Desxifrant mecanismes enzimàtics per mitjà d'eines computacionals: implicacions biotecnològiques en l'estudi de glicosidases

El creixement de la glicòmica (camp anàleg al de la genòmica o la proteòmica però centrat en glicòsids) i el desenvolupament de tests de diagnòstic, vacunes i nous fàrmacs basats en carbohidrats es veuen afectats per la falta de mètodes eficients per a la seva producció. La síntesi enzimàtica, caracteritzada per la seva gran estereo- i regioselectivitat duta a terme en condicions suaus, representa una encoratjadora solució per resoldre aquest problema. En aquest aspecte, les glicosilhidrolases (GH) amb retenció de configuració tenen un gran potencial per ser redissenyades per sintetitzar carbohidrats per transglicosidació. La conversió de glicosidases (GH) a transglicosidases (TG), és a dir, d'enzims que hidrolitzen carbohidrats a enzims que els sintetitzen, ha estat molt estudiada en els darrers anys. Tot i així, la falta d'estructures d'enzims i el desconeixement dels detalls dels mecanismes de reacció limiten el disseny racional de TG. En aquest article exposem com la química teòrica i les simulacions de dinàmica molecular de primers principis poden aportar el coneixement fonamental per a la producció d'aquestes valuoses variants enzimàtiques

Computer Simulation to Rationalize "Rational" Engineering of Glycoside Hydrolases and Glycosyltransferases

Glycoside hydrolases and glycosyltransferases are the main classes of enzymes that synthesize and degrade carbohydrates, molecules essential to life that are a challenge for classical chemistry. As such, considerable efforts have been made to engineer these enzymes and make them pliable to human needs, ranging from directed evolution to rational design, including mechanism engineering. Such endeavors fall short and are unreported in numerous cases, while even success is a necessary but not sufficient proof that the chemical rationale behind the design is correct. Here we review some of the recent work in CAZyme mechanism engineering, showing that computational simulations are instrumental to rationalize experimental data, providing mechanistic insight into how native and engineered CAZymes catalyze chemical reactions. We illustrate this with two recent studies in which (i) a glycoside hydrolase is converted into a glycoside phosphorylase and (ii) substrate specificity of a glycosyltransferase is engineered toward forming O-, N-, or S-glycosidic bonds

Enzymatic Hydrolysis of Human Milk Oligosaccharides. The Molecular Mechanism of Bifidobacterium Bifidum Lacto-N-biosidase

Bifidobacterium bifidum lacto-N-biosidase (LnbB) is a critical enzyme for the degradation of human milk oligosaccharides in the gut microbiota of breast-fed infants. Guided by recent crystal structures, we unveil its molecular mechanism of catalysis using QM/MM metadynamics. We show that the oligosaccharide substrate follows 1S3/1,4B → [4E]¿ → 4C1/4H5 and 4C1/4H5 → [4E/4H5]¿ → 1,4B conformational itineraries for the two successive reaction steps, with reaction free energy barriers in agreement with experiments. The simulations also identify a critical histidine (His263) that switches between two orientations to modulate the pKa of the acid/base residue, facilitating catalysis. The reaction intermediate of LnbB is best depicted as an oxazolinium ion, with a minor population of neutral oxazoline. The present study sheds light on the processing of oligosaccharides of the early life microbiota and will be useful for the engineering of LnbB and similar glycosidases for biocatalysis

Selective derivatization of N-terminal cysteines using cyclopentenediones

The outcome of the Michael-type reaction between thiols and 2,2-disubstituted cyclopentenediones varies depending on the thiol. Stable compounds with two fused rings were formed upon reaction with 1,2-aminothiols (such as N-terminal cysteines in peptides). Other thiols gave reversibly Michael-type adducts that were in equilibrium with the starting materials. This differential reactivity allows differently placed cysteines to be distinguished and has been exploited to prepare bioconjugates incorporating two or three different moieties

Redesigning the coumarin scaffold into small bright fluorophores with far-red to NIR emission and large Stokes' shifts useful for cell imaging

Among the palette of previously described fluorescent organic molecules, coumarins are ideal candidates for developing cellular and molecular imaging tools due to their high cell permeability and minimal perturbation of living systems. However, blue-to-cyan fluorescence emission is usually difficultin in vivo applications due to the inherent toxicity and poor tissue penetration of short visible light wavelengths. Here, we introduce a new family of coumarin-based fluorophores, nicknamed COUPY, with promising photophysical properties, including emission in the far-red/near-infrared (NIR) region, large Stokes shifts, high photostability, and excellent brightness. COUPY fluorophores were efficiently synthesized in only three linear synthetic steps from commercially available precursors, with the N-alkylation of a pyridine moiety being the key step at the end of the synthetic route, as it allows for the tuning of the photophysical properties of the resulting dye. Owing to their low molecular weights, COUPY dyes show excellent cell permeability and accumulate selectively in nucleoli and/or mitochondria of HeLa cells, as their far-red/NIR fluorescence emission is easily detected at a concentration as low as 0.5 μ M after an incubation of only 20 min. We anticipate that these coumarin scaffolds will open a way to the development of novel coumarin-based far-red to NIR emitting fluorophores with potential applications for organelle imaging and biomolecule labeling

Do Thiols Merely Passivate Gold Nanoclusters?

A Comment on the Letter by H. Hakkinen, R. N. Barnett, and U. Landman, Phys. Rev. Lett. 82, 3264 (1999)

Phosphorylation disrupts long-distance electron transport in cytochrome c

It has been recently shown that electron transfer between mitochondrial cytochrome c and the cytochrome c1 subunit of the cytochrome bc1 can proceed at long-distance through the aqueous solution. Cytochrome c is thought to adjust its activity by changing the affinity for its partners via Tyr48 phosphorylation, but it is unknown how it impacts the nanoscopic environment, interaction forces, and long-range electron transfer. Here, we constrain the orientation and separation between cytochrome c1 and cytochrome c or the phosphomimetic Y48pCMF cytochrome c, and deploy an array of single-molecule, bulk, and computational methods to investigate the molecular mechanism of electron transfer regulation by cytochrome c phosphorylation. We demonstrate that phosphorylation impairs long-range electron transfer, shortens the long-distance charge conduit between the partners, strengthens their interaction, and departs it from equilibrium. These results unveil a nanoscopic view of the interaction between redox protein partners in electron transport chains and its mechanisms of regulation

Estudi teòric d'interaccions intermoleculars en sistemes senzills i cristalls orgànics moleculars

[spa] El citado trabajo de tesis doctoral está dividido en tres partes complementarias. En una primera parte se han estudiado -mediante metodos “ab intio”- sistemas sencillos que contienen interacciones de diferente naturaleza: interacciones por puente de hidrógeno fuerte en trimeros constituídos por H2O y HF; interacciones por puente de hidrógeno débil en dímeros hidrocarburo...H2O y hidrocarburo H2S (hidrocarburo = C2H2, C2H4, CH4), y interacciones no enllazantes S...S en sistemas R1HS...SHR4 (R1,R2=-CH3,-CH=CH2,-CH=O,SOC2H2). En la segunda parte se ha estudiado la estructura cristalina de dadores neutros de la familia del tetratiofulvaleno (TTF) con el objetivo de racionalizar su empaquetamiento, el cual viene determinado por interacciones intermoleculares del tipo analizado en la primera parte. En la tercera parte se ha realizado un análisis de la estructura electrónica de bandas tanto de cristales de dadores neutros como de sales de transferencia de carga derivadas de los anteriores. Las conclusiones generales que se pueden extraer del estudio global se pueden resumir con lo siguiente: las interacciones débiles que tienen lugar a través de enlaces de tipo C(SPN)-H(N=2,3) -las cuales ya en sistemas sencillos conservan las caracteristicas de las interacciones por puente de hidrogeno- dictan el empaquetamiento de cristales de la familia del TTF, mientras que las interacciones S...S tienen un papel secundario y son muy anisotrópicas. Por otra parte, las moleculas dadoras con enlaces C(SPN)-H darán lugar a cristales que cumplan (ya como neutros) con los requerimientos para producir una deslocalizacion electrónica importante. Este hecho convierte a estos dadores en muy buenos candidatos como precursores de sales de transferencia de carga con buenas propiedades metálicas hasta temperaturas bajas y que, por tanto, puedan alcanzar el estado superconductor

Estudi teòric d'interaccions intermoleculars en sistemes senzills i cristalls orgànics moleculars

El citado trabajo de tesis doctoral está dividido en tres partes complementarias. En una primera parte se han estudiado -mediante metodos “ab intio”- sistemas sencillos que contienen interacciones de diferente naturaleza: interacciones por puente de hidrógeno fuerte en trimeros constituídos por H2O y HF; interacciones por puente de hidrógeno débil en dímeros hidrocarburo...H2O y hidrocarburo H2S (hidrocarburo = C2H2, C2H4, CH4), y interacciones no enllazantes S...S en sistemas R1HS...SHR4 (R1,R2=-CH3,-CH=CH2,-CH=O,SOC2H2). En la segunda parte se ha estudiado la estructura cristalina de dadores neutros de la familia del tetratiofulvaleno (TTF) con el objetivo de racionalizar su empaquetamiento, el cual viene determinado por interacciones intermoleculares del tipo analizado en la primera parte. En la tercera parte se ha realizado un análisis de la estructura electrónica de bandas tanto de cristales de dadores neutros como de sales de transferencia de carga derivadas de los anteriores. Las conclusiones generales que se pueden extraer del estudio global se pueden resumir con lo siguiente: las interacciones débiles que tienen lugar a través de enlaces de tipo C(SPN)-H(N=2,3) -las cuales ya en sistemas sencillos conservan las caracteristicas de las interacciones por puente de hidrogeno- dictan el empaquetamiento de cristales de la familia del TTF, mientras que las interacciones S...S tienen un papel secundario y son muy anisotrópicas. Por otra parte, las moleculas dadoras con enlaces C(SPN)-H darán lugar a cristales que cumplan (ya como neutros) con los requerimientos para producir una deslocalizacion electrónica importante. Este hecho convierte a estos dadores en muy buenos candidatos como precursores de sales de transferencia de carga con buenas propiedades metálicas hasta temperaturas bajas y que, por tanto, puedan alcanzar el estado superconductor

Desxifrant mecanismes enzimàtics per mitjà d'eines computacionals: implicacions biotecnològiques en l'estudi de glicosidases

El creixement de la glicòmica (camp anàleg al de la genòmica o la proteòmica però centrat en glicòsids) i el desenvolupament de tests de diagnòstic, vacunes i nous fàrmacs basats en carbohidrats es veuen afectats per la falta de mètodes eficients per a la seva producció. La síntesi enzimàtica, caracteritzada per la seva gran estereo- i regioselectivitat duta a terme en condicions suaus, representa una encoratjadora solució per resoldre aquest problema. En aquest aspecte, les glicosilhidrolases (GH) amb retenció de configuració tenen un gran potencial per ser redissenyades per sintetitzar carbohidrats per transglicosidació. La conversió de glicosidases (GH) a transglicosidases (TG), és a dir, d'enzims que hidrolitzen carbohidrats a enzims que els sintetitzen, ha estat molt estudiada en els darrers anys. Tot i així, la falta d'estructures d'enzims i el desconeixement dels detalls dels mecanismes de reacció limiten el disseny racional de TG. En aquest article exposem com la química teòrica i les simulacions de dinàmica molecular de primers principis poden aportar el coneixement fonamental per a la producció d'aquestes valuoses variants enzimàtiques