On the role of RNA binding proteins in polyglutamine diseases: from pathogenesis to therapeutics

Polyglutamine (polyQ) diseases are a group of different neurodegenerative disorders characterized by an abnormal expansion of the trinucleotide cytosine-adenine-guanine (CAG) within coding regions of each disease-associated gene. The abnormal expansion translates into a protein bearing an abnormally long tract of glutamines. The expanded proteins are prone to aggregate, promote aberrant interaction with other proteins and mRNAs and contribute to cellular pathway disruption (Matos et al., 2019). To date, nine different polyQ diseases are described, including among others, Huntington’s disease, and six different spinocerebellar ataxias (SCA). Patients affected by polyQ diseases, suffer a myriad of motor symptoms that include ataxia, dysphagia, tremors, dysarthria, and even dementia. Unfortunately, there is no cure nor treatment able to delay the disease and patients rely only on symptomatic and supportive treatments culminating in premature death (Takahashi et al., 2010).info:eu-repo/semantics/publishedVersio

From the molecular hallmarks to motor behavior: characterization of a new transgenic mouse model for spinocerebellar ataxia type 2

Spinocerebellar ataxia type 2 (SCA2) is a rare disease with no cure, and therefore patients depend on symptomatic and supportive treatments. It is a highly debilitating disease affecting predominantly the brain with symptoms that include motor and coordination impairment. SCA2 is caused by an abnormal expansion of the CAG triplet in the coding region of the ATXN2 gene. When it has above 33 CAG repeats, it originates a protein with an abnormally expanded glutamine tract. The mutant protein impairs several cellular functions, leading to neuronal degeneration and death. Several rodent models were developed to study the neuropathology and potential therapies for SCA2. However, most of them fail to mimic a complete SCA2 phenotype, taking too long to develop diseaserelated symptoms or failing to display neuronal-associated deficits.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

The cholesterol 24-hydroxylase activates autophagy and decreases mutant huntingtin build-up in a neuroblastoma culture model of Huntington’s disease

Objective Compromised brain cholesterol turnover and altered regulation of brain cholesterol metabolism have been allied with some neurodegenerative diseases, including Huntington’s disease (HD). Following our previous studies in HD, in this study we aim to investigate in vitro in a neuroblastoma cellular model of HD, the effect of CYP46A1 overexpression, an essential enzyme in cholesterol metabolism, on huntingtin aggregation and levels. Results We found that CYP46A1 reduces the quantity and size of mutant huntingtin aggregates in cells, as well as the levels of mutant huntingtin protein. Additionally, our results suggest that the observed beneficial effects of CYP46A1 in HD cells are linked to the activation of autophagy. Taken together, our results further demonstrate that CYP46A1 is a pertinent target to counteract HD progression.This work was supported by Brainvectis and E.rare: E-Rare Joint Transnational Call for Proposals 2017 “Transnational Research Projects for Innovative Therapeutic Approaches for Rare Diseases”. CN laboratory is supported by the French Muscular Dystrophy Association (AFM-Téléthon), the Ataxia UK, and the Fundação para a Ciência e Tecnologia (project ALG-01-0145-FEDER-29480 “SeGrPolyQ”). AM is supported by a Ph.D. fellowship from FCT (SFRH/BD/133192/2017)info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Cordycepin activates autophagy through AMPK phosphorylation to reduce abnormalities in Machado-Joseph disease models

Machado-Joseph disease (MJD) is a neurodegenerative disorder caused by an abnormal expansion of citosine-adenine-guanine trinucleotide repeats in the disease-causing gene. This mutation leads to an abnormal polyglutamine tract in the protein ataxin-3 (Atx3), resulting in formation of mutant Atx3 aggregates. Despite several attempts to develop a therapeutic option for MJD, currently there are no available therapies capable of delaying or stopping disease progression. Recently, our group reported that reducing the expression levels of mutant Atx3 lead to a mitigation of several MJD-related behavior and neuropathological abnormalities. Aiming a more rapid translation to the human clinics, in this study we investigate a pharmacological inhibitor of translation-cordycepin-in several preclinical models. We found that cordycepin treatment significantly reduced (i) the levels of mutant Atx3, (ii) the neuropathological abnormalities in a lentiviral mouse model, (iii) the motor and neuropathological deficits in a transgenic mouse model and (iv) the number of ubiquitin aggregates in a human neural model. We hypothesize that the effect of cordycepin is mediated by the increase of phosphorylated adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) levels, which is accompanied by a reduction in the global translation levels and by a significant activation of the autophagy pathway. Overall, this study suggests that cordycepin might constitute an effective and safe therapeutic approach for MJD, and probably for the other polyglutamine diseases.European Union through the European social fund, funds Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional through the Competitive Factors Operational Program-COMPETE, POPH and QRENFrench Muscular Dystrophy Association (AFM-Telethon) [18776]Ataxia UKFundacao para a Ciencia e TecnologiaPortuguese Foundation for Science and Technology [SFRH/BD/133192/2017]FCT - Fundacao para a Ciencia e a Tecnologia, I.P. [UID/BIM/04773/2013 CBMR

The stress granule protein G3BP1 alleviates spinocerebellar ataxia-associated deficits

Koppenol et al. show that overexpression of G3BP1 in cell models of SCA2 and SCA3 leads to a reduction in ataxin-2 and ataxin-3 aggregation. G3BP1 lentiviral delivery reduces motor deficits and neuropathology in preclinical models, suggesting that G3BP1 may be a potential therapeutic target for polyQ disorders. Polyglutamine diseases are a group of neurodegenerative disorders caused by an abnormal expansion of CAG repeat tracts in the codifying regions of nine, otherwise unrelated, genes. While the protein products of these genes are suggested to play diverse cellular roles, the pathogenic mutant proteins bearing an expanded polyglutamine sequence share a tendency to self-assemble, aggregate and engage in abnormal molecular interactions. Understanding the shared paths that link polyglutamine protein expansion to the nervous system dysfunction and the degeneration that takes place in these disorders is instrumental to the identification of targets for therapeutic intervention. Among polyglutamine diseases, spinocerebellar ataxias (SCAs) share many common aspects, including the fact that they involve dysfunction of the cerebellum, resulting in ataxia. Our work aimed at exploring a putative new therapeutic target for the two forms of SCA with higher worldwide prevalence, SCA type 2 (SCA2) and type 3 (SCA3), which are caused by expanded forms of ataxin-2 (ATXN2) and ataxin-3 (ATXN3), respectively. The pathophysiology of polyglutamine diseases has been described to involve an inability to properly respond to cell stress. We evaluated the ability of GTPase-activating protein-binding protein 1 (G3BP1), an RNA-binding protein involved in RNA metabolism regulation and stress responses, to counteract SCA2 and SCA3 pathology, using both in vitro and in vivo disease models. Our results indicate that G3BP1 overexpression in cell models leads to a reduction of ATXN2 and ATXN3 aggregation, associated with a decrease in protein expression. This protective effect of G3BP1 against polyglutamine protein aggregation was reinforced by the fact that silencing G3bp1 in the mouse brain increases human expanded ATXN2 and ATXN3 aggregation. Moreover, a decrease of G3BP1 levels was detected in cells derived from patients with SCA2 and SCA3, suggesting that G3BP1 function is compromised in the context of these diseases. In lentiviral mouse models of SCA2 and SCA3, G3BP1 overexpression not only decreased protein aggregation but also contributed to the preservation of neuronal cells. Finally, in an SCA3 transgenic mouse model with a severe ataxic phenotype, G3BP1 lentiviral delivery to the cerebellum led to amelioration of several motor behavioural deficits. Overall, our results indicate that a decrease in G3BP1 levels may be a contributing factor to SCA2 and SCA3 pathophysiology, and that administration of this protein through viral vector-mediated delivery may constitute a putative approach to therapy for these diseases, and possibly other polyglutamine disorders.PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122info:eu-repo/semantics/publishedVersio

MSGP: the first database of the protein components of the mammalian stress granules

In response to different stress stimuli, cells transiently form stress granules (SGs) in order to protect themselves and re-establish homeostasis. Besides these important cellular functions, SGs are now being implicated in different human diseases, such as neurodegenerative disorders and cancer. SGs are ribonucleoprotein granules, constituted by a variety of different types of proteins, RNAs, factors involved in translation and signaling molecules, being capable of regulating mRNA translation to facilitate stress response. However, until now a complete list of the SG components has not been available. Therefore, we aimer at identifying and linting in an open access database all the proteins described so far as components of SGs. The identification was made through an exhaustive search of studies listed in PubMed and double checked. Moreover, for each identified protein several details were also gathered from public databases, such as the molecular function, the cell types in which they were detected, the type of stress stimuli used to induce SG formation and the reference of the study describing the recruitment of the component to SGs. Expression levels in the context of different neurodegenerative diseases were also obtained and are also described in the database. The Mammalian Stress Granules Proteome is available at https://msgp.pt/, being a new and unique open access online database, the first to list all the protein components of the SGs identified so far. The database constitutes an important and valuable tool for researchers in this research area of growing interest.Portuguese Science and Technology Foundation (FCT) project ALG-01-0145-FEDER-29480 Algarve Biomedical Center (ABC) Município de Loulé French Muscular Dystrophy Association Ataxia UK FCT SFRH/BD/133192/2017info:eu-repo/semantics/publishedVersio

On the role of stress granules in autophagy

Tese de mestrado, Neurociências, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2019Os grânulos de stress (SGs) são foci citoplasmáticos constituídos por mRNAs, fatores de iniciação da tradução e muitas outras proteínas que afetam a função do mRNA, especialmente proteínas ligantes de RNA (RBPs). Estes complexos de ribonucleoproteínas formam-se transientemente em resposta ao stress celular, dissipando-se logo após a remoção do agente de stress, integrando uma estratégia para minimizar os danos relacionados com o stress e potenciar a sobrevivência celular. Molecularmente, a formação de SGs é geralmente despoletada pela fosforilação do fator de iniciação da tradução 2 alfa (eIF2α) culminando no bloqueio da tradução. Além disso, algumas proteínas, entre elas RBPs, são requeridas para a formação e nucleação destes foci, Tão importante quanto a formação de SGs, é também a sua dissociação, que é mediada pela macroautofagia e pela autofagia mediada por chaperonas. Uma vez realizada a dissociação destes grânulos, a tradução é restabelecida e a célula retoma as suas funções normais, com o objetivo de restabelecer a sua homeostasia. Contudo, se o stress persistir, os SGs tornam-se também persistentes e podem conduzir à formação de agregados que se parecem com os agregados patológicos observados em várias doenças neurodegenerativas. De facto, estudos anteriores observaram que mutações nos componentes dos SGs aumentavam a sua tendência para agregar e acumular proteínas malconformadas, alterando as funções normais dos SGs. A autofagia é um processo catabólico que atua na degradação celular, permitindo a reciclagem dos constituintes citoplasmáticos em materiais bioenergéticos e biosintéticos, para a manutenção da homeostasia celular. A macroautofagia (comumente conhecida apenas por autofagia) depende da formação de novo de vesiculas citoplasmáticas de dupla membrana, os autofagossomas, para sequestrar e transportar os substratos para degradação nos lisossomas. O comprometimento da autofagia é uma característica comum em grande parte das doenças neurodegenerativas, causando um desequilíbrio na homeostasia celular, dada a incapacidade da célula em eliminar agregados proteicos. De facto, a íntima ligação entre a autofagia e os SGs sugere a hipótese de que os SGs poderão contribuir para as doenças neurodegenerativas. Uma vez que os SGs dependem da autofagia para se dissociarem, caso contrário tornam-se persistentes, sugere-se que estes foci contribuam, através dos seus domínios de agregação proteica, para o aumento do tamanho dos agregados de proteínas já em acumulação nestas doenças, efeito potenciado também pela disfunção da via autofágica. Os exosomas são um tipo de vesiculas extracelulares (EVs) secretados por quase todos os tipos celulares. Estas vesículas de tamanho reduzido possuem uma bicamada lipídica, o que faz com que consigam passar a barreira hematoencefálica. O conteúdo dos exosomas é maioritariamente composto por mRNAs, microRNAs, DNAs, enzimas, moléculas de sinalização, e diferentes proteínas, tornando estas vesiculas importantes do ponto de vista da comunicação intercelular, especialmente porque permitem a coordenação das funções celulares, sendo essenciais para o desenvolvimento e adaptação ambiental dos organismos multicelulares. Apesar da importância da comunicação intercelular mediada por exosomas, alguns estudos sugerem o seu envolvimento na propagação de proteínas tóxicas, entre as quais, proteínas mutadas e com uma conformação deficiente, que podem desencadear a formação de oligómeros e agregados proteicos patológicos. Além disto, estudos anteriores mostraram que defeitos na função autofágica podem desencadear a libertação de vesiculas para o espaço extracelular, promovendo a saída de agregados celulares proteicos e, consequentemente, aliviando o stress proteotóxico. Adicionalmente, também foram fornecidas evidências de que o stress celular poderia desencadear um aumento da libertação de exossomas, de modo a aliviar a tensão celular, o que seria ainda mais importante em situações em que a autofagia está danificada. As doenças de poliglutaminas são um grupo de doenças raras, hereditárias e progressivas, caracterizadas por uma anormal repetição do trinucleótido citosina-adenina-guanina (CAG), na região codificante de pelo menos nove genes conhecidos. As extensas repetições de CAG são traduzidas numa série de resíduos de glutamina ininterruptos, criando um trato de anormal de poliglutaminas (polyQ) e uma consequente acumulação das respetivas proteínas. Entre estas doenças encontram-se a doença de Huntington (HD), a ataxia espinocerebelosa do tipo 2 (SCA2) e a doença de Machado Joseph (MJD), causadas pela expansão CAG nos genes que codificam as proteínas huntingtina, ataxina-2 e ataxina-3, respetivamente. Embora cada gene tenha o seu próprio limiar de repetições CAG e diferentes localizações cromossomais, as doenças de polyQ partilham algumas características, como por exemplo, a existência de uma correlação positiva entre o número de repetições CAG e a severidade e precocidade dos sintomas, uma instabilidade geracional na transmissão do número de repetições CAG e a tendência dos produtos proteicos para agregar e formar agregados proteicos intracelulares, que são detetadas nos neurónios dos doentes. O objetivo principal deste projeto foi estudar a dinâmica dos grânulos de stress no contexto das doenças de poliglutaminas, bem como a sua relação com a autofagia e a formação de exossomas. Neste trabalho observou-se que a indução de stress oxidativo com arsenito de sódio, conduz à formação de grânulos de stress em células neuroblastoma de murganho (N2a), e que essa formação implica a paragem da tradução. A formação de SGs mostrou alterar a dinâmica da localização subcelular das proteínas huntintina e ataxina-2, mas não da ataxina-3. Também, foi possível notar que quando as células estavam expostas ao stress, o número de agregados das proteínas mutantes huntingtina e ataxina-2 aumentava, quando comparado com as condições sem stress. O mesmo não aconteceu com a ataxina-3 mutante. Relativamente à interação entre a autofagia e os grânulos de stress, mostrou-se que o bloqueio da autofagia não afeta a quantidade de células com grânulos, contudo a indução de grânulos de stress afeta a via autofágica. A alteração dos níveis proteicos de LC3b-II e p62 observados com a formação dos SGs, apontam para uma provável interação entre estes e estas proteínas autofágicas, o que constitui um dado interessante no contexto de doenças que apresentem um comprometimento da autofagia. Por outro lado, este trabalho evidenciou que uma indução da autofagia, tanto molecularmente, como farmacologicamente, reduz a quantidade e o tamanho dos grânulos de stress, em células N2a e em fibroblastos humanos de pessoas saudáveis e de doentes de SCA2. Os nossos resultados mostram ainda, embora de forma preliminar, que a presença de SGs altera os níveis de marcadores de exossomas em células que expressam as proteínas polyQ mutantes. Em suma, este trabalho fornece algumas evidências científicas relativamente ao papel molecular dos SGs na via autofágica e vice-versa, constituindo uma ferramenta para o estudo mais aprofundado dos seus mecanismos de interação, em doenças neurodegenerativas, especialmente nas doenças de poliglutaminas. Proporciona, também, uma melhor compreensão acerca da possível relação dos SGs com os agregados de proteínas mutantes das doenças HD, SCA2, e MJD, constituindo uma plataforma para futuros estudos nesta área. Por último, os resultados preliminares apresentados neste trabalho, relativamente à interação entre os exossomas, os SGs e as proteínas polyQ mutadas, constituem uma base para futuros estudos que possam relacionar estes intervenientes e compreender a sua relevância na patogénese destas doenças