Methylxanthines Induce a Change in the AD/Neurodegeneration-Linked Lipid Profile in Neuroblastoma Cells

Alzheimer’s disease (AD) is characterized by an increased plaque burden and tangle accumulation in the brain accompanied by extensive lipid alterations. Methylxanthines (MTXs) are alkaloids frequently consumed by dietary intake known to interfere with the molecular mechanisms leading to AD. Besides the fact that MTX consumption is associated with changes in triglycerides and cholesterol in serum and liver, little is known about the effect of MTXs on other lipid classes, which raises the question of whether MTX can alter lipids in a way that may be relevant in AD. Here we have analyzed naturally occurring MTXs caffeine, theobromine, theophylline, and the synthetic MTXs pentoxifylline and propentofylline also used as drugs in different neuroblastoma cell lines. Our results show that lipid alterations are not limited to triglycerides and cholesterol in the liver and serum, but also include changes in sphingomyelins, ceramides, phosphatidylcholine, and plasmalogens in neuroblastoma cells. These changes comprise alterations known to be beneficial, but also adverse effects regarding AD were observed. Our results give an additional perspective of the complex link between MTX and AD, and suggest combining MTX with a lipid-altering diet compensating the adverse effects of MTX rather than using MTX alone to prevent or treat AD

Targeted Lipidomics of Mitochondria in a Cellular Alzheimer’s Disease Model

Alzheimer’s disease (AD) is neuropathologically characterized by the accumulation of Amyloid-β (Aβ) in senile plaques derived from amyloidogenic processing of a precursor protein (APP). Recently, changes in mitochondrial function have become in the focus of the disease. Whereas a link between AD and lipid-homeostasis exists, little is known about potential alterations in the lipid composition of mitochondria. Here, we investigate potential changes in the main mitochondrial phospholipid classes phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine and the corresponding plasmalogens and lyso-phospholipids of a cellular AD-model (SH-SY5Y APPswedish transfected cells), comparing these results with changes in cell-homogenates. Targeted shotgun-lipidomics revealed lipid alterations to be specific for mitochondria and cannot be predicted from total cell analysis. In particular, lipids containing three and four times unsaturated fatty acids (FA X:4), such as arachidonic-acid, are increased, whereas FA X:6 or X:5, such as eicosapentaenoic acid (EPA) or docosahexaenoic acid (DHA), are decreased. Additionally, PE plasmalogens are increased in contrast to homogenates. Results were confirmed in another cellular AD model, having a lower affinity to amyloidogenic APP processing. Besides several similarities, differences in particular in PE species exist, demonstrating that differences in APP processing might lead to specific changes in lipid homeostasis in mitochondria. Importantly, the observed lipid alterations are accompanied by changes in the carnitine carrier system, also suggesting an altered mitochondrial functionalit

Impact of Vitamin D3 Deficiency on Phosphatidylcholine-/Ethanolamine, Plasmalogen-, Lyso-Phosphatidylcholine-/Ethanolamine, Carnitine- and Triacyl Glyceride-Homeostasis in Neuroblastoma Cells and Murine Brain

Vitamin D3 hypovitaminosis is associated with several neurological diseases such as Alzheimer’s disease, Parkinson’s disease or multiple sclerosis but also with other diseases such as cancer, diabetes or diseases linked to inflammatory processes. Importantly, in all of these dis eases lipids have at least a disease modifying effect. Besides its well-known property to modulate gene-expression via the VDR-receptor, less is known if vitamin D hypovitaminosis influences lipid homeostasis and if these potential changes contribute to the pathology of the diseases themselves. Therefore, we analyzed mouse brain with a mild vitamin D hypovitaminosis via a targeted shotgun lipidomic approach, including phosphatidylcholine, plasmalogens, lyso-phosphatidylcholine, (acyl- /acetyl-) carnitines and triglycerides. Alterations were compared with neuroblastoma cells cultivated in the presence and with decreased levels of vitamin D. Both in cell culture and in vivo, decreased vitamin D level resulted in changed lipid levels. While triglycerides were decreased, carnitines were increased under vitamin D hypovitaminosis suggesting an impact of vitamin D on energy metabolism. Additionally, lyso-phosphatidylcholines in particular saturated phosphatidylcholine (e.g., PC aa 48:0) and plasmalogen species (e.g., PC ae 42:0) tended to be increased. Our results suggest that vitamin D hypovitaminosis not only may affect gene expression but also may directly influence cellular lipid homeostasis and affect lipid turnover in disease states that are known for vitamin D hypovitaminosis

Comparative evaluation of the treatment efficacy of suberoylanilide hydroxamic acid (SAHA) and paclitaxel in ovarian cancer cell lines and primary ovarian cancer cells from patients

BACKGROUND: In most patients with ovarian cancer, diagnosis occurs after the tumour has disseminated beyond the ovaries. In these cases, post-surgical taxane/platinum combination chemotherapy is the "gold standard". However, most of the patients experience disease relapse and eventually die due to the emergence of chemotherapy resistance. Histone deacetylase inhibitors are novel anticancer agents that hold promise to improve patient outcome. METHODS: We compared a prototypic histone deacetylase inhibitor, suberoylanilide hydroxamic acid (SAHA), and paclitaxel for their treatment efficacy in ovarian cancer cell lines and in primary patient-derived ovarian cancer cells. The primary cancer cells were isolated from malignant ascites collected from five patients with stage III ovarian carcinomas. Cytotoxic activities were evaluated by Alamar Blue assay and by caspase-3 activation. The ability of SAHA to kill drug-resistant 2780AD cells was also assessed. RESULTS: By employing the cell lines OVCAR-3, SK-OV-3, and A2780, we established SAHA at concentrations of 1 to 20 μM to be as efficient in inducing cell death as paclitaxel at concentrations of 3 to 300 nM. Consequently, we treated the patient-derived cancer cells with these doses of the drugs. All five isolates were sensitive to SAHA, with cell killing ranging from 21% to 63% after a 72-h exposure to 20 μM SAHA, while four of them were resistant to paclitaxel (i.e., <10% cell death at 300 nM paclitaxel for 72 hours). Likewise, treatment with SAHA led to an increase in caspase-3 activity in all five isolates, whereas treatment with paclitaxel had no effect on caspase-3 activity in three of them. 2780AD cells were responsive to SAHA but resistant to paclitaxel. CONCLUSION: These ex vivo findings raise the possibility that SAHA may prove effective in the treatment of paclitaxel-resistant ovarian cancer in vivo

Modulation der Helix-Bündel-Bildung eines Bipyridin-funktionalisierten peptidischen Ionenkanals durch Komplexierung von Ni(II)

Ziel dieser Arbeit war es ein neues Sensorsystem basierend auf einer Liganden (Analyten)-gesteuerten Kontrolle der Assemblierung amphipatischer a-Helices zu entwickeln. Das Konzept basierte auf einem peptidischen Ionenkanal, der mit einer Rezeptorfunktion versehen wird, über die die Anbindung eines Analyten erfolgt. Als Peptidkomponente wurde das Peptid LS3 gewählt, von dem bekannt ist, dass es spannungsgesteuert in Lipiddoppelschichten insertiert und kationenselektive Ionenkanäle bildet. Eine an das Peptid gebundene Bipyridineinheit sollte als Rezeptorfunktion für das Übergangsmetallkation Ni2+ fungieren, da diese bekanntermaßen sehr stabile Komplexe miteinander ausbilden. Es wurde erwartet, dass sich die Bindung von Ni2+ an das rezeptorfunktionalisierte Peptid bpy*-LS3 in veränderten Kanaleigenschaften des Peptids, wie z. B. der Leitfähigkeit, der Öffnungsdauer oder der Kanalaktivität, widerspiegelt. Zunächst wurde das Peptid LS3 mittels automatisierter Festphasensynthese unter Anwendung der Fmoc/tert-Butyl-Taktik synthetisiert. Zur Anbindung der Rezeptorfunktion an den N-Terminus der Peptidhelix wurde ein 2,2´-Bipyridin-Derivat (bpy*) mit einem Alkylspacer und endständiger Carboxylfunktion hergestellt, so dass das rezeptorfunktionalisierte Peptid bpy*-LS3 erhalten wurde. Für das Peptid LS3 wurde bei Einzelkanalmessungen an klassischen BLMs in 0.5 M KCl bei einem Membranpotential von +200 mV eine Leitfähigkeit von (106 ± 28) pS und einer mittleren Öffnungsdauer von (1.82 ± 0.01) ms ermittelt. In nano-BLMs, welche die Poren von porösem Aluminiumoxid mit Porendurchmessern von 60 nm überspannen, wurden dagegen acht Leitfähigkeitsstufen im Bereich von (101 ± 19) pS bis (1011 ± 53) pS identifiziert und die mittlere Öffnungsdauer betrug (3.6 ± 0.1) ms. Das Auftreten von höheren Leitfähigkeitsstufen wurde auf eine durch die Porenstege des Substrats räumlich eingeschränkte Diffusion der Peptide in nano-BLMs zurückgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass die unterschiedlichen Leitfähigkeitsstufen von LS3 aus der Aggregation von 6 � 13 Monomeren resultieren. Die längere mittlere Öffnungsdauern in nano-BLMs kann auf einem geringeren Lösungsmittelanteil oder dem eingeschränkten Diffusionsraum basieren. Die Komplexierung des rezeptorfunktionalisierten Peptids bpy*-LS3 mit Ni2+ wurde UV-spektroskopisch belegt. Anhand der Rezeptorfunktion bpy* wurde gezeigt, dass der angebrachte Alkylspacer verglichen zu 2,2´-Bipyridin lediglich eine gewisse Destabilisierung des 3:1-Komplexes von bpy* mit Ni2+ verursacht. In Mizellen oder Vesikeln ist aufgrund einer starken Wechselwirkung der Rezeptorfunktion mit der hydrophoben Phase die Komplexbildung kinetisch retardiert. Das rezeptorfunktionalisierte Peptid bpy*-LS3 zeigte in klassischen BLMs lediglich ein Detergenz-ähnliches Verhalten, das auf eine Destabilisierung der Membran durch den Durchtritt der Rezeptorfunktion zurückgeführt werden kann. In die mechanisch stabileren nano-BLMs konnte bpy*-LS3 erfolgreich inkorporiert werden. Die bei einem Membranpotential von +200 mV in 0.5 M KCl ermittelten Leitfähigkeitsstufen betrugen G1 = (134 ± 20) pS, G2 = (181 ± 15) pS, G3 = (225 ± 27) pS und G4 = (373 ± 63) pS und resultierten ausgehend von einer hexameren Struktur aus Helix-Bündeln mit bis zu 9 Monomeren. Die Öffnungsdauer der Ionenkanäle wies eine exponentielle Verteilung 3. Ordnung auf mit drei mittleren Öffnungsdauern von tau1 = (3.6 ± 0.2) ms, tau2 = (15.1 ± 0.6) ms und tau3 = (63 ± 4) ms, die unabhängig von der Leitfähigkeitsstufe auftraten. Dies lässt auf das Vorliegen von drei Helix-Bündel-Populationen schließen, die sich in der räumlichen Orientierung der Rezeptorfunktionen unterscheiden. In Gegenwart von 2.5 � 5.0 uM Ni2+ konnte in nano-BLMs eine Modulation der Kanaleigenschaften des rezeptorfunktionalisierten Peptids bpy*-LS3 induziert werden. Zum einen nahm der Anteil an Ereignissen mit höherer Leitfähigkeit ab. Dies wurde darauf zurückgeführt, dass sich komplexierte Peptide innerhalb der Lipiddoppelschicht abstoßen, wodurch die Zahl der zur Bündelbildung fähigen Peptide abnimmt. Zum anderen konnte eine Abnahme der Häufigkeit von Ereignissen mit längerer Öffnungsdauer beobachtet werden. Es wurde geschlossen, dass diese Abnahme auf Helix-Bündeln basieren, in denen ein Großteil der Rezeptorfunktion in die wässrige Phase ragt. Aufgrund der elektrostatischen Abstoßung der komplexierten Peptide sinkt somit die Wahrscheinlichkeit für das Auftreten von längeren Ereignissen. Durch die Komplexbildung zwischen kovalent an ein amphipatisches Peptid gebundenem 2,2´-Bipyridin und Ni2+ konnte die Assemblierung der Peptide zu Helix-Bündeln modifiziert werden. Das entwickelte System könnte somit neue Perspektiven für die Entwicklung maßgeschneiderter Sensoren bieten

Functional Genes of Microorganisms, Comprehending the Dynamics of Agricultural Ecosystems

ABSTRACT The microbial composition of different types,in ecosystems (including agro-ecosystems), has been investigated in a rapidly growing number of studies in the past few years. The importance of microorganisms, regarding the maintenance and stability of nutrients in agroecosystems, is a key to maintain the sustainability of a crop. Molecular tools to study microbial communities are possible through many methods such as RISA, DGGE, TGGE, clone libraries, T-RFLP, RAPD, SSCP and more recently NGS (Next-Generation Sequencing). DGGE is widely employed to characterize the diversity and the community dynamics of microorganisms in the environment, making possible to find out specific groups through functional genes, allowing access to data that cannot be obtained by cultural methods. The aim of this paper is to review the functional groups related to agroecosystems and to indicate the critical choice of DNA primers pairs and targeted DNA regions that may be used in PCR-based methods such as the DGGE technique in order to evaluate the microbial communities in a variety of environments

Cas9-Mediated Nanopore Sequencing Enables Precise Characterization of Structural Variants in CCM Genes

Deletions in the CCM1, CCM2, and CCM3 genes are a common cause of familial cerebral cavernous malformations (CCMs). In current molecular genetic laboratories, targeted next-generation sequencing or multiplex ligation-dependent probe amplification are mostly used to identify copy number variants (CNVs). However, both techniques are limited in their ability to specify the breakpoints of CNVs and identify complex structural variants (SVs). To overcome these constraints, we established a targeted Cas9-mediated nanopore sequencing approach for CNV detection with single nucleotide resolution. Using a MinION device, we achieved complete coverage for the CCM genes and determined the exact size of CNVs in positive controls. Long-read sequencing for a CCM1 and CCM2 CNV revealed that the adjacent ANKIB1 and NACAD genes were also partially or completely deleted. In addition, an interchromosomal insertion and an inversion in CCM2 were reliably re-identified by long-read sequencing. The refinement of CNV breakpoints by long-read sequencing enabled fast and inexpensive PCR-based variant confirmation, which is highly desirable to reduce costs in subsequent family analyses. In conclusion, Cas9-mediated nanopore sequencing is a cost-effective and flexible tool for molecular genetic diagnostics which can be easily adapted to various target regions