soit une translocation de type 2. De façon intéressante, nous montrons un découplage entre le moment de survenue de la translocation (stade DN) et l'activation de l'oncogène (cortical, pré-αβ). Enfin nous avons mise en évidence un mécanisme de dérégulation oncogénique sensiblement différent en fonction du locus du TCR (α/δ ou β) impliqué dans la translocation. Cette étude descriptive, a permis de pointer l'implication fréquente des segments Dδ2 et Dδ3 dans les translocations chromosomiques et nous a amené à analyser les étapes les plus précoces de la thymopoïèse humaine. Nous avons pu mettre en évidence un ordonnement strict des réarrangements précoces de ce locus : Dδ2-Dδ3 précédant toujours les réarrangements impliquant les segments Jδ1. Le premier réarrangement Dδ2-Dδ3 à s'effectuer est détectable au stade de maturation Early Thymic Precursor ETP (CD34+ /CD1a-/CD7+/dim). De façon importante, nous montrons que le facteur de transcription RUNX1 est directement impliqué dans ce remaniement par sa fixation sur le Dδ2-23RSS et son interaction avec RAG1. Ainsi l'inactivation de RUNX1 dans des CD34+ de sang cordon, cultivés en condition de différenciation T a pour conséquence une absence totale de réarrangement Dδ2-Dδ3. L'ensemble de ces données met bien en évidence le rôle majeur de RUNX1 dans l'ordonnement précoce des réarrangements du TCRδ et pointe pour la première fois que ce locus, comme celui du TCRβ, est contrôlé par la restriction B12/23 chez l'Homme contrairement à ce qui est décrit chez la souris. Au final l'ensemble de ces expériences montre que l'oncogenèse et l'ontogénie T sont étroitement liées et qu'ainsi le blocage du processus de maturation physiologique T est un élément central du processus oncogénique dont les cellules leucémiques restent dépendantes pour leur survie. Ces résultats soulignent le potentiel de l'étude des LAL-T pour une meilleure compréhension de l'ontogénie T et ouvrent des perspectives originales de thérapie ciblée " différenciante "

Analyse de la régulation des réarrangements précoces du TCR dans la lymphopoïèse normale et les anomalies oncogéniques associées dans les leucémies aiguës lymphoblatiques T

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