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Derivation of nearest-neighbor DNA parameters in magnesium from single-molecule experiments
DNA hybridization is an essential molecular reaction in biology with many applications. The nearest-neighbor (NN) model for nucleic acids predicts DNA thermodynamics using energy values for the different base pair motifs. These values have been derived from melting experiments in monovalent and divalent salt and applied to predict melting temperatures of oligos within a few degrees. However, an improved determination of the NN energy values and their salt dependencies in magnesium is still needed for current biotechnological applications seeking high selectivity in the hybridization of synthetic DNAs. We developed a methodology based on single molecule unzipping experiments to derive accurate NN energy values and initiation factors for DNA. A new set of values in magnesium is derived, which reproduces unzipping data and improves melting temperature predictions for all available oligo lengths, in a range of temperature and salt conditions where correlation effects between the magnesium bound ions are weak. The NN salt correction parameters are shown to correlate to the GC content of the NN motifs. Our study shows the power of single-molecule force spectroscopy assays to unravel novel features of nucleic acids such as sequence-dependent salt corrections
A Temperature-Jump Optical Trap for Single-Molecule Manipulation
[EN] To our knowledge, we have developed a novel temperature-jump optical tweezers setup that changes the temperature locally and rapidly. It uses a heating laser with a wavelength that is highly absorbed by water so it can cover a broad range of temperatures. This instrument can record several force-distance curves for one individual molecule at various temper- atures with good thermal and mechanical stability. Our design has features to reduce convection and baseline shifts, which have troubled previous heating-laser instruments. As proof of accuracy, we used the instrument to carry out DNA unzipping experi- ments in which we derived the average basepair free energy, entropy, and enthalpy of formation of the DNA duplex in a range of temperatures between 5 C and 50 C. We also used the instrument to characterize the temperature-dependent elasticity of single-stranded DNA (ssDNA), where we find a significant condensation plateau at low force and low temperature. Oddly, the persistence length of ssDNA measured at high force seems to increase with temperature, contrary to simple entropic models.The authors thank J. Camunas and S. Frutos for contributing the molecules used in the experiments, and J.M. Huguet for helpful discussion. F.R. is supported by grant Institucio Catalana de Recerca i Estudis Avancats Academia 2013 and J.R. A.-G. by an Explora grant from MINECO (MAT2013-49455-EXP). The research that led to the results presented here was funded by the European Union Seventh Framework Programme (FP7/2007-2013) under grant 308850 INFERNOS and European Research Council grant MagReps (No. 267862).De Lorenzo, S.; Ribezzi-Crivellari, M.; Arias-Gonzalez, JR.; Smith, S.; Ritort, F. (2015). A Temperature-Jump Optical Trap for Single-Molecule Manipulation. Biophysical Journal. 108(12):2854-2864. https://doi.org/10.1016/j.bpj.2015.05.017S285428641081
From free energy measurements to thermodynamic inference in nonequilibrium small systems
Fluctuation theorems (FTs), such as the Crooks or Jarzynski equalities (JEs), have become an important tool in single-molecule biophysics where they allow experimentalists to exploit thermal fluctuations and measure free-energy differences from non-equilibrium pulling experiments. The rich phenomenology of biomolecular systems has stimulated the development of extensions to the standard FTs, to encompass different experimental situations. Here we discuss an extension of the Crooks fluctuation relation that allows the thermodynamic characterization of kinetic molecular states. This extension can be connected to the generalized JE under feedback. Finally we address the recently introduced concept of thermodynamic inference or how FTs can be used to extract the total entropy production distribution in nonequilibrium systems from partial entropy production measurements. We discuss the significance of the concept of effective temperature in this context and show how thermodynamic inference provides a unifying comprehensive picture in several nonequilibrium problems
Force Spectroscopy with Dual-Trap Optical Tweezers: Molecular Stiffness Measurements and Coupled Fluctuations Analysis
ABSTRACT Dual-trap optical tweezers are often used in high-resolution measurements in single-molecule biophysics. Such measurements can be hindered by the presence of extraneous noise sources, the most prominent of which is the coupling of fluctuations along different spatial directions, which may affect any optical tweezers setup. In this article, we analyze, both from the theoretical and the experimental points of view, the most common source for these couplings in dual-trap optical-tweezers setups: the misalignment of traps and tether. We give criteria to distinguish different kinds of misalignment, to estimate their quantitative relevance and to include them in the data analysis. The experimental data is obtained in a, to our knowledge, novel dual-trap optical-tweezers setup that directly measures forces. In the case in which misalignment is negligible, we provide a method to measure the stiffness of traps and tether based on variance analysis. This method can be seen as a calibration technique valid beyond the linear trap region. Our analysis is then employed to measure the persistence length of dsDNA tethers of three different lengths spanning two orders of magnitude. The effective persistence length of such tethers is shown to decrease with the contour length, in accordance with previous studies
A dual-trap optical tweezer setup for single molecule manipulation : development and testing
Tradizionalmente, gli esperimenti di chimica e biologia hanno coinvolto quantità macroscopiche di
molecole (moli o grammi) della stessa specie. Questi esperimenti, che hanno contribuito a
sviluppare i fondamenti della termodinamica e della meccanica statistica, provano le proprietà di un
insieme di molecole, ed i risultati cosi' ottenuti rivelano i valori medi su tale insieme. A
complemento di questi esperimenti, negli ultimi due decenni si sono sviluppati sistemi sperimentali
per misurare le proprietà di un' unica molecola alla volta, ottenendo informazioni non mediate.
Questa nuova classe di esperimenti permette, per esempio, di misurare direttamente le fluttuazioni
conformazionali in un unico biopolimero o la distribuzione delle dimensioni dei passi di un motore
molecolare [1]. Si e' anche data la possibilità di studiare il comportamento di queste molecole in
condizioni di stress meccanico (Force Spectroscopy Tecniche, FST). Le pinze ottiche sono un
esempio di FST. In questo caso una molecola, come un biopolimero, è chimicamente fissato a due
sferule dielettriche di raggio micrometrico, che vengono poi manipolate per pressione di radiazione.
E' quindi possibile strudiare l'elasticita' non lineare dei biopolimeri, misurando la forza esercitata sul
polimero in funzione della distanza tra le due trappole (curva forza-distanza, FEC), con una
risoluzione al di sotto del pico Newton in forza e del nanometro in distanza.
Tra le diverse possibili configurazioni sperimentali per pinze ottiche, si distinguono le
configurazioni in cui entrambe le estremità della molecola vengono manipolate da due trappole
ottiche indipendenti e quelli in cui una delle due estremità è ancorato, come il sistema già in uso
nello Small Biosystems Lab presso l'Università di Barcellona [2].
Molti dei più recenti risultati nel campo della biofisica singola molecola sono stati possibili grazie a
sistemi sperimentali che funzionano con due trappole ottici indipendenti [3,4,5]. Questi sistemi
hanno due caratteristiche salienti: da un lato questi strumenti permettono la manipolazione di una
singola molecola usando solo fasci di luce, garantendo un migliore isolamento dal rumore
ambientale, d'altro canto, questi strumenti possono misurare due segnali, uno per ogni trappola, e
dare l'accesso ai cross-correlazione tra le forze in due punti del sistema sperimentale, una quantità
che può fornire informazioni fisicamente rilevanti, non ottenibili con una trappola unica.
Il nuovo set-up è stato sviluppato a partire da un setup sperimentale gia' in uso nel laboratorio.
Cambiando il materiale delle sferule utilizzate per l'accoppiamento dei fasci di luce alla molecola
con uno a piu' basso indice di rifrazione, abbiamo dimostrato la possibilità di utilizzare la stessa
ottica per formare una singola trappola con due fasci contropropaganti o due trappole indipendenti.
Lo sviluppo del sistema a due trappole ha richiesto anche la definizione di un nuovo protocollo di
calibrazione e nuovi metodi di analisi dei dati basati sulla meccanica statistica, con particolare
attenzione allo studio delle correlazioni incrociate.
Per verificare il corretto funzionamento delle due trappole sono stati ripetuti alcuni degli
esperimenti riportati in letteratura. Questi esperimenti sono descritti in dettaglio nel terzo capitolo
della tesi. In primo luogo abbiamo riprodotto i risultati di H.C. Meiners S. Quake [3], misurando le
correlazioni idrodinamiche tra due sfere intrappolate in trappole ottiche. Le correlazioni
idrodinamiche si manifestano attraverso un minimo nella funzione di cross-correlazione tra le
fluttuazioni di forza misurate nelle trappole. Un secondo esperimento consiste nella misurara della
rigidità di molecole di DNA .I n un sistema con due trappole, la rigidita' puo' essere misurata
direttamente dalle fluttuazioni. In questo caso si è verificato che il sistema descritto in questa tesi
puo' esplorare una regime di forze (1-20 pN) piu' ampio di quelli riportati nella letteratura relativa a
questo problema [6.7] (fino a 10 PN).
In un terzo esperimento e' stata misurata la termodinamica e la cinetica di ripiegamento di un
hairpin di DNA. Un hairpin di DNA e' una struttura secondaria formate da sequenze palindromiche
di DNA a singolo filamento [4]. Queste strutture sono un sistema modello che è stato ampiamente
studiato negli ultimi anni per capire la termodinamica degli acidi nucleici, o per capire la
fenomenologia di piegatura (folding) di biopolimeri. In questo caso gli esperimenti sono stati fatti
utilizzando le due diverse configurazioni sperimentali, con uno o due trappole, per verificare che la
termodinamica del processo di folding non è influenzata dalle interazioni tra l'hairpin e la materia
costitutiva delle microsfere di silica. Inoltre, questo esperimento ha richiesto lo sviluppo di tecniche
per ottimizzare il rapporto segnale-rumore, basate sull'uso della cross-correlazione tra i segnali
emessi dai due trappole.
Lo sviluppo del sistema di due trappole indipendenti è un primo passo nel quadro di un più ampio
programma scientifico di ricerca sull' ugualianza di Jarzynski (JE). La JE e altre relazioni per
sistemi non in equilibrio sono state studiate con le pinze ottiche negli ultimi anni [8]. La maggior
parte di questi studi sono stati eseguiti su sistemi con una trappola unica. Il sistema di due trappole
esplorerà nuove proprietà della JE, per esempio la non invarianza Galileiana, come spiegato nel
quarto capitolo della tesi. Mentre gli esperimenti di non-equilibrio saranno effettuati dopo la
conclusione della tesi, i fenomeni oggetto di studio sono modellate in dettaglio nei casi più
semplici