Nitrous oxide from fungal denitrification - Pure culture and soil studies using stable isotope and microbial inhibitor approaches

Das Spurengas Lachgas (N2O) trägt zur Klimaerwärmung und Zerstörung der Ozonschicht in der Atmosphäre bei. Mit einem Anteil von ca. 70% sind landwirtschaftliche Böden weltweit Hauptverursacher der hohen anthropogenenN2O Emissionen. N2O entsteht in Böden durch verschiedene mikrobiologische Prozesse, bei denen N2O unter anderem aus düngerbürtigem N gebildet wird. Die Entwicklung effektiver Minderungsmaßnahmen wird erst möglich, wenn ein Verständnis der N2O Quellprozesse und ihrer Dynamik in Böden vorhanden ist. In dieser Studie wurde die Denitrifikation als ein Quellprozess untersucht, der zusammen mit Nitrifikation und Nitrifizierer-Denitrifikation hauptsächlich für die N2O Emissionen aus Böden verantwortlich ist. Die Denitrifikation beschreibt die Reduktion von Nitrat (NO3-) zu N2, wobei Nitrit (NO2-), Stickstoffmonoxid (NO) und N2O Zwischenprodukte dieses Reaktionsweges sind. Lange Zeit galten heterotrophe Bakterien als alleinige Verursacher von N2O Emissionen aus der Denitrifikation. Im Jahr 1972 wurde allerdings in Versuchen mit Pilzreinkulturen nachgewiesen, dass auch Pilze in der Lage sind, N2O über die Denitrifikation zu bilden. Zwei Jahrzehnte später wurde gezeigt, dass den meisten Pilzen das Enzym N2O-Reduktase fehlt. Somit ist nicht N2, sondern N2O das hauptsächliche Endprodukt der pilzlichen Denitrifikation. Dies lässt vermuten, dass die Bildung von N2O durch pilzliche Denitrifikation noch unterschätzt wird, vorausgesetzt Pilze und Bakterien haben ähnliche Prozessraten. Bisher wurde jedoch nicht ausgiebig erforscht, welchen Anteil die einzelnen mikrobiellen Gemeinschaften an der N2O Bildung tatsächlich haben. Zur Unterscheidung der N2O Bildungsprozesse in Bezug auf die beteiligten Mikroorganismen stellt die Isotopenanalyse von N2O eine vielversprechende Anwendung dar. Vor allem die 15N-Positionspräferenz im N2O (SP = site preference, d.h. die Differenz zwischen den δ15N-Werten der außenständigen und zentralen N-Atome im linearen N2O-Molekül) aus der Denitrifikation zeigte starke Unterschiede zwischen Reinkulturen einiger Bakterien (SP = -11 bis 0 ‰) und zwei untersuchten Pilzen (SP ~ 37 ‰). Jedoch wurden Bakterienreinkulturen bisher ausgiebiger untersucht als Pilzreinkulturen, auch wenn bekannt ist, dass sich die beteiligten Enzyme bei der Denitrifikation, bis auf die NO-Reduktase, zwischen Bakterien und Pilzen nicht unterscheiden. Die verschiedenen NO-Reduktasen sind vermutlich die Ursache für die unterschiedlichen SP-Werte des von Pilzen und Bakterien produzierten N2O. Des Weiteren wurde bei Bakterien ein Austausch der Sauerstoffatome von Zwischenprodukten der Denitrifikation und dem umgebenden Wasser gefunden, der zwischen 4 und 100% beträgt. Ob es einen solchen Sauerstoffaustausch auch bei Pilzen gibt, ist bisher jedoch unerforscht. Würde der Sauerstoffaustausch bei pilzlicher Denitrifikation nicht erfolgen, ermöglichte dies neben der unterschiedlichen SP eine weitere Unterscheidung der Herkunft des N2O. Der Sauerstoffaustausch würde signifikante Unterschiede in der O Isotopensignatur im N2O pilzlicher bzw. bakterieller Herkunft verursachen. In der vorliegenden Studie, die Aufschluss über die pilzliche N2O Produktion aus der Denitrifikation geben soll, wurden drei Hauptthemen behandelt. In einem Isotopen-Tracerexperiment mit 18O-angereichertem Wasser wurde untersucht, ob bei sechs Pilzreinkulturen ein Sauerstoffaustausch zwischen Wasser und Zwischenprodukten der Denitrifikation stattfindet. Die Pilzreinkulturen zeigten tatsächlich durch Inkorporation von 18O aus Wasser in N2O einen Sauerstoffaustausch. Auch Pilze können bis zu 100% des O während der Denitrifikation austauschen. Eine Unterscheidung zwischen der Denitrifikation durch Bakterien und Pilze anhand der Sauerstoffsignatur ist somit nicht möglich. Das zweite Thema sollte Auskunft darüber geben, ob hohe SP-Werte des N2O aus der Denitrifikation bei Pilzreinkulturen allgemeingültig sind. Neben den zwei bisher untersuchten wurden vier weitere Pilzreinkulturen inkubiert. Diese Studie zeigte für die getesteten Pilzarten ebenfalls höhere SP-Werte (SP = 19.7 bis 32.6 ‰) im Vergleich zum Wertebereich von Bakterienreinkulturen. Basierend auf den Ergebnissen zum Sauerstoffaustausch aus dem Isotopen-Tracerexperiment wurde für die jeweiligen sechs Pilze, anhand der im Rahmen dieses Versuchs ermittelten natürlichen Sauerstoffisotopensignaturen, Mechanismen zur O Isotopenfraktionierung untersucht. Dafür wurden, neben den Werten des Sauerstoffaustausches und der natürlichen O Isotopensignatur der Pilzreinkulturen, Werte für Fraktionierungseffekte aus der Literatur in einem Isotopenfraktionierungsmodell angewendet, um die Beteiligung der verschiedenen Enzyme, die während der Denitrifikation an dem Sauerstoffaustausch beteiligt sind, abzuschätzen. Im Vergleich zu den NO3-- und NO-Reduktasen wies die N2O--Reduktase einen maßgeblich höheren Sauerstoffaustausch auf. Die Erkenntnisse aus den Experimenten mit den Pilzereinkulturen sollten im Rahmen des dritten Themas auf Ihre Übertragbarkeit auf die mikrobiellen Gemeinschaften in Böden untersucht werden, indem Bodeninkubationsversuche mit selektiver Hemmung der Organismengruppen (Pilze und Bakterien) durchgeführt wurden. Bei dieser Modifizierung der Methode zur Substrat-induzierten Respiration mit selektiver Hemmung (SIRIN) sollte untersucht werden, ob sich die spezifischen SP-Werte für Bakterien und Pilze nach selektiver Wachstumshemmung von Bodengemeinschaften durch spezifische Antibiotika nachweisen lassen. Die Ausprägung des Hemmungseffekts auf SP-Werte in den drei getesteten Böden entsprach nicht den Erwartungswerten, die sich aus den SP-Werten der Pilz- und Bakterienreinkulturen ergaben. Die ermittelten SP-Werte lagen in den meisten Fällen im Bereich jener bakterieller Reinkulturen und eine Hemmung der Bakterien führte in keinem Fall zu der erwarteten Veränderungen der SP-Werte. Folglich konnten die SP-Werte dieser Versuche nicht dazu dienen, die N2O Bildung in den gehemmten Varianten den verschiedenen Organismengruppen zu zuordnen. Ungeklärt blieb, ob dies durch fehlende Eignung der modifizierten SIRIN-Methode zu erklären ist, oder ob die an Reinkulturen beobachteten SP-Unterschiede zwischen Pilzen und Bakterien nicht auf mikrobielle Gemeinschaften der Versuchsböden übertragbar sind. Im Hinblick auf nach wie vor bestehende methodische Defizite bei der Untersuchung der Pilzdenitrifikation im Boden sollte dies in weitergehenden Studien geklärt werden

Nitrite induced transcription of p450nor during denitrification by Fusarium oxysporum correlates with the production of N2O with a high 15N site preference

The greenhouse gas nitrous oxide (N2O) is produced in soil as a consequence of complex co-occurring processes conducted by diverse microbial species, including fungi. The fungal p450nor gene encodes a nitric oxide reductase associated with fungal denitrification. We thus hypothesized that p450nor gene expression is a marker for ongoing fungal denitrification. Specific PCR primers and quantitative PCR (qPCR) assays were developed targeting p450nor genes and transcripts. The novel PCR primers successfully amplified p450nor from pure cultures, and were used in an mRNA targeted qPCR to quantify p450nor gene transcription (i.e., gene expression) during denitrification activity in cultures of the fungal model denitrifier Fusarium oxysporum. Gene expression was induced by high (5 mM) and low (0.25 mM) nitrite concentrations. Nitrite stimulated N2O production rates by F. oxysporum, which correlated well with an up to 70-fold increase in p450nor gene expression during the first 12–24 h of anoxic incubation. The relative p450nor gene peak expression and peak N2O production rates declined 20- and 2-fold on average, respectively, towards the later phase of incubation (48–120 h). The 15N site preference of N2O (SP(N2O)) was high for F. oxysporum and independent of reaction progress, confirming the fungal origin of N2O produced. In conclusion, the developed fungal p450nor gene expression assay together with the analysis of SP(N2O) values provide a basis to improve current tools for the identification of fungal denitrification and/or N2O production in natural systems like soils

Anteil von Pilzen und Bakterien an der Lachgasbildung in verschiedenen Böden

Welchen Anteil Pilze an den N2O-Emissionen aus der Denitrifikation haben, ist bisher noch nicht hinreichend untersucht worden. Während der pilzlichen Denitrifikation findet meistens keine N2O-Reduktion statt, so dass N2O das Endprodukt darstellt. Somit könnte der pilzliche N2O-Anteil aus der Denitrifikation höher ausfallen, als bisher vermutet wird. Reinkulturversuche ergaben, dass das N2O von Bakterien und Pilzen eine unterschiedliche 15N-Positionspräferenz aufweist. Erste Ergebnisse aus Inkubationsversuchen mit Bodenproben und selektiver Hemmung konnten die deutlich positive 15N-Positionspräferenz des pilzlichen N2O aus den Reinkulturen nicht zeigen. Die Ergebnisse verdeutlichen, dass weitere Versuche notwendig sind, um ein besseres Verständnis über die N2O-Bildungsprozesse zu erlangen

Estuarine plastisphere as an overlooked source of N2O production

“Plastisphere”, microbial communities colonizing plastic debris, has sparked global concern for marine ecosystems. Microbiome inhabiting this novel human-made niche has been increasingly characterized; however, whether the plastisphere holds crucial roles in biogeochemical cycling remains largely unknown. Here we evaluate the potential of plastisphere in biotic and abiotic denitrification and nitrous oxide (N2O) production in estuaries. Biofilm formation provides anoxic conditions favoring denitrifiers. Comparing with surrounding bulk water, plastisphere exhibits a higher denitrifying activity and N2O production, suggesting an overlooked N2O source. Regardless of plastisphere and bulk water, bacterial and fungal denitrifications are the main regulators for N2O production instead of chemodenitrification. However, the contributions of bacteria and fungi in the plastisphere are different from those in bulk water, indicating a distinct N2O production pattern in the plastisphere. These findings pinpoint plastisphere as a N2O source, and provide insights into roles of the new biotope in biogeochemical cycling in the Anthropocene

Acetylene inhibition of N2O reduction in laboratory soil and groundwater denitrification assays: evaluation by 15N tracer and 15N site preference of N2O

Acetylene inhibition of N2O reduction in laboratory soil and groundwaterdenitrification assays: evaluation by 15N tracer and 15N site preference ofN2ODaniel Weymann (1), Reinhard Well (2), Dominika Lewicka-Szczebak (2,3), and Rohe Lena (2)(1) Forschungszentrum Juelich, Agrosphere Institute (IBG-3), Juelich, Germany ([email protected]), (2)Thünen-Institute of Climate-Smart Agriculture, Braunschweig, Germany, (3) University of Wroclaw, PolandThe measurement of denitrification in soils and aquifers is still challenging and often enough associated withconsiderable experimental effort and high costs. Against this background, the acetylene inhibition technique (AIT)applied in laboratory soil and groundwater denitrification assays is by far the most effective approach. However,this method has been largely criticized, as it is susceptible to underestimate denitrification rates and adds anadditional carbon source to the substrates to be investigated.Here we provide evidence that the AIT is not necessarily an inappropriate approach to measure denitrification,that its reliability depends on the drivers governing the process, and that the 15N site preference of N2O (SP)may serve as a tool to assess this reliability. Two laboratory batch experiments were conducted, where sandyaquifer material and a peat soil were incubated as slurries. We established (i) a standard anaerobic treatment byadding KNO3 (10 mg N L-1), (ii) an oxygen treatment by adding KNO3 and O2 (5 mg L-1), and (iii) a glucosetreatment by adding KNO3 supplemented with glucose (200 mg C L-1). Both experiments were run under 10 %(v/v) acetylene atmosphere and as 15N tracer treatments using labeled K15NO3 (60 atom % 15N).In the case of the standard anaerobic treatments, we found a very good agreement of denitrification potentialobtained by the AIT and 15N tracer methods. SP of N2O of the AIT samples from this treatment ranged between-4.8 and 2.6 h which is indicative for N2O production during bacterial denitrification but not for N2O reductionto N2. In contrast, we observed substantial underestimation of denitrification by AIT for the glucose treatmentscompared to the 15N method, i.e. denitrification was underestimated by 36 % (sandy aquifer material) and 47 %(peat soil). SP of N2O of the AIT samples from this treatment ranged between 4.5 and 9.6 h which suggestsoccurrence of bacterial N2O reduction. In the case of the oxygen treatments, we observed a very good agreementof denitrification potential obtained by the AIT and 15N tracer methods for the aquifer material, but a significantunderestimation of 20 % in the AIT samples of the peat soil. The 15N site preference of N2O again mirrored thisand ranged between -1.2 and -3.5 h(aquifer material) and 5.5 and 11.0 (peat soil), respectively.We conclude that the AIT can act as a reliable method in laboratory soil and groundwater bacterial denitrificationassays, but our results suggest that this relies on substrate types and incubation conditions. Additional measurementsof SP have potential to assess AIT efficacy and can help to reduce parallel time-consuming and expensive15N tracer experiments

Isotope fractionations factors of N2O production and reduction by denitrification: a. Laboratory incubation studies using N2O reductase inhibition

Isotopologue signatures of N2O such as 18O, average 15N (15Nbulk) and 15N site preference (SP = difference in 15N between the central and peripheral N positions of the asymmetric N2O molecule) can be used to constrain the atmospheric N2O budget and to characterize N2O turnover processes. However, the use of this approach to study N2O dynamics in soils requires knowledge of isotopologue fractionation factors (") for the various partial processes involved, e.g. N2O production by nitrification or denitrification, and N2O reduction by denitrification. Here we present results from laboratory incubations of soils and aquifer material to determine "gf N2O production ("prod) and N2O reduction to N2 ("red) during denitrification. "prod for 18O, 15Nbulk and SP was obtained by anaerobic incubation of NO 3 amended soils when N2O reduction was inhibited by 10 kPa acetylene. "red of the respective signatures was derived by comparing treatments with and without inhibition of N2O reduction. We investigated samples from 4 mineral soils, one organic soil and from a sandy aquifer. The mineral soils were incubated under unsaturated conditions in closed or open systems, the organic and aquifer samples as homogenized slurries in a closed system. Results of fractionation factors, process rates and incubation conditions will be presented and discussed in view of previous studies and theoretical considerations

Isotope fractionations factors of N2O production and reduction by denitrification derived from laboratory incubation studies and modeling

Quantifying denitrification in arable soils is crucial in predicting the microbial consumption of nitrogen fertilizers as well as N2O emissions. Stable isotopologue analyses of denitrification substrates (15NNO3, 18ONO3) and products (15NN2O, 18ON2O and SPN2O =Site Preference, i.e. difference in δ15N between the central and peripheral N positions of the asymmetric N2O molecule) can help to distinguish production pathways and to identify N2O reduction to N2. However, such interpretations are often ambiguous due to insufficient knowledge on isotopic fractionation mechanisms and wide differences in isotope fractionation factors determined by various studies for N2O production and reduction. Here we present results from laboratory incubations of soils and aquifer material to determine the net isotopic effect (η of N2O production (ηNO3-N2O) and N2O reduction to N2 (ηN2O-N2) during denitrification. ηNO3-N2O for 18O, 15Nbulk and SP was obtained by anaerobic incubation of NO3- amended soils when N2O reduction was inhibited by 10 kPa acetylene. ηN2O-N2 of the respective signatures was derived by comparing treatments with and without inhibition of N2O reduction. Furthermore, we present an original approach to determine ηprod and ηred by modeling. This determination is based on simultaneous modeling of both reaction steps (N2O production and reduction) and comparison of the results with experimental data from a laboratory incubation experiment carried out under N2-free atmosphere. For two analyzed arable soils (clay and sandy loam), the isotopic fractionation factors were very consistent. For N2O production mean net isotope effects of η15NNO3-N2O ~ -41‰, ηSPNO3-N2O ~ 2‰ and η18OH2O-N2O ~ +40‰ have been found. For N2O reduction mean net isotope effects of η15NN2O-N2 ~ +1‰, ηSPN2O-N2 ~ -7‰ and η18ON2O-N2 ~ -5‰ have been found

Weder ein „modern gender gap“ noch „same gender voting“ in Deutschland? Zum Einfluss des Geschlechts auf das individuelle Wahlverhalten bei den Bundestagswahlen zwischen 1998 und 2013

Der Beitrag geht der Frage nach, ob ein Einfluss des Geschlechts auf die Wahlabsicht bei Wahlen zum Deutschen Bundestag zwischen 1998 und 2013 vorliegt. Auf der Grundlage der Literatur zum „modern gender gap“ einerseits sowie zum „same gender voting“ anderseits werden Hypothesen dahingehend abgeleitet, dass Frauen einen geringeren Anreiz haben sollten, christdemokratische Parteien zu wählen, und dass – als gegenläufige Erwartung – mit der Kanzlerkandidatur Angela Merkels seit 2005 Frauen verstärkt CDU oder CSU wählen sollten. Es zeigt sich weder ein durchgängiger Effekt für ein interessegeleitetes Wählen von Frauen, das sich in einer signifikant niedrigeren Wahrscheinlichkeit der Wahl der Unionsparteien hätte äußern sollen, noch Evidenz dafür, dass Frauen ab 2005 aufgrund der Kanzlerkandidatur Angela Merkels verstärkt CDU und CSU unterstützt haben. Lediglich 2013 zeigt sich in Westdeutschland eine Tendenz für den letztgenannten Zusammenhang. Demnach spielt das Geschlecht eines Wählers für die Wahlabsicht bei Bundestagswahlen kaum eine ausschlaggebende Rolle