Induction of Membrane Ceramides: A Novel Strategy to Interfere with T Lymphocyte Cytoskeletal Reorganisation in Viral Immunosuppression

Silencing of T cell activation and function is a highly efficient strategy of immunosuppression induced by pathogens. By promoting formation of membrane microdomains essential for clustering of receptors and signalling platforms in the plasma membrane, ceramides accumulating as a result of membrane sphingomyelin breakdown are not only essential for assembly of signalling complexes and pathogen entry, but also act as signalling modulators, e. g. by regulating relay of phosphatidyl-inositol-3-kinase (PI3K) signalling. Their role in T lymphocyte functions has not been addressed as yet. We now show that measles virus (MV), which interacts with the surface of T cells and thereby efficiently interferes with stimulated dynamic reorganisation of their actin cytoskeleton, causes ceramide accumulation in human T cells in a neutral (NSM) and acid (ASM) sphingomyelinase–dependent manner. Ceramides induced by MV, but also bacterial sphingomyelinase, efficiently interfered with formation of membrane protrusions and T cell spreading and front/rear polarisation in response to β1 integrin ligation or αCD3/CD28 activation, and this was rescued upon pharmacological or genetic ablation of ASM/NSM activity. Moreover, membrane ceramide accumulation downmodulated chemokine-induced T cell motility on fibronectin. Altogether, these findings highlight an as yet unrecognised concept of pathogens able to cause membrane ceramide accumulation to target essential processes in T cell activation and function by preventing stimulated actin cytoskeletal dynamics

Rafts lipidiques et activation lymphocytaire par le complexe CD3-TCR (rôle du cholestérol et de la sphingomyeline)

La membrane plasmique des lymphocytes T CD4+ contiendrait, in vivo, des microdomaines ordonnés appelés rafts. Expérimentalement, ces derniers sont purifiés sous forme de DRM (" detergent-resistant membranes ") particulièrement riches en cholestérol et en sphingomyéline (SM). Un nombre croissant d'études montre que ces rafts jouent un rôle essentiel dans l'activation lymphocytaire par CD3. En effet, son engagement permet le recrutement de molécules clés dans les rafts et la désorganisation de ces structures lipidiques par des agents pharmacologiques inhibent les signaux émis par CD3. La déplétion en cholestérol par la méthyl-b-cyclodextrine (m-b-CD) est devenue la méthode la plus utilisée pour désorganiser les rafts. Parce que son utilisation a révélé d'importants désaccords, certains auteurs doutent de l'importance des rafts dans l'activation lymphocytaire. Tenant compte de ces résultats contradictoires, nous avons entrepris des doses-réponses et des cinétiques de m-b-CD. Nous avons démontré que les lymphocytes T contiennent deux " pools " cinétiques de cholestérol. Il y a un " pool " rapide correspondant aux rafts (31,5%, t1/2=17 secondes) et un " pool " lent (68,5%, t1/2=15 minutes) correspondant au reste des membranes cellulaires. L'extraction spécifique du cholestérol des rafts suffit à inhiber les flux calciques induits par CD3 mais cette inhibition est due à une forte dépolarisation de la membrane plasmique. En revanche, il est nécessaire d'enlever le cholestérol du " pool " lent pour inhiber les phosphorylations sur tyrosine. De plus, nous avons démontré que la désorganisation des rafts grâce à l'oxydation spécifique du cholestérol par la cholestérol oxydase (COase) n'inhibe absolument pas l'activation lymphocytaire (étude des phosphorylations, de l'interaction PLCg1-LAT, des flux calciques, de la production de diacylglycérol (DAG), du remaniement du cytosquelette d'actine et de l'expression de CD69 et de CD25). Nous avons alors émis deux hypothèses : soit l'activation lymphocytaire ne passe pas par les rafts, soit elle utilise des rafts dépourvus de cholestérol et qui pourraient être extrêmement riches en sphingolipides comme il en a déjà été décrit dans la littérature. De manière intéressante, nous avons montré que les traitements longs par la m-b-CD, qui inhibent le TCR, extraient également les SM des rafts. Nous avons alors étudié l'effet de la sphingomyélinase (SMase) exogène sur l'activation lymphocytaire. La SMase transforme les rafts en domaines qui sont riches en céramides et pauvres en cholestérol. Ces " ceramides-rich domains " (CRD) permettent toujours aux phosphorylations d'avoir lieu, seuls les flux calciques et le DAG sont inhibés, mais cela est explicable par la baisse du potentiel de membrane. En revanche, nous avons montré que l'inhibition de la synthèse des sphingolipides par la Fumonisine B1 (FB1) empêche l'activation tardive des Jurkat ; le PDMP, inhibiteur de la synthèse de glycosphingolipides (GSL), n'ayant aucun effet, nos résultats suggèrent un rôle important pour les SM dans l'activation lymphocytaire. En conclusion, nos quatre années de recherches nous permettent d'affirmer avec conviction que les rafts enrichis en cholestérol ne sont pas indispensables à la propagation des signaux émis par le complexe CD3-TCR. Peut-être passent-ils par des rafts enrichis en sphingolipides, peut-être passent-ils hors des rafts ? Le débat reste ouvert.NICE-BU Sciences (060882101) / SudocSudocFranceF