Avaliacao de quatro metodos diferentes de extracao de DNA em isolados clinicos de estafilococos coagulase negativos (SCoN)

Currently there are several methods to extract bacterial DNA based on different principles. However, the amount and the quality of the DNA obtained by each one of those methods is highly variable and microorganism dependent, as illustrated by coagulase-negative staphylococci (CoNS) which have a thick cell wall that is difficult to lyse. This study was designed to compare the quality and the amount of CoNS DNA, extracted by four different techniques: two in-house protocols and two commercial kits. DNA amount and quality determination was performed through spectrophotometry. The extracted DNA was also analyzed using agarose gel electrophoresis and by PCR. 267 isolates of CoNS were used in this study. The column method and thermal lyses showed better results with regard to DNA quality (mean ratio of A260/280 = 1.95) and average concentration of DNA (), respectively. All four methods tested provided appropriate DNA for PCR amplification, but with different yields. DNA quality is important since it allows the application of a large number of molecular biology techniques, and also it's storage for a longer period of time. In this sense the extraction method based on an extraction column presented the best results for CoNS.Atualmente, para extrair o DNA bacteriano, existem diversos métodos baseados em diferentes princípios. Entretanto, a quantidade e qualidade do DNA obtido por cada um destes métodos é variável e depende do tipo de micro-organismo em questão; os estafilococos coagulase-negativos (CoNS), por exemplo, possuem parede celular espessa difícil de lisar. O objetivo deste estudo foi comparar a quantidade e a qualidade do DNA extraído de isolados clínicos de CoNS utilizando quatro metodologias diferentes: dois protocolos caseiros e dois kits comerciais. A determinação da quantidade e da qualidade do DNA foi realizada por espectrofotometria. O DNA extraído também foi analisado em eletroforese em gel de agarose e por PCR. A concentração média de DNA foi mais alta no método de lise térmica (). Entretanto, com relação à qualidade do DNA, o kit comercial que utiliza um método de extração baseado em uma coluna de separação apresentou melhor resultado (média da relação A260/280 = 1,95). As quatro técnicas testadas forneceram DNA passível de amplificação por PCR, porém com diferentes rendimentos. A qualidade do DNA extraído de bactérias é importante, pois possibilita a realização de maior número de técnicas de biologia molecular e também armazenamento do material por maior período de tempo. Neste sentido, a técnica de extração por coluna de separação apresentou melhor desempenho frente aos CoNS

Avaliacao de quatro metodos diferentes de extracao de DNA em isolados clinicos de estafilococos coagulase negativos (SCoN)

Currently there are several methods to extract bacterial DNA based on different principles. However, the amount and the quality of the DNA obtained by each one of those methods is highly variable and microorganism dependent, as illustrated by coagulase-negative staphylococci (CoNS) which have a thick cell wall that is difficult to lyse. This study was designed to compare the quality and the amount of CoNS DNA, extracted by four different techniques: two in-house protocols and two commercial kits. DNA amount and quality determination was performed through spectrophotometry. The extracted DNA was also analyzed using agarose gel electrophoresis and by PCR. 267 isolates of CoNS were used in this study. The column method and thermal lyses showed better results with regard to DNA quality (mean ratio of A260/280 = 1.95) and average concentration of DNA (), respectively. All four methods tested provided appropriate DNA for PCR amplification, but with different yields. DNA quality is important since it allows the application of a large number of molecular biology techniques, and also it's storage for a longer period of time. In this sense the extraction method based on an extraction column presented the best results for CoNS.Atualmente, para extrair o DNA bacteriano, existem diversos métodos baseados em diferentes princípios. Entretanto, a quantidade e qualidade do DNA obtido por cada um destes métodos é variável e depende do tipo de micro-organismo em questão; os estafilococos coagulase-negativos (CoNS), por exemplo, possuem parede celular espessa difícil de lisar. O objetivo deste estudo foi comparar a quantidade e a qualidade do DNA extraído de isolados clínicos de CoNS utilizando quatro metodologias diferentes: dois protocolos caseiros e dois kits comerciais. A determinação da quantidade e da qualidade do DNA foi realizada por espectrofotometria. O DNA extraído também foi analisado em eletroforese em gel de agarose e por PCR. A concentração média de DNA foi mais alta no método de lise térmica (). Entretanto, com relação à qualidade do DNA, o kit comercial que utiliza um método de extração baseado em uma coluna de separação apresentou melhor resultado (média da relação A260/280 = 1,95). As quatro técnicas testadas forneceram DNA passível de amplificação por PCR, porém com diferentes rendimentos. A qualidade do DNA extraído de bactérias é importante, pois possibilita a realização de maior número de técnicas de biologia molecular e também armazenamento do material por maior período de tempo. Neste sentido, a técnica de extração por coluna de separação apresentou melhor desempenho frente aos CoNS

Molecular characteristics of vancomycin-susceptible Staphylococcus aureus could help to predict treatment failure due to reduced vancomycin susceptibility

Background and Objectives: Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) is one of the most frequent causes of healthcare-associated and community-acquired infections and with its advancement, vancomycin became the main therapeutic option. However, its indiscriminate 2 use favored the emergence of MRSA with reduced susceptibility to vancomycin, commonly associated with vancomycin treatment failure, persistent bacteremia, prolonged hospitalization and adverse clinical outcome. This study evaluated the occurrence of MRSA with reduced vancomycin susceptibility and determined some molecular characteristics in comparison with vancomycin-susceptible MRSA (VS-MRSA). Methods: Determination of antimicrobial susceptibility profile, the minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) for vancomycin, vancomycin-tolerance, SCCmec and agr typing were performed in a total of 177 MRSA. Thereafter, they were screened for hVISA by BHIA-3V and BHIA-6V and confirmed with population analysis profile - area under the curve method (PAPAUC). Results: VT-MRSA and hVISA phenotypes were found in 13.6% and 5.1% of clinical isolates of MRSA, respectively, and the presence of hVISA was statistically significant among VT-MRSA isolates (

Características moleculares de Staphylococcus aureus suscetível à vancomicina poderia ajudar a prever falhas no tratamento devido à reduzida suscetibilidade à vancomicina

Background and Objectives: Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) is one of the most frequent causes of healthcare-associated and community-acquired infections and with its advancement, vancomycin became the main therapeutic option. However, its indiscriminate 2 use favored the emergence of MRSA with reduced susceptibility to vancomycin, commonly associated with vancomycin treatment failure, persistent bacteremia, prolonged hospitalization and adverse clinical outcome. This study evaluated the occurrence of MRSA with reduced vancomycin susceptibility and determined some molecular characteristics in comparison with vancomycin-susceptible MRSA (VS-MRSA). Methods: Determination of antimicrobial susceptibility profile, the minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) for vancomycin, vancomycin-tolerance, SCCmec and agr typing were performed in a total of 177 MRSA. Thereafter, they were screened for hVISA by BHIA-3V and BHIA-6V and confirmed with population analysis profile - area under the curve method (PAPAUC). Results: VT-MRSA and hVISA phenotypes were found in 13.6% and 5.1% of clinical isolates of MRSA, respectively, and the presence of hVISA was statistically significant among VT-MRSA isolates (pJustificación y objetivos: Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (MRSA) es una de las causas más frecuentes de infecciones relacionadas con la asistencia sanitaria y comunitarias, y con su avance, a la vancomicina se ha convertido en la principal opción terapéutica. Sin embargo, su uso indiscriminado favoreció el surgimiento de MRSA con reducida susceptibilidad a la vancomicina, comúnmente asociados con fallas en el tratamiento, bacteriemia persistente, hospitalización prolongada y resultados clínicos adversos. Este estudio evaluó la ocurrencia de MRSA con reducida susceptibilidad a la vancomicina y determinó algunas características moleculares en comparación con MRSA susceptible a la vancomicina (VS-MRSA). Métodos: Determinación del perfil de susceptibilidad a los antimicrobianos, la concentración inhibitoria mínima (CIM) y la concentración bactericida mínima (CBM) para vancomicina, tolerancia a la vancomicina, tipificación del SCCmec y agr se realizaron en un total de 177 MRSA. Resultados: Los fenotipos VT-MRSA y hVISA se encontraron en el 13,6% y el 5,1% de los aislados clínicos de MRSA, respectivamente, y la presencia de hVISA fue estadísticamente significativa entre los aislados de VT-MRSA (pJustificativa e Objetivos: Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA) é uma das causas mais frequentes de infecções relacionadas à assistência à saúde e comunitárias, e com seu avanço, a vancomicina tornou-se a principal opção terapêutica. Entretanto, o seu uso indiscriminado favoreceu o surgimento de MRSA com reduzida suscetibilidade à vancomicina, comumente associados com falhas no tratamento, bacteremia persistente, hospitalização prolongada e desfechos clínicos adversos. Este estudo avaliou a ocorrência de MRSA com reduzida suscetibilidade à vancomicina e determinou algumas características moleculares em comparação com MRSA suscetível à vancomicina (VS-MRSA). Métodos: Determinação do perfil de suscetibilidade aos antimicrobianos, a concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida mínima (CBM) para vancomicina, tolerância à vancomicina, tipagem do SCCmec e agr foram realizadas em um total de 177 MRSA. Posteriormente, foram triados para hVISA por BHIA-3V e BHIA-6V e confirmados com a Análise do Perfil Populacional - Área Abaixo da Curva (PAP-AUC). Resultados: Os fenótipos VT-MRSA e hVISA foram encontrados em 13,6% e 5,1% dos isolados clínicos de MRSA, respectivamente, e a presença de hVISA foi estatisticamente significativa entre os isolados de VT-MRSA (

Apoptose de neutrófilos na Sepse e na Síndrome da Angústia Respiratória Aguda secundária à Sepse

16

Distribuição dos SCCmec tipos I, II, III e IV em Staphylococcus aureus meticilina-resistente isolados de pacientes do Hospital de Clínicas de Porto Alegre

Staphylococcus aureus resistente a meticilina (methicillin-resistant Staphylococcus aureus - MRSA) é um patógeno frequentemente hospitalar encontrado em diversos locais do mundo, e vem sendo encarado como uma nova ameaça que parte da comunidade. O fenótipo clássico do MRSA é devido à produção de uma proteína ligante de penicilina modificada (PBP-2a), codificada pelo gene mecA. Esse gene, por sua vez, é carreado em um elemento genético móvel chamado staphylococcal cassette chromosome (SCCmec). Além da resistência aos antibióticos β-lactâmicos, esse elemento contém outros determinantes de resistência que contribuem para caracterizar diferentes tipos de SCCmec. Outras características para a classificação do elemento SCCmec em seus diferentes tipos são seus dois complexos essenciais, mec e ccr, o que resulta na identificação de sete SCCmec distintos: I a VII, cada tipo com suas peculiaridades. Recentemente um novo tipo está sendo proposto (tipo VIII), que surgiu a partir de recombinação homóloga e ainda está em estudo. Por mais de 40 anos após o início do seu reconhecimento, infecções por MRSA foram confinadas a pacientes que tiveram extensivo contato com o sistema hospitalar de saúde. Entretanto, a epidemiologia do S. aureus está mudando e infecções em pacientes que tiveram pouco ou nenhum contato com o sistema hospitalar de saúde nos últimos anos já foram intensamente descritas. Recentemente, estes organismos emergiram como a maior causa de infecções adquiridas da comunidade, gerando a classificação atualmente aceita para MRSA: MRSA adquirido no hospital (healthcare-acquired MRSA - HA-MRSA) e adquirido na comunidade (communityacquired MRSA - CA-MRSA). Além de diferenças circunstanciais, grandes diferenças genotípicas existem entre esses dois grupos de MRSA, o que tem determinado grande número de estudos relacionados com a epidemiologia de MRSA através da tipagem do SCCmec. Neste estudo, foi determinada a prevalência do gene mecA bem como a distribuição dos tipos de SCCmec mais comuns e extensivamente estudados (I, II, III e IV) em um total de 365 HAMRSA, durante 2007-2008. Os resultados foram interpretados em conjunto com o perfil de susceptibilidade a diversos antibióticos. O gene mecA foi encontrado em 148 (40,5%) isolados e 68,5% destes pertenciam ao SCCmec tipo III, 21,2% ao tipo I e 1,4% aos tipos I e III simultaneamente. Não foram encontrados SCCmec tipos II e IV neste estudo e em 8,9% dos isolados de MRSA a tipagem não foi possível (SCCmec atípico). Os isolados com SCCmec tipo III foram mais resistentes aos antibióticos não-β-lactâmicos quando comparado ao SCCmec tipo I, e esta diferença foi estatisticamente significativa para três antimicrobianos: sulfametoxazoltrimetoprim (p<0,001), doxiciclina (p<0,001) e rifampicina (p<0,001). Enfim, este estudo demonstrou que o tipo III, que é um cassete de multiresistência, é o tipo de SCCmec mais prevalente entre pacientes hospitalizados neste hospital e que é possível determinar a resistência esperada aos antimicrobianos de acordo com o tipo de SCCmec encontrado. O fato de que o tipo IV não foi encontrado no nosso estudo pode indicar a ausência de CA-MRSA em pacientes hospitalizados no nosso hospital

Distribuição dos SCCmec tipos I, II, III e IV em Staphylococcus aureus meticilina-resistente isolados de pacientes do Hospital de Clínicas de Porto Alegre

Staphylococcus aureus resistente a meticilina (methicillin-resistant Staphylococcus aureus - MRSA) é um patógeno frequentemente hospitalar encontrado em diversos locais do mundo, e vem sendo encarado como uma nova ameaça que parte da comunidade. O fenótipo clássico do MRSA é devido à produção de uma proteína ligante de penicilina modificada (PBP-2a), codificada pelo gene mecA. Esse gene, por sua vez, é carreado em um elemento genético móvel chamado staphylococcal cassette chromosome (SCCmec). Além da resistência aos antibióticos β-lactâmicos, esse elemento contém outros determinantes de resistência que contribuem para caracterizar diferentes tipos de SCCmec. Outras características para a classificação do elemento SCCmec em seus diferentes tipos são seus dois complexos essenciais, mec e ccr, o que resulta na identificação de sete SCCmec distintos: I a VII, cada tipo com suas peculiaridades. Recentemente um novo tipo está sendo proposto (tipo VIII), que surgiu a partir de recombinação homóloga e ainda está em estudo. Por mais de 40 anos após o início do seu reconhecimento, infecções por MRSA foram confinadas a pacientes que tiveram extensivo contato com o sistema hospitalar de saúde. Entretanto, a epidemiologia do S. aureus está mudando e infecções em pacientes que tiveram pouco ou nenhum contato com o sistema hospitalar de saúde nos últimos anos já foram intensamente descritas. Recentemente, estes organismos emergiram como a maior causa de infecções adquiridas da comunidade, gerando a classificação atualmente aceita para MRSA: MRSA adquirido no hospital (healthcare-acquired MRSA - HA-MRSA) e adquirido na comunidade (communityacquired MRSA - CA-MRSA). Além de diferenças circunstanciais, grandes diferenças genotípicas existem entre esses dois grupos de MRSA, o que tem determinado grande número de estudos relacionados com a epidemiologia de MRSA através da tipagem do SCCmec. Neste estudo, foi determinada a prevalência do gene mecA bem como a distribuição dos tipos de SCCmec mais comuns e extensivamente estudados (I, II, III e IV) em um total de 365 HAMRSA, durante 2007-2008. Os resultados foram interpretados em conjunto com o perfil de susceptibilidade a diversos antibióticos. O gene mecA foi encontrado em 148 (40,5%) isolados e 68,5% destes pertenciam ao SCCmec tipo III, 21,2% ao tipo I e 1,4% aos tipos I e III simultaneamente. Não foram encontrados SCCmec tipos II e IV neste estudo e em 8,9% dos isolados de MRSA a tipagem não foi possível (SCCmec atípico). Os isolados com SCCmec tipo III foram mais resistentes aos antibióticos não-β-lactâmicos quando comparado ao SCCmec tipo I, e esta diferença foi estatisticamente significativa para três antimicrobianos: sulfametoxazoltrimetoprim (p<0,001), doxiciclina (p<0,001) e rifampicina (p<0,001). Enfim, este estudo demonstrou que o tipo III, que é um cassete de multiresistência, é o tipo de SCCmec mais prevalente entre pacientes hospitalizados neste hospital e que é possível determinar a resistência esperada aos antimicrobianos de acordo com o tipo de SCCmec encontrado. O fato de que o tipo IV não foi encontrado no nosso estudo pode indicar a ausência de CA-MRSA em pacientes hospitalizados no nosso hospital