Evaluation of clinical and environmental of Aspergillus spp. isolates : morphological and molecular identification; susceptibility profile and search for azoles resistance related mutations

Orientador: Angélica Zaninelli SchreiberTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências MédicasResumo: Membros do gênero Aspergillus são patógenos fúngicos oportunistas responsáveis por altas taxas de mortalidade, principalmente em pacientes imunocomprometidos, que se infectam após inalação dos conídios presentes no ar. O derivado azólico voriconazol (VRZ) é a primeira linha na terapia e o surgimento de isolados de A. fumigatus resistentes a este e outros azólicos está sendo investigado em diversos países. Isolados resistentes apresentam mutações no gene cyp51A, que codifica a 14?-demetilase, enzima alvo para estes compostos. No Hospital de Clínicas da Unicamp (HC-Unicamp) muitos pacientes de alto risco estão suscetíveis a agentes infecciosos oportunistas como os do gênero Aspergillus. Estudos recentes demonstraram que os pacientes podem estar colonizados ou infectados com mais de um genótipo de A. fumigatus e ainda que esses podem apresentar diferentes perfis frente aos antifúngicos. Análise de microssatélites (STRAF) é útil para estudar a epidemiologia molecular de A. fumigatus devido ao seu alto poder discriminatório. Desta forma, o acompanhamento do possível surgimento de isolados resistentes e a análise dos isolados sequenciais de um mesmo paciente quanto a sua genotipagem se tornam importantes. Neste contexto, o presente trabalho buscou estudar a ocorrência das espécies e o perfil de suscetibilidade de Aspergillus ambientais e clínicos frente aos antifúngicos, além de analisar a presença de mutações no gene cyp51A dos isolados de A. fumigatus resistentes aos azólicos seguida da genotipagem de A. fumigaus clínicos e ambientais. Duzentos e vinte e nove isolados clínicos e 123 isolados ambientais foram estudados. Para a identificação de espécies foi realizado sequenciamento de DNA das regiões ITS e ?-tubulina. O perfil de suscetibilidade aos antifúngicos foi avaliado de acordo com o documento M38-A2 do Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2008) para determinação da concentração efetiva mínima (CEM) para as equinocandinas e concentração inibitória mínima (CIM) para os demais. Os antifúngicos avaliados foram anfotericina B (AMB) itraconazol (ITZ), voriconazol (VRZ), posaconazol (PSZ), micafungina (MCF) e caspofungina (CPF). Isolados clínicos resistentes aos azólicos e os isolados ambientais de A. fumigatus foram submetidos ao sequenciamento do gene cyp51A. A tipagem de A. fumigatus por microssatélites foi realizada por sequenciamento dos pares de oligonucleotídeos iniciadores: 2AB, 3AB, 4AB, BDA, BDB, BDC e BDD e analisada com auxílio do programa e-Burst v.3. Dez isolados de A. fumigatus apresentaram valores elevados de CIM para pelo menos um azólico, mas mutações no gene cyp51A relacionadas com resistência não foram observadas. A observação mais preocupante foi que valores de CIM de AMB foram elevados (?2 mg L-1) em 87% dos pacientes com isolados de A. flavus e 43% com isolados de A. fumigatus. Não foi observada resistência às equinocandinas. Quanto a genotipagem, os isolados de A. fumigatus apresentaram elevada diversidade. Seis isolados de 3 pacientes foram englobados como parte de um complexo clonal. Estes 6 isolados possuem as já conhecidas mutações de ponto F46Y, M127V, N248T, D225E e E427K no gene cyp51A. Fazer parte desse complexo clonal significa que os isolados têm a mesma origem clonal, mas com 1 a 3 ST de diferença. Os resultados confirmam estudos anteriores que mostraram o alto polimorfismo das populações de A. fumigatus. A heterogeneidade dos genótipos confirma que um paciente pode estar contaminado ou infectado com diferentes isolados e diferentes pacientes podem ser infectados com genótipos diferentes ou, por outro lado, com genótipos muito próximos sugerindo, neste caso, a possibilidade de infecção durante internação hospitalar. Dado que a AMB é usada para tratar infecções resistentes aos azólicos, os dados obtidos no presente trabalho quanto a este antifúngico destacam a necessidade de vigilância contínua em Aspergillus para toda a resistência antifúngica a fim de permitir a implementação de estratégias de tratamento corretas para o manejo desses patógenos. Nenhuma mutação no gene cyp51A que tenha sido relacionada com resistência foi observada, nem mesmo em isolados resistentes aos azólicos, indicando que outros mecanismos podem estar envolvidos. Estudos adicionais serão necessários para um maior entendimento da epidemiologia e a heterogeneidade desses patógenos, além dos mecanismos envolvidos na resistência não apenas aos antifúngicos azólicos mas também frente a AMB e às equinocandinasAbstract: Members of the Aspergillus genus are opportunistic fungal pathogens responsible for high mortality rates, especially in immunocompromised patients, who become infected after inhalation of conidia present in the air. The azole voriconazole (VRZ) is the first line in therapy and the emergence of resistant A. fumigatus isolates to this and other azole is being investigated in several countries. Resistant isolates have mutations in the cyp51A gene, which encodes 14?-demethylase, the target enzyme for these compounds. In the Hospital de Clínicas of Campinas University (HC-Unicamp) many high-risk patients are susceptible to opportunistic infectious agents like those of the genus Aspergillus. Recent studies have shown that patients may be colonized or infected with more than one A. fumigatus genotype and that they may present different susceptibility profiles. Microsatellite analysis (STRAF) is useful for studying the molecular epidemiology of A. fumigatus due to its high discriminatory power. In this way, monitoring the possible emergence of resistant isolates and analyzing the sequential isolates from the same patient regarding their genotyping become important. In this context, the present work aimed to study the occurrence of the species and the antifungal susceptibility profile of environmental and clinical Aspergillus, as well as to analyze the presence of cyp51A gene mutations in A. fumigatus azoles resistant isolates, followed by genotyping clinical and environmental A. fumigatus. Two hundred twenty-nine clinical isolates and 123 environmental isolates were studied. For the identification of species, DNA sequencing of the ITS and ?-tubulin regions was performed. The antifungal susceptibility profile was evaluated according to the M38-A2 of the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2008) to determine the minimum effective concentration (MEC) for the echinocandins and minimum inhibitory concentration (MIC) for the others. The antifungal agents evaluated were amphotericin B (AMB) itraconazole (ITZ), voriconazole (VRZ), posaconazole (PSZ), micafungin (MCF) and caspofungin (CPF). Clinical azoles resistant A. fumigatus and environmental A. fumigatus were submitted to the cyp51A gene sequencing. A. fumigatus isolates were submitted to microsatelites typing (STRAfs 2AB, 3AB, 4AB, BDA, BDB, BDC and BDD) to assess if the serially isolates were genetically related and then they were analyzed with e-Burst v.3. Ten isolates of A. fumigatus showed high MIC values for at least one azole, but mutations in the cyp51A gene related resistance were not observed. The most disturbing observation was that the MIC values of AMB were high (?2 mg L-1) in 87% of the patients with A. flavus isolates and 43% with A. fumigatus isolates. No resistance to echinocandins was observed. Regarding to genotyping, A. fumigatus showed high diversity. Six isolates of three patients were part of a clonal complex. These 6 isolates have the already known point mutations F46Y, M127V, N248T, D225E and E427K in the cyp51A gene. Being part of this clonal complex means that the isolates have the same clonal origin, but with 1 to 3 STs of difference. Our results confirm previous studies showing the high polymorphism of A. fumigatus populations. The heterogeneity of the genotypes confirms that a patient may be colonized or infected with different isolates and different patients may be infected with different or, on the other hand, infected with very close genotypes suggesting, in this case, the possibility of infection during hospitalization. Since AMB is used to treat azole-resistant infections, the data obtained in the present study highlight the need for continuous resistance surveillance in Aspergillus for all important antifungal to implement correct treatment strategies for the management of these pathogens. No related to resistance mutation in cyp51A gene was observed, not even in those azole-resistant isolates, suggesting that other mechanisms may be involved. Further studies will be necessary to better understand the epidemiology and heterogeneity of these pathogens, as well as the resistance mechanisms involved not only to azole antifungals but to AMB and echinocandinsDoutoradoCiencias BiomedicasDoutora em Ciências Médicas870369/1997-088881.134235/2016-01CNPQCAPE

Apoptosis deregulation expression in Philadelphia-negative Myeloproliferative Neoplasms in a Portuguese population

Poster presented at the 7th International Conference on Myeloproliferative Neoplasms / European School of Haematology. 27-29 October 2016. Estoril, PortugalObjectives: evaluate the role of apoptosis SNPs (single nucleotide polymorphisms) in PN-­‐MPNs (Philadelphia-­chromosome negative chronic myeloproliferative neoplasmssusceptibility).N/

DNA repair genes polymorphisms and genetic susceptibility to Philadelphia-negative myeloproliferative neoplasms in a Portuguese population: the role of base excision repair genes polymorphisms

Sob uma licença CC-BY-NC-ND - http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/The role of base excision repair (BER) genes in Philadelphia-negative (PN)-myeloproliferative neoplasms (MPNs) susceptibility was evaluated by genotyping eight polymorphisms [apurinic/apyrimidinic endodeoxyribonuclease 1, mutY DNA glycosylase, earlier mutY homolog (E. coli) (MUTYH), 8‑oxoguanine DNA glycosylase 1, poly (ADP‑ribose) polymerase (PARP) 1, PARP4 and X‑ray repair cross‑complementing 1 (XRCC1)] in a case‑control study involving 133 Caucasian Portuguese patients. The results did not reveal a correlation between individual BER polymorphisms and PN‑MPNs when considered as a whole. However, stratification for essential thrombocythaemia revealed i) borderline effect/tendency to increased risk when carrying at least one variant allele for XRCC1_399 single‑nucleotide polymorphism (SNP); ii) decreased risk for Janus kinase 2‑positive patients carrying at least one variant allele for XRCC1_399 SNP; and iii) decreased risk in females carrying at least one variant allele for MUTYH SNP. Combination of alleles demonstrated an increased risk to PN‑MPNs for one specific haplogroup. These findings may provide evidence for gene variants in susceptibility to MPNs. Indeed, common variants in DNA repair genes may hamper the capacity to repair DNA, thus increasing cancer susceptibility.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

The role of apoptosis polymorphisms in individual susceptibility to Philadelphia-negative myeloproliferative neoplasms

Poster presented at the 18th Annual Reunion of Sociedade Portuguesa de Genética Humana. Lisboa, 2014

The role of base excision repair polymorphisms in individual susceptibility to Philadelphia-negative myeloproliferative neoplasms

Poster presented at the 6th International Conference on Myeloproliferative Neoplasms. European School of Haematology, Estoril, 2014

Applications residual control charts based on variable limits

The main purpose of this paper is to verify the stability of a productive process in the presence of the effects of autocorrelation and volatility, in order to capture these characteristics by a joint forecast model which produces residuals that are evaluated by a control chart based on variable control limits. The methodology employed will be the joint estimation of the residuals by ARIMA – ARCH models and the conditional standard deviation from residuals to establish the chart control limits. The joint AR (1)-ARCH (1) model shows that an appropriate forecasting model brings a great contribution to the performance of residual control charts in monitoring the stability of industrial variables using just one chart to monitor mean and variance togetherinfo:eu-repo/semantics/publishedVersio

Applications Residual Control Charts Based on Variable Limits

The main purpose of this paper is to verify the stability of a productive process in the presence of the effects of autocorrelation and volatility, in order to capture these characteristics by a joint forecast model which produces residuals that are evaluated by a control chart based on variable control limits. The methodology employed will be the joint estimation of the residuals by ARIMA – ARCH models and the conditional standard deviation from residuals to establish the chart control limits. The joint AR (1)-ARCH (1) model shows that an appropriate forecasting model brings a great contribution to the performance of residual control charts in monitoring the stability of industrial variables using just one chart to monitor mean and variance together.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Identification of genetic determinants associated with susceptibility and therapeutic efficacy in Philadelphia-negative Myeloproliferative Neoplasms

Poster presented at the Scientific Toxomics Meeting, 28 September 2015, Lisbon, Portugal

Resumo: Força de reação do solo vertical do exercício de hidroginástica chute frontal realizado por mulheres: efeitos da idade

Antecedentes: Aumentar el conocimiento sobre las fuerzas que actúan en diferentes ejercicios acuáticos en mujeres de diferentes edades es importante para una prescripción más eficaz e individualizada. Objetivos: comparar la fuerza de reacción del suelo durante el ejercicio aeróbic acuático de patada frontal realizado a diferentes cadencias entre mujeres jóvenes y posmenopáusicas. Método: la muestra estuvo compuesta por 24 mujeres, 12 mujeres jóvenes (23,7 ± 3,6 años) y 12 mujeres posmenopáusicas (57,3 ± 2,6 años). Para determinar la fuerza de reacción vertical del suelo de pico y el impulso, las voluntarias realizaron el ejercicio de patada frontal a diferentes cadencias (80, 100 y 120 b.min-1). Para el análisis de datos, se utilizó una ANOVA de dos vías (α = 0,05). Resultados: se observó un aumento en la fuerza de reacción del suelo de pico de la cadencia de 80 b.min-1 para las cadencias más altas (p < 0,001). Las mujeres jóvenes tenían valores de fuerza de reacción del suelo de pico más altos en comparación con las mujeres posmenopáusicas (p = 0,012), lo que demuestro que las mujeres posmenopáusicas tenían valores de fuerza de reacción del suelo de pico de 78-82% en comparación con las mujeres jóvenes. Además, se observó una reducción del impulso a cadencias más altas (p < 0,001), con valores similares entre grupos (p = 0,835). Conclusiones: las mujeres posmenopáusicas presentaron valores más bajos de fuerza de reacción del suelo de pico (0,65-0,75 PC) e impulso similar (94-133 N·s) en comparación con las mujeres jóvenes, por lo tanto, el ejercicio evaluado puede considerarse de baja probabilidad de lesiones musculoesqueléticas, independientemente de la cadencia de ejecución.Background: Increasing knowledge about the forces that act in different aquatic exercises in women of different ages is important for a more effective and individualized prescription. Goals: To compare the vertical ground reaction force during the water-based frontal kick exercise performed at different cadences between young and postmenopausal women. Method: Twenty-four participants, twelve young (23.7 ± 3.6 years) and 12 postmenopausal women (57.3 ± 2.6 years), voluntarily completed a session with frontal kick performance in the aquatic environment (cadences 80, 100, and 120 b.min-1) to determine peak and impulse of vertical ground reaction force. Repeated measures two-way ANOVA was used (α = 0.05). Results: The peak vertical ground reaction force increased from 80 b.min-1 to the higher cadences (p < 0.001). In addition, young showed greater peak vertical ground reaction values than the postmenopausal women (p = 0.012), revealing that postmenopausal women presented 78-82% of peak vertical ground reaction values observed for young women during water-based frontal kick exercise. Moreover, it was observed a reduction in impulse with the increasing cadence (p < 0.001), with similar values between young and postmenopausal women (p = 0.835). Conclusions: These findings highlight the safety of the water-based exercise for postmenopausal women since lower peak vertical ground reaction (0.65-0.75 BW) and similar impulse (94-133 N·s) values were observed in comparison to the young ones, considered as low odds for musculoskeletal injuries, regardless the cadence of performance.Introdução: Aumentar o conhecimento sobre as forças que atuam em diferentes exercícios aquáticos em mulheres de diferentes idades é importante para uma prescrição mais eficaz e individualizada. Objetivos: comparar a força de reação do solo durante o exercício de hidroginástica chute frontal realizado em diferentes cadências entre mulheres jovens e na pós-menopausa. Método: a amostra foi composta por 24 mulheres, 12 mulheres jovens (23,7 ± 3,6 anos) e 12 mulheres na pós-menopausa (57,3 ± 2,6 anos). Para determinar a força de reação do solo vertical de pico e o impulso, as voluntárias realizaram o exercício de hidroginástica chute frontal em diferentes cadências (80, 100 e 120 b.min-1). Para análise dos dados foi utilizada uma ANOVA de dois caminhos (α = 0,05). Resultados: Foi observado um aumento da força de reação do solo de pico da cadência de 80 b.min-1 para as maiores cadências (p < 0.001). As mulheres jovens apresentaram maiores valores de força de reação do solo de pico em comparação as pós-menopáusicas (p = 0,012), com valores para as pós-menopáusicas correspondentes a 78-82% dos observados para as jovens durante o exercício chute frontal. Além disso, foi observada uma redução do impulso nas maiores cadências (p < 0,001), com valores semelhantes entre os grupos (p = 0,835). Conclusões: as mulheres na pós-menopausa apresentaram menores valores de força de reação do solo de pico (0,65-0,75 PC) e impulso semelhante (94-133 N·s) em comparação às jovens, logo, pode-se considerar o exercício avaliado como sendo de baixa chance de lesões musculoesqueléticas, independentemente da cadência de execução