Small-Extracellular-Vesicle-Derived miRNA Profile Identifies miR-483-3p and miR-326 as Regulators in the Pathogenesis of Antiphospholipid Syndrome (APS)

Antiphospholipid syndrome; Pathogenesis; Small extracellular vesicleSíndrome antifosfolípid; Patogènesi; Petita vesícula extracel·lularSíndrome antifosfolípido; Patogénesis; Pequeña vesícula extracelularPrimary antiphospholipid syndrome (PAPS) is a systemic autoimmune disease associated with recurrent thrombosis and/or obstetric morbidity with persistent antiphospholipid antibodies (aPL). Although these antibodies drive endothelial injury and thrombophilia, the underlying molecular mechanism is still unclear. Small extracellular vesicles (sEVs) contain miRNAs, key players in intercellular communication. To date, the effects of miRNA-derived sEVs in PAPS are not well understood. We characterised the quantity, cellular origin and miRNA profile of sEVs isolated from thrombotic APS patients (PAPS, n = 50), aPL-carrier patients (aPL, n = 30) and healthy donors (HD, n = 30). We found higher circulating sEVs mainly of activated platelet origin in PAPS and aPL patients compared to HD, that were highly engulfed by HUVECs and monocyte. Through miRNA-sequencing analysis, we identified miR-483-3p to be differentially upregulated in sEVs from patients with PAPS and aPL, and miR-326 to be downregulated only in PAPS sEVs. In vitro studies showed that miR-483-3p overexpression in endothelial cells induced an upregulation of the PI3K-AKT pathway that led to endothelial proliferation/dysfunction. MiR-326 downregulation induced NOTCH pathway activation in monocytes with the upregulation of NFKB1, tissue factor and cytokine production. These results provide evidence that miRNA-derived sEVs contribute to APS pathogenesis by producing endothelial cell proliferation, monocyte activation and adhesion/procoagulant factors

Estudio de la expresión génica de hSOD1 en animales modelo SOD1G93A de distinta progresión de Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA)

La esclerosis lateral amiotrófica o ELA es una enfermedad neurodegenerativa que afecta a las neuronas motores superiores del cerebro y a las neuronas motoras inferiores del tronco encefálico y de la médula espinal, produciendo un deterioro progresivo que termina en una parálisis mortal. Se distinguen dos clases de ELA: la primera de ellas es la ELA familiar, que afecta al 5-10% de los pacientes y está producida por una alteración genética heredable; la segunda es la ELA esporádica, cuyas causas genéticas se desconocen y afecta entorno al 90-95% de los pacientes de ELA. La alteración de la enzima SOD1 se ha observado en el 12-20% de los pacientes de ELA familiar y en el 1% de los pacientes de ELA esporádica. La enzima superóxido dismutasa Cu-Zn o SOD1 es una enzima citosólica que es capaz de eliminar los radicales superóxido que se forman en el interior celular. La complejidad de la enfermedad dificulta el encontrar modelos animales adecuados y también el trasladar los resultados obtenidos a la clínica. En este proyecto se ha trabajado con el modelo de ratón SOD1G93A, que permite caracterizar las etapas de progresión de la enfermedad y desarrollar nuevas terapias. Es un modelo especialmente útil en el estudio de las formas más agresivas de la enfermedad. Sin embargo, se ha observado que en ocasiones puede producirse la pérdida de copias del transgén, lo que altera el fenotipo que presentan los ratones. En este trabajo se determina el número de copias de los ratones utilizados para comprobar si se mantiene constante entre los individuos sometidos a un tratamiento antioxidante y los individuos control, y se analiza si el número de copias se encuentra relacionado con la longevidad de los animales independientemente del tratamiento recibido.<br /

Estudio de genes relacionados con la longevidad en un modelo animal de Esclerosis Lateral Amiotrófica

La Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA) es una enfermedad rara que cursa con una degeneración paulatina de las motoneuronas superiores e inferiores. Se ha estudiado la ELA familiar en esta investigación dado que el modelo de ratón utilizado hSOD1-G93A corresponde a este tipo. Los objetivos perseguidos eran estudiar diversas zonas de un gen o genes que se relacionaran con la longevidad en este modelo, tratando de averiguar si existen mutaciones en estos genes que puedan influir en la supervivencia de los animales. Tras el genotipado de los ratones y conociendo su longevidad, se seleccionó el gen FOXO3, cuya relación con la esperanza de vida de las personas parecía ser prometedor para hallar resultados similares en estos animales. Para ello, se llevó a cabo el diseño de los primers que se precisaban para poder realizar la amplificación mediante PCR de este gen en las muestras. Fue necesaria también una puesta a punto de la PCR para el gen FOXO3, que una vez lograda, fue efectuada en las muestras problema. Posteriormente se enviaron a secuenciar estos fragmentos amplificados para comprobar si efectivamente existía algún polimorfismo de un solo nucleótido (SNP). Se corroboró finalmente, tras su análisis en BioEdit, que había una posibilidad muy baja de que esa hipótesis fuese cierta, ya que además de encontrarse inserciones en las muestras más longevas, se halló en alguna muestra que no lo era, y por tanto, se concluyó que no había SNPs. Además, estas inserciones coincidían con la zona de hibridación de los primers, por lo que los resultados no eran fiables. Por ello, se sugieren futuros estudios con una zona de amplificación mayor para el gen FOXO3 para ratificar o descartar nuestra hipótesis con mayor seguridad.<br /

Implicación de la inflamación en la Esclerosis Lateral Amiotrófica: identificación de biomarcadores y dianas terapéuticas

La esclerosis lateral amiotrófica (ELA) es una enfermedad neurodegenerativa que afecta a la motoneurona superior, situada en el córtex motor, y a la motoneurona inferior, situada en el asta anterior de la médula espinal. La pérdida progresiva de motoneuronas conlleva una parálisis y atrofia muscular que desencadena el fallecimiento del paciente en un periodo promedio de 3 a 5 años tras el inicio de los síntomas, generalmente debido a un fallo respiratorio. Actualmente los únicos tratamientos que existen son paliativos, y, en la mayoría de los casos, se desconocen las causas que provocan esta enfermedad. No obstante, se han estudiado numerosos mecanismos moleculares que se han visto implicados en la patogenia de la ELA, entre ellos la inflamación. Este mecanismo está caracterizado por la activación de la microglía, astrogliosis, infiltración de los linfocitos T y monocitos, y una superproducción de citoquinas inflamatorias que conlleva a un daño progresivo en la motoneurona, contribuyendo a la progresión de la enfermedad.El objetivo general de la presente memoria de Tesis Doctoral fue estudiar el papel de la inflamación en la ELA mediante la identificación de biomarcadores y dianas terapéuticas con el fin de trasladarlos finalmente a la práctica clínica. Para ello, en primer lugar, se estudió un panel de 97 citoquinas en plasma de animales SOD1G93A presintomáticos con el fin de identificar aquellas citoquinas cuya expresión pudiera estar alterada y que además pudieran servir de ayuda al diagnóstico. Los resultados mostraron que los niveles de 16 citoquinas estaban modificados en el modelo animal con respecto a sus controles, indicando que existe una desregulación del sistema inmune en una fase temprana de la enfermedad. A continuación, se estudió la capacidad pronóstica de dichas citoquinas correlacionando sus niveles en sangre en diferentes estadios con la supervivencia de los animales SOD1G93A. A pesar de que se observó una mayor expresión de estas citoquinas en los animales que mostraron una menor supervivencia, no se pudo identificar ninguna proteína como biomarcador pronóstico debido a su gran variabilidad en sangre. Por este motivo se eligió una de las citoquinas que había mostrado una mayor correlación, la IL-6, para estudiarla en los tejidos más afectados por la enfermedad, en concreto en la médula espinal y músculo esquelético del modelo animal SOD1G93A; además, se investigó su papel como biomarcador en sangre de pacientes de ELA. Se observó un incremento en la expresión de IL-6 en los animales modelo frente a sus controles a partir del estadio sintomático temprano en el músculo extensor digital largo, que es un músculo con predominio de fibras de contracción rápida las cuales se encuentran más dañadas por la enfermedad. Estos resultados sugieren el estudio de dicha proteína como biomarcador en músculo esquelético con predominio de fibras de contracción rápida en el modelo animal, y, en un futuro, en pacientes. Posteriormente, se investigó la modificación de las citoquinas sanguíneas desreguladas y otras proteínas relacionadas con la inflamación tras la aplicación de un tratamiento neuroprotector basado en el fragmento C de la toxina tetánica (TTC) en el modelo animal SOD1G93A para analizar la capacidad predictiva de marcadores inflamatorios para su utilización en ensayos clínicos. Los resultados mostraron una disminución en la expresión de IL-6 en plasma, médula espinal y músculo esquelético de los animales tratados con TTC, indicando que dicha proteína podría tener un papel predictivo en la enfermedad. Finalmente, se evaluó el papel de marcadores inflamatorios como dianas terapéuticas en ELA. Para ello, nos centramos en el efecto de la reducción de los niveles génicos de granzima A (gzmA), implicada en procesos pro-inflamatorios, sobre la supervivencia de los animales SOD1G93A. Los resultados mostraron que los ratones SOD1G93A heterocigotos (gzmA +/-), donde encontramos una menor expresión de gmzA, IL-1β y GSR, vivieron más que los ratones SOD1G93A homocigotos gzmA +/+. Esto confirmó que el aumento de la supervivencia estaba asociada a una menor expresión de este gen pero no a su ausencia, ya que los animales SOD1G93A homocigotos (gzmA -/-) no mostraron una supervivencia mayor con respecto a los controles. Por tanto, estos resultados indicaron que una reducción intermedia de los niveles de gzmA puede favorecer una progresión más lenta de la enfermedad en este modelo animal.En conclusión, la alteración mostrada en diversas citoquinas pro-inflamatorias en el modelo animal SOD1G93A desde estadios tempranos hasta estadios terminales resulta ser muy variable, lo que dificulta su papel como biomarcadores de la enfermedad. No obstante, dicha alteración se presenta como una futura diana terapéutica para la esclerosis lateral amiotrófica.<br /

The challenge of maintaining successful aging at 87 years old: the Octabaix study two-year follow-up

Preserving physical and cognitive function is crucial to successful aging. The objective of this study is to determine how many 87-year-old community-dwelling subjects continued to age successfully, according to a definition using a quantitative approach, and to assess the predictive value of certain factors evaluated 2 years previously. A total of 162 participants were assessed. Sociodemographic variables, the Barthel Index (BI), the Spanish version of the Mini-Mental State Examination (MEC), the Mini Nutritional Assessment (MNA), the Charlson Index, the Gait Rating Scale, social risk, quality of life, prevalent chronic diseases, and chronic drug prescription were collected. All subjects with scores over 90 points on the BI and above 23 points on the MEC were compared with the rest of the participants. A multiple regression analysis was performed. With the selected criteria, 90 (61.6%) community-dwelling subjects continued to age successfully. The multiple logistic regression analysis showed that the following were significantly associated with continued successful aging: A higher level of studies (p<0.02, odds ratio [OR] 3.223, 95% confidence interval [CI] 1.158-8.975), better MEC scores (p<0.01, OR 1.204, 95% CI 1.046-1.386) and Tinetti gait scale scores (p<0.01, OR 1.433, 95% CI 1.013-2.027), and fewer chronic drug prescriptions (p<0.001, OR 0.768, 95% CI 0.655-0.899). In conclusion, more than half of the individuals continued to age successfully. In subjects aged 87 years, the factors associated with continued successful aging were longer schooling, better cognition scores, lower risk of falls, and fewer chronic drug prescriptions at baseline evaluation

What skeletal muscle has to say in ALS: implications for therapy

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is an adult onset disorder characterised by progressive neuromuscular junction (NMJ) dismantling and degeneration of motor neurons leading to atrophy and paralysis of voluntary muscles responsible for motion and breathing. Except for a minority of patients harbouring genetic mutations, the origin of most ALS cases remains elusive. Peripheral tissues, and particularly skeletal muscle, have lately demonstrated an active contribution to disease pathology attracting a growing interest for these tissues as therapeutic targets in ALS. In this sense molecular mechanisms essential for cell and tissue homeostasis have been shown to be de‐regulated in the disease. These include muscle metabolism and mitochondrial activity, RNA processing, tissue‐resident stem cell function responsible for muscle regeneration, and proteostasis that regulates muscle mass in adulthood. This review aims to compile scientific evidence that demonstrates the role of skeletal muscle in ALS pathology and serve as reference for development of novel therapeutic strategies targeting this tissue to delay disease onset and progression

Encapsulation of Large-Size Plasmids in PLGA Nanoparticles for Gene Editing: Comparison of Three Different Synthesis Methods

The development of new gene-editing technologies has fostered the need for efficient and safe vectors capable of encapsulating large nucleic acids. In this work we evaluate the synthesis of large-size plasmid-loaded PLGA nanoparticles by double emulsion (considering batch ultrasound and microfluidics-assisted methodologies) and magnetic stirring-based nanoprecipitation synthesis methods. For this purpose, we characterized the nanoparticles and compared the results between the different synthesis processes in terms of encapsulation efficiency, morphology, particle size, polydispersity, zeta potential and structural integrity of loaded pDNA. Our results demonstrate particular sensibility of large pDNA for shear and mechanical stress degradation during double emulsion, the nanoprecipitation method being the only one that preserved plasmid integrity. However, plasmid-loaded PLGA nanoparticles synthesized by nanoprecipitation did not show cell expression in vitro, possibly due to the slow release profile observed in our experimental conditions. Strong electrostatic interactions between the large plasmid and the cationic PLGA used for this synthesis may underlie this release kinetics. Overall, none of the methods evaluated satisfied all the requirements for an efficient non-viral vector when applied to large-size plasmid encapsulation. Further optimization or alternative synthesis methods are thus in current need to adapt PLGA nanoparticles as delivery vectors for gene editing therapeutic technologies

Causes of death in a contemporary cohort of patients with invasive aspergillosis

Information regarding the processes leading to death in patients with invasive aspergillosis (IA) is lacking. We sought to determine the causes of death in these patients, the role that IA played in the cause, and the timing of death. The factors associated with IA-related mortality are also analyzed. We conducted a multicenter study (2008-2011) of cases of proven and probable IA. The causes of death and whether mortality was judged to be IA-related or IA-unrelated were determined by consensus using a six-member review panel. A multivariate analysis was performed to determine risk factors for IA-related death. Of 152 patients with IA, 92 (60.5%) died. Mortality was judged to be IA-related in 62 cases and IA-unrelated in 30. The most common cause of IA-related death was respiratory failure (50/62 patients), caused primarily by Aspergillus infection, although also by concomitant infections or severe comorbidities. Progression of underlying disease and bacteremic shock were the most frequent causes of IA-unrelated death. IA-related mortality accounted for 98% and 87% of deaths within the first 14 and 21 days, respectively. Liver disease (HR 4.54; 95% CI, 1.69-12.23) was independently associated with IA-related mortality, whereas voriconazole treatment was associated with reduced risk of death (HR 0.43; 95% CI, 0.20-0.93). In conclusion, better management of lung injury after IA diagnosis is the main challenge for physicians to improve IA outcomes. There are significant differences in causes and timing between IA-related and IA-unrelated mortality and these should be considered in future research to assess the quality of IA car

The prognostic impact of minimal residual disease in patients with chronic lymphocytic leukemia requiring first-line therapy.

A proportion of patients with chronic lymphocytic leukemia achieve a minimal residual disease negative status after therapy. We retrospectively evaluated the impact of minimal residual disease on the outcome of 255 consecutive patients receiving any front-line therapy in the context of a detailed prognostic evaluation, including assessment of IGHV, TP53, NOTCH1 and SF3B1 mutations. The median follow-up was 73 months (range, 2-202) from disease evaluation. The median treatment-free survival durations for patients achieving a complete response without or with minimal residual disease, a partial response and no response were 76, 40, 11 and 11 months, respectively (P<0.001). Multivariate analysis revealed that three variables had a significant impact on treatment-free survival: minimal residual disease (P<0.001), IGHV status (P<0.001) and β2-microglobulin levels (P=0.012). With regards to overall survival, factors predictive of an unfavorable outcome were minimal residual disease positivity (P=0.014), together with advanced age (P<0.001), unmutated IGHV status (P=0.001), TP53 mutations (P<0.001) and elevated levels of β2-microglobulin (P=0.003). In conclusion, for patients requiring front-line therapy, achievement of minimal residual disease negativity is associated with significantly prolonged treatment-free and overall survival irrespective of other prognostic markers or treatment administered

Pastores trashumantes del Neolítico antiguo en un entorno de alta montaña: secuencia crono-cultural de la Cova de Els Trocs (San Feliú de Veri, Huesca)

This paper presents the preliminary results of the excavation of the “Els Trocs’’ Cave, developed in the context of the research project “The pathways of the Neolithic”. The careful and detailed work of excavation and recording has revealed a complex stratigraphy in which, thanks to the radiocarbon dates on short-lived samples (cereal seeds, human bones and domestic animal remains), it has been possible to distinguish four different periods of occupation inside the cave. With this information and some preliminary analyses of part of the materials (pottery, flint and faunal remains), we have documented the presence of a human group in the mountain pastures of the axial Pyrennes, at a very early stage (beginning of the last third of the Vlth millennium cal. BC), with a transhumant pastoral economy. It was a fully neolithic population with clear evidences of the use of wheat and barley, despite they did not cultivate around the close environment of this cave, where complex burial rituals had been also documented.Este trabajo presenta los resultados preliminares obtenidos en la excavación de la Cova de Els Trocs, desarrollada dentro del proyecto de investigación "Los caminos del Neolítico". La minuciosa labor de excavación y de registro ha permitido establecer una compleja secuencia estratigráfica en la que, gracias a una veintena de dataciones radiocarbónicas sobre eventos singulares de vida corta (semillas de cereal, huesos humanos y fauna doméstica), se han podido diferenciar cuatro momentos de ocupación distintos de la cueva. Con estos datos y algunos análisis, también preliminares, de parte del registro (cerámica, sílex y restos faunísticos), se ha podido definir, en una época muy temprana (inicios del último tercio del VI milenio cal. BC.), la presencia en los pastos de montaña del Pirineo axial de un grupo humano que desarrolla una actividad pastoril trashumante. Una población plenamente neolitizada, que conoce el trigo y la cebada, aunque no los cultive en el entorno de la cueva, y que, a tenor de ciertas evidencias, practica complejos rituales tanatológicos