Amino acids substitutions in σ1 and μ1 outer capsid proteins of a Vero cell-adapted mammalian orthoreovirus are required for optimal virus binding and disassembly

In a recent study, the serotype 3 Dearing strain of mammalian orthoreovirus was adapted to Vero cells; cells that exhibit a limited ability to support the early steps of reovirus uncoating and are unable to produce interferon as an antiviral response upon infection. The Vero cell-adapted virus (VeroAV) exhibits amino acids substitutions in both the σ1 and μ1 outer capsid proteins but no changes in the σ3 protein. Accordingly, the virus was shown not to behave as a classical uncoating mutant. In the present study, an increased ability of the virus to bind at the Vero cell surface was observed and is likely associated with an increased ability to bind onto cell-surface sialic acid residues. In addition, the kinetics of μ1 disassembly from the virions appears to be altered. The plasmid-based reverse genetics approach confirmed the importance of σ1 amino acids substitutions in VeroAV's ability to efficiently infect Vero cells, although μ1 co-adaptation appears necessary to optimize viral infection. This approach of combining in vitro selection of reoviruses with reverse genetics to identify pertinent amino acids substitutions appears promising in the context of eventual reovirus modification to increase its potential as an oncolytic virus.Dans une étude récente, le réovirus de sérotype 3 (souche Dearing) a été adapté aux cellules Vero, cellules qui possèdent une capacité limitée à supporter les étapes précoces de décapsidation de réovirus et qui sont incapables de produire de l'interféron comme réponse antivirale lorsqu'elles sont infectées. Le virus adapté (VeroAV) possède des substitutions d'acides aminés au niveau des protéines de capside externe σ1 et μ1, mais ne présente pas de changement au niveau de la protéine σ3. Comme attendu, le virus ne se comporte donc pas comme un mutant de décapsidation classique. Dans la présente étude, une augmentation de la capacité du virus à se fixer à la surface des cellules Vero a été observée et est probablement associée à une augmentation de la fixation aux acides sialiques de la surface cellulaire. De plus, la cinétique de relâche de μ1 à partir des virions semble altérée. L'approche de génétique inverse a permis de confirmer l'importance des substitutions d'acides aminés de la protéine σ1 dans la capacité de VeroAV à infecter les cellules Vero de manière efficace, bien que la coadaptation de μ1 apparaisse nécessaire pour optimiser l'infection virale. Cette approche combinant la sélection in vitro de réovirus à la génétique inverse pour découvrir des substitutions importantes d'acides aminés apparaît prometteuse dans le contexte de la modification de réovirus afin d'accroître son potentiel en tant que virus oncolytique.Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canad

Combinaison d’approches classiques et de génétique inverse en vue d'une meilleure compréhension du tropisme et de l'activité oncolytique du réovirus de mammifères

Le réovirus de mammifères se multiplie et détruit préférentiellement les cellules cancéreuses. Il est d’ailleurs actuellement à l’étude pour traiter divers types de cancers chez l’humain. L’objectif de cette étude était de mieux comprendre les diverses composantes impliquées dans le cycle viral de réovirus qui pourraient potentiellement être importantes dans le contexte d’optimisation de son potentiel oncolytique, ceci en utilisant une combinaison d’approches classiques ainsi que de génétique inverse.L’approche par persistance virale est classiquement utilisée pour identifier de nouveaux mutants de réovirus. Celle-ci a surtout mené à la sélection de mutants de décapsidation chez les cellules L929. Ici, des virus adaptés furent récupérés de cellules Vero (VeroAV) et contrairement aux autres mutants de persistance, ce virus possède des substitutions d’acides aminés sur les protéines mu1 et sigma1. L’approche par génétique inverse a permis de démontrer que la fixation de VeroAV sur les acides sialiques des cellules Vero était favorisée. Les substitutions sur sigma1 seraient principalement responsables de ce phénotype quoique le contexte de la substitution de mu1 puisse affecter l’infectivité du virus. Dans un deuxième volet, il a été remarqué que le virus de type sauvage utilisé pour la génétique inverse (T3DK) était plus sensible à l’interféron comparativement au virus de type sauvage de notre laboratoire (T3DS). Après séquençage complet du virus T3DS nous avons reconstruit, par génétique inverse, le virus T3DS. Nous avons donc pu poursuivre nos études sur le virus P4L-12 précédemment isolé au laboratoire par mutagenèse chimique. Il a été préalablement démontré que P4L-12 possède une meilleure réplication chez les cellules transformées et un blocage plus complet chez les cellules parentales, phénotype relié à une sensibilité accrue à l’interféron. Dans cette étude, des substitutions d’acides aminés sur les protéines sigma3, mu1, muNS et lambda2 furent identifiés. Nous avons démontré, par génétique inverse, que la substitution sur la protéine lambda2 était principalement responsable du phénotype de sensibilité à l’interféron. Ces approches de persistance ou de sélection de mutants sensibles à l’interféron, suivies d’une caractérisation par génétique inverse seront certainement utiles à une meilleure compréhension de réovirus et pourraient contribuer à améliorer son potentiel oncolytique.The mammalian reovirus preferentially replicates and kills cancer cells. It is therefore currently used in clinical trials to treat various types of cancers in humans. The main objective of this study was to get a better understanding of the various components involved in the reovirus replication cycle that could potentially be important for the optimization of its oncolytic properties using a combination of traditional approaches and the newly described reverse genetics technique. Classically, the viral persistence approach is undertaken to identify new reovirus variants. This has led to the selection of uncoating mutants in L929 cells. In this study, adapted viruses were recovered from Vero cells (VeroAV) and unlike other persistence mutants, VeroAV had amino acid substitutions on the mu1 and the sigma1 proteins. The reverse genetics approach demonstrated that VeroAV had a better binding ability onto sialic acids of Vero cells. Substitutions on sigma1 were found to be mainly responsible for this phenotype although mu1 substitutions may affect virus infectivity. In a second study, we noticed that the reverse genetics wild-type virus (T3DK) was more sensitive to interferon when compared with the wild-type virus from our laboratory (T3DS). After complete sequencing of the T3DS, we then constructed a T3DS by reverse genetics. This allowed us to proceed in our studies of a mutant virus previously recovered in our laboratory by chemical mutagenesis (P4L-12). It was previously established that P4L-12 had an enhanced replication in transformed cells while sparing the parental cells and this phenotype was correlated to an increased sensitivity to interferon. In this study, amino acid substitutions on the sigma3, mu1, muNS and lambda2 proteins were identified. By using the reverse genetics approach, we demonstrated that the substitution found on the lambda2 protein was primarily responsible for the increase in sensitivity to interferon of P4L-12. The combination of approaches based on persistence or selection of mutants sensitive to interferon followed by characterization with reverse genetics will certainly be useful to get a better understanding of reovirus in order to improve its oncolytic capacity

A single amino acid substitution in the mRNA capping enzyme λ2 of a mammalian orthoreovirus mutant increases interferon sensitivity

In the last few years, the development of a plasmid-based reverse genetics system for mammalian reovirus has allowed the production and characterization of mutant viruses. This could be especially significant in the optimization of reovirus strains for virotherapeutic applications, either as gene vectors or oncolytic viruses. The genome of a mutant virus exhibiting increased sensitivity to interferon was completely sequenced and compared with its parental virus. Viruses corresponding to either the parental or mutant viruses were then rescued by reverse genetics and shown to exhibit the expected phenotypes. Systematic rescue of different viruses harboring either of the four parental genes in a mutant virus backbone, or reciprocally, indicated that a single amino acid substitution in one of λ2 methyltransferase domains is the major determinant of the difference in interferon sensitivity between these two viruses.Au cours des dernières années, la mise au point de la génétique inverse pour les réovirus de mammifères a permis la production et la caractérisation de virus mutants. Ceci pourrait être spécialement important pour l'optimisation de souches virales en vue d'applications thérapeutiques, comme vecteurs de gènes ou virus oncolytiques. Le génome d'un virus mutant démontrant une sensibilité accrue à l'interféron a été complètement séquencé et comparé au virus parental. Des virus correspondant au virus parental ou mutant ont ensuite été récupérés par génétique inverse et présentaient les phénotypes attendus. La récupération systématique de différents virus possédant un des quatre gènes parentaux dans un fond génétique du virus mutant, et réciproquement, a indiqué qu'une seule substitution d'acide aminé dans un des deux domaines méthyltransférase de λ2 est le déterminant majeur de la différence de sensibilité à l'interféron entre ces deux virus.Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada

Amino acid substitutions in σ1 and μ1 outer capsid proteins are selected during mammalian reovirus adaptation to Vero cells

Establishment of viral persistence in cell culture has previously led to the selection of mammalian reovirus mutants, although very few of those have been characterized in details. In the present study, reovirus was adapted to Vero cells that, in contrast to classically-used L929 cells, are inefficient in supporting the early steps of reovirus uncoating and are also unable to produce interferon as an antiviral response once infection occurs. The Vero cell-adapted reovirus exhibits amino acids substitutions in both the σ1 and μ1 proteins. This contrasts with uncoating mutants from persistently-infected L929 cells, and various other cell types, that generally harbor amino acids substitutions in the σ3 outer capsid protein. The Vero cell-adapted virus remained sensitive to an inhibitor of lysosomal proteases; furthermore, in the absence of selective pressure for its maintenance, t he virus has partially lost its ability to resist interferon. The positions of the amino acids substitutions on the known protein structures suggest an effect on binding of the viral σ1 protein to the cell surface and on μ1 disassembly from the outer capsid.L'établissement de la persistance virale en culture cellulaire a précédemment mené à la sélection de mutants de réovirus, bien que peu d'entre eux aient été caractérisés en détail. Dans la présence étude, le réovirus a été adapté aux cellules Vero qui, contrairement aux cellules L929 classiquement utilisées, sont peu efficaces pour les étapes précoces de décapsidation de réovirus et sont également incapables de produire de l'interféron comme réponse antivirale, lorsqu'infectées. Le réovirus adapté aux cellules Vero porte des substitutions d'acides aminés à la fois dans les protéines σ1 et μ1. Ceci contraste avec les mutants de décapsidation des cellules L929 infectées de manière persistante, aussi bien que chez divers autres types de cellules, qui présentent généralement des substitutions d'acides aminés au niveau de la protéine de capside externe σ3. Le virus adapté aux cellules Vero demeure sensible à un inhibiteur de protéases lysosomales; de plus, en absence de pression de sélection, le virus a perdu en partie sa capacité à résister à l'interféron. La position des différentes substitutions d'acides aminés sur la structure connue de la protéine suggère un effet sur la fixation de la protéine virale σ1 à la surface cellulaire et sur l'élimination de la protéine μ1 de la capside externe du virus.Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canad

Transient high level mammalian reovirus replication in a bat epithelial cell line occurs without cytopathic effect

Mammalian reoviruses exhibit a large host range and infected cells are generally killed; however, most studies examined only a few cell types and host species, and are probably not representative of all possible interactions between virus and host cell. Many questions thus remain concerning the nature of cellular factors that affect viral replication and cell death. In the present work, it was observed that replication of the classical mammalian reovirus serotype 3 Dearing in a bat epithelial cell line, Tb1.Lu, does not result in cell lysis and is rapidly reduced to very low levels. Prior uncoating of virions by chymotrypsin treatment, to generate infectious subviral particles, increased the initial level of infection but without any significant effect on further viral replication or cell survival. Infected cells remain resistant to virus reinfection and secrete an antiviral factor, most likely interferon, that is protective against the unrelated encephalomyocarditis virus. Although, the transformed status of a cell is believed to promote reovirus replication and viral “oncolysis”, resistant Tb1.Lu cells exhibit a classical phenotype of transformed cells by forming colonies in semisolid soft agar medium. Further transduction of Tb.Lu cells with a constitutively-active Ras oncogene does not seem cell growth or reovirus effect on these cells. Infected Tb1.Lu cells can produce low-level of infectious virus for a long time without any apparent effect, although these cells are resistant to reinfection. The results suggest that Tb1.Lu cells can mount an unusual antiviral response. Specific properties of bat cells may thus be in part responsible for the ability of the animals to act as reservoirs for viruses in general and for novel reoviruses in particular. Their peculiar resistance to cell lysis also makes Tb1.Lu cells an attractive model to study the cellular and viral factors that determine the ability of reovirus to replicate and destroy infected cells.Les réovirus de mammifères possèdent un large spectre d'hôtes et les cellules infectées sont généralement tuées par l'infection ; cependant, la plupart des études utilisent seulement certains types de cellules provenant de quelques espèces animales. Ceci n'est sans doute pas représentatif de toutes les interactions possibles entre virus et cellule hôte. Plusieurs questions demeurent concernant la nature des facteurs cellulaires qui affectent la réplication virale et la mort cellulaire. Dans la présente étude, il a été observé que la réplication du classique réovirus de mammifères (sérotype 3 Dearing) dans une lignée de cellules épithéliales de chauve-souris, Tb1.Lu, n'entraîne pas la lyse cellulaire et est rapidement réduite à un très faible niveau. La décapsidation des virions par traitement à la chymotrypsine, afin de générer des particules dites « sous-virales infectieuses », augmente le niveau initial d'infection sans effet significatif sur la réplication virale ou la survie cellulaire. Les cellules infectées demeurent résistantes à la réinfection et sécrètent un facteur antiviral, probablement de l'interféron, qui peut protéger contre l'infection par le virus de l'encéphalomyocardite. Malgré le fait que le statut de transformation cellulaire est considéré comme pouvant promouvoir la réplication de réovirus et l'oncolyse virale, les cellules Tb1.Lu résistantes démontrent un phénotype classique de cellules transformées et forment des colonies en milieu semi-solide contenant de l'agar. La transduction de cellules Tb1.Lu avec un oncogène Ras constitutivement actif ne semble pas affecter la croissance cellulaire ni la réplication virale. Les cellules Tb1.Lu infectées peuvent produire une faible quantité de virus infectieux pour une longue période sans effet apparent, malgré le fait que ces cellules soient résistantes à la réinfection. Ces résultats suggèrent que les cellules Tb1.Lu peuvent développer une réponse antivirale inhabituelle. Les propriétés spécifiques des cellules de chauve-souris pourraient donc être en partie responsables de la capacité de ces animaux à agir comme réservoirs de virus en général et de nouveaux réovirus en particulier. Leur résistance particulière à la lyse cellulaire fait aussi de ces cellules un modèle attrayant pour étudier les facteurs cellulaires et viraux qui déterminent la capacité de réovirus à se répliquer et à détruire les cellules infectées.Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canad