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Physiologische Funktion und Modulation des TRPV2-Ionenkanals in Zellen des angeborenen Immunsystems
Obwohl der Ca2+ permeable Ionenkanal TRPV2 in zahlreichen Immunzellen exprimiert wird, ist wenig ĂŒber seine physiologische Funktion bekannt. Bisherige Studien verlieĂen sich gröĂtenteils auf die Anwendung von unspezifischen Modulatoren, TRPV2-defizienten MĂ€usen oder siRNA-vermittelten TRPV2-knockdown. Weder zellulĂ€re Kompensationsmechanismen noch unspezifische Effekte können dabei ausgeschlossen werden. Daher haben wir eine etwa 5.500 Substanzen umfassende Substanzbibliothek auf niedermolekulare Modulatoren mit einer TRPV2-AktivitĂ€t untersucht. Mittels Fluoreszenz-basiertem Mediumdurchsatz-Screening und HEK293-Zellen, die stabil Ratten-TRPV2-IonenkanĂ€le exprimieren (HEKrTRPV2), konnten 3 strukturchemisch verwandte neuartige Inhibitoren ermittelt werden (IV2-1, IV2-2, IV2-3). SelektivitĂ€tsuntersuchen mit HEK293-Zellen, die stabil Ratten-TRPV1, Ratten-TRPV2, Maus TRPV3, Maus-TRPV4 oder Maus-TRPM3 exprimieren, zeigten, dass alle drei Substanzen eine TRPV2-SelektivitĂ€t aufwiesen. Aufgrund des besseren IC50-Wertes wurde IV2-1 (IC50 = 6,3 ± 0.7 ”M) als Leitstruktur ausgewĂ€hlt und fĂŒr weitere Untersuchungen verwendet. In Fluoreszenz-basierten Einzelzell-Ca2+-Assays von HEKrTRPV2- und RBL-2H3-Zellen, welche TRPV2 endogen exprimieren, blockierte IV2-1 durch 2 APB oder 2 APB/Probenecid induzierte TRPV2-vermittelte Ca2+-Einströme. In elektrophysiologischen Patch-Clamp-Messungen konnten 2-APB-verursachte Ein- und AuswĂ€rtsströme des TRPV2-Kanals in HEKrTRPV2- und RBL-2H3-Zellen durch IV2-1 reversibel blockiert werden. MTT Assays zur Ermittlung zytotoxischer Effekte von IV2-1 auf HEK293-, HEKrTRPV2- und RBL-2H3-Zellen ergaben keine Minderung der ZellviabilitĂ€t bis zu einer Konzentration von 50 ”M. Somit konnte IV2 1 als neuer, nicht toxischer TRPV2-Inhibitor validiert werden.
In Zellen des angeborenen Immunsystems wie z.B. Makrophagen könnten TRPV2-vermittelte Ca2+-Signale wichtige Mechanismen wie Phagozytose und Migration beeinflussen. Um den physiologischen Einfluss von TRPV2 in primÀren Makrophagen zu untersuchen, wurden aus Stammzellen des Knochenmarks von MÀusen primÀre Makrophagen (BMDM) differenziert. Als BestÀtigung der funktionellen Expression von TRPV2-KanÀlen in BMDM konnten in Fluoreszenz-basierten Einzelzell-Analysen mittels 2-APB Ca2+-Einströme ermittelt werden, welche durch Zugabe von IV2 1 blockiert wurden. Weiterhin wurde ein siRNA-vermittelter knockdown von TRPV2 in BMDM etabliert. Mittels quantitativer Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) konnte sowohl die Expression von TRPV2-mRNA als auch der knockdown um etwa 70 Prozent in BMDM beobachtet werden. Die Kombination 2 APB/Probenecid induzierte auch in moderaten Konzentrationen einen TRPV2-vermittelten Ca2+Einstrom in BMDM, ohne zytotoxische Effekte zu verursachen.
Als nĂ€chstes sollte in BMDM der Einfluss der TRPV2-AktivitĂ€t auf die Phagozytose von Zymosan- und Staphylococcus aureus-Biopartikeln untersucht werden, welche mit einem pH-sensitiven Fluoreszenzindikator gekoppelt waren. Sowohl siRNA-vermittelter knockdown von TRPV2 als auch TRPV2-Inhibition durch IV2-1 oder Valdecoxib reduzierten die PhagozytoseaktivitĂ€t der BMDM auf etwa 70 Prozent im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen. Diese Ergebnisse bestĂ€tigen eine Beteiligung von TRPV2 bei der Phagozytose. AnschlieĂend wurden Transwell-Migrationsassays von BMDM in einem Gradienten aus Lipopolysacchariden (LPS) durchgefĂŒhrt. WĂ€hrend die TRPV2-Inhibiton mit IV2 1, Valdecoxib oder ein TRPV2-knockdown die LPS-induzierte Migration von BMDM signifikant verringerte, steigerte die TRPV2-Aktivierung durch 2-APB/Probenecid die Anzahl migrierter BMDM im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen signifikant. Somit konnte ebenso eine TRPV2-Beteiligung bei der Migration von Makrophagen gezeigt werden. Da Phagozytose und Migration zielgerichtete Prozesse darstellen, sollten auch die Ca2+-Signale rĂ€umlich und zeitlich koordiniert auftreten. Solche lokal begrenzten, kurzen Ca2+-Fluktuationen können durch Ca2+-MikrodomĂ€nen verursacht werden, welche der AktivitĂ€t einzelner oder weniger KanĂ€le entsprechen. Mittels TIRF-Mikroskopie und eines niederaffinen Ca2+-Indikators können hohe Ca2+-Fluktuationen in unmittelbarer NĂ€he zur Zellmembran selektiv detektiert und somit potenzielle durch TRPV2 generierte Ca2+ MikrodomĂ€nen in Makrophagen untersucht werden. Nach der TRPV2-Aktivierung mit 2 APB/Probenecid konnten punktuelle, hohe Ca2+ Fluktuationen in BMDM ermittelt werden, welche nach Zugabe von IV2-1 inhibiert wurden. Unter physiologischeren Bedingungen wurden zudem basal aktive Ca2+ MikrodomĂ€nen beobachtet, welche durch IV2 1 inhibiert wurden. Dementsprechend scheint TRPV2 in BMDM basal aktive Ca2+-MikrodomĂ€nen ausbilden zu können.
Bisher konnte nur die Kombination aus 2-APB und Probenecid in moderaten Konzentrationen genutzt werden, um TRPV2-IonenkanĂ€le ohne zytotoxische Effekte durch hohe Konzentrationen der Einzelsubstanzen zu aktivieren. Allerdings zeigt 2-APB keine Wirkung auf humane TRPV2 KanĂ€le, weshalb neue Möglichkeiten der TRPV2-Aktivierung essentiell sind. Um weitere potenzierende Effekte zu untersuchen, wurde Cannabidiol (CBD) als potentester TRPV2-Aktivator aus der Gruppe der Cannabinoide in Kombination mit Probenecid untersucht. In einer zweidimensionalen Analyse von CBD- und Probenecid-VerdĂŒnnungsreihen konnte eine potenzierende Wirkung der Kombination festgestellt werden, die sowohl humane als auch Ratten TRPV2-KanĂ€le superadditiv aktivierte. Mittels Fluoreszenz-basierten Einzelzell-Analysen sowie elektrophysiologischen Patch-Clamp-Messungen von HEKrTRPV2- und HEKhuTRPV2-Zellen konnte dieser superadditive Effekt von CBD/Probenecid bestĂ€tigt werden. Die CBD/Probenecid-induzierte AktivitĂ€t humaner oder Ratten TRPV2-KanĂ€le konnte durch IV2-1 inhibiert werden, wohingegen Valdecoxib zwar Ratten-TRPV2 blockierte, jedoch humanen TRPV2 nicht vollstĂ€ndig inhibieren konnte.
Mastzellen sind maĂgeblich an der Freisetzung von allergischen und inflammatorischen Mediatoren beteiligt und stellen somit einen wichtigen Bestandteil des angeboren Immunsystems dar. WĂ€hrend die AusschĂŒttung von Leukotrienen, ÎČ-Hexosaminidase oder Histamin gröĂtenteils IgE-vermittelt stattfindet, können davon unabhĂ€ngig auch andere Signalkaskaden, wie z.B. durch MRGPRX2-vermittelt, die Degranulation von Mastzellen induzieren. Da Mastzellen ebenfalls TRPV2-IonenkanĂ€le exprimieren, könnte ein TRPV2-vermittelter Ca2+ Einstrom die Freisetzung von Mediatoren beeinflussen. Mit Hilfe der neuen TRPV2-Modulatoren und Fluoreszenz-basierten Einzelzell-Ca2+-Analysen wurde zunĂ€chst die endogene TRPV2-Expression in basophilen RBL-2H3-Zellen als alternatives Zellmodell zu Mastzellen bestĂ€tigt. Zudem konnten keine zytotoxischen Effekte bis zu Konzentrationen von 50 ”M IV2-1 oder Valdecoxib sowie einer Kombination aus 12.5 ”M CBD und 500 ”M Probenecid festgestellt werden. In Fluoreszenz-basierten Einzelzell-Ca2+-Analysen konnte nach physiologischer Stimulation der FcΔ-Rezeptoren ein Anstieg der intrazellulĂ€ren Ca2+ Konzentration gemessen werden, der durch TRPV2-Inhibition mit IV2-1 oder Valdecoxib nicht blockiert wurde. In Untersuchungen zur Freisetzung von ÎČ-Hexosaminidase steigerte die Kombination CBD/Probenecid die MediatorausschĂŒttung hingegen deutlich. Dieser Effekt konnte durch TRPV2-Inhibition mit IV2-1 oder Valdecoxib inhibiert werden. Eine Kombination des TRPV2-vermittelten sowie des IgE-induzierten Stimulus fĂŒhrte zu einer additiv gesteigerten Freisetzung. Somit könnte TRPV2 unabhĂ€ngig von der IgE-Signalkaskade eine wichtige physiologische Funktion bei der Degranulation von Mastzellen spielen.
Daher wurden im nĂ€chsten Schritt primĂ€re Mastzellen aus dem Knochenmark von MĂ€usen differenziert (BMMC) und die mRNA- sowie funktionelle Expression von TRPV2 durch qPCR und Fluoreszenz-basierte Ca2+-Assays bestĂ€tigt. Die verwendeten Modulatoren induzierten auch in BMMC in gleichen Konzentrationen wie in RBL 2H3-Zellen keine zytotoxischen Effekte. Die vorherigen Ergebnisse des Einflusses der TRPV2-AktivitĂ€t auf die AusschĂŒttung von ÎČ-Hexosaminidase konnten mit BMMC ebenso bestĂ€tigt werden. Mittels ELISA wurde zuletzt ein TRPV2-vermittelter Effekt auf die Histaminfreisetzung aus BMMC untersucht. Demnach steigerte die Kombination CBD/Probenecid die HistaminausschĂŒttung deutlich, was durch TRPV2-Inhibition mit IV2 1 blockiert werden konnte. Auch hier hatte IV2-1 keinen Effekt auf die IgE-induzierte Histaminfreisetzung. Die simultane Stimulation der FcΔ-Rezeptoren und der TRPV2-KanĂ€le resultierte in einer additiv gesteigerten HistaminausschĂŒttung. Folglich scheint TRPV2-AktivitĂ€t die Freisetzung von Mediatoren wie Histamin oder ÎČ-Hexosaminidase unabhĂ€ngig von der klassischen IgE-vermittelten Signalkaskade zu beeinflussen, was TRPV2 zu einer vielversprechenden Zielstruktur zur weiteren Erforschung im pathophysiologischen Kontext von entzĂŒndlichen und allergischen Reaktionen macht
Pharmacological inhibition of TRPV2 attenuates phagocytosis and lipopolysaccharideâinduced migration of primary macrophages
Background and Purpose: In macrophages, transient receptor potential vanilloid 2 (TRPV2) channel contributes to various cellular processes such as cytokine production, differentiation, phagocytosis and migration. Due to a lack of selective pharmacological tools, its function in immunological processes is not well understood and the identification of novel and selective TRPV2 modulators is highly desirable.
Experimental Approach: Novel and selective TRPV2 modulators were identified by screening a compound library using Ca2+ influx assays with human embryonic kidney 293 (HEK293) cells heterologously expressing rat TRPV2. Hits were further characterized and validated with Ca2+ influx and electrophysiological assays. Phagocytosis and migration of macrophages were analysed and the contribution of TRPV2 to the generation of Ca2+ microdomains was studied by total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM).
Key Results: The compound IV2-1, a dithiolane derivative (1,3-dithiolan-2-ylidene)-4-methyl-5-phenylpentan-2-one), is a potent inhibitor of heterologously expressed TRPV2 channels (IC50â=â6.3â±â0.7âÎŒM) but does not modify TRPV1, TRPV3 or TRPV4 channels. IV2-1 also inhibits TRPV2-mediated Ca2+ influx in macrophages. IV2-1 inhibits macrophage phagocytosis along with valdecoxib and after siRNA-mediated knockdown. Moreover, TRPV2 inhibition inhibits lipopolysaccharide-induced migration of macrophages whereas TRPV2 activation promotes migration. After activation, TRPV2 shapes Ca2+ microdomains predominantly at the margin of macrophages, which are important cellular regions to promote phagocytosis and migration.
Conclusions and Implications: IV2-1 is a novel TRPV2-selective blocker and underline the role of TRPV2 in macrophage-mediated phagocytosis and migration. Furthermore, we provide evidence that TRPV2 activation generates Ca2+ microdomains, which may be involved in phagocytosis and migration of macrophages
Physiologische Funktion und Modulation des TRPV2-Ionenkanals in Zellen des angeborenen Immunsystems
Obwohl der Ca2+ permeable Ionenkanal TRPV2 in zahlreichen Immunzellen exprimiert wird, ist wenig ĂŒber seine physiologische Funktion bekannt. Bisherige Studien verlieĂen sich gröĂtenteils auf die Anwendung von unspezifischen Modulatoren, TRPV2-defizienten MĂ€usen oder siRNA-vermittelten TRPV2-knockdown. Weder zellulĂ€re Kompensationsmechanismen noch unspezifische Effekte können dabei ausgeschlossen werden. Daher haben wir eine etwa 5.500 Substanzen umfassende Substanzbibliothek auf niedermolekulare Modulatoren mit einer TRPV2-AktivitĂ€t untersucht. Mittels Fluoreszenz-basiertem Mediumdurchsatz-Screening und HEK293-Zellen, die stabil Ratten-TRPV2-IonenkanĂ€le exprimieren (HEKrTRPV2), konnten 3 strukturchemisch verwandte neuartige Inhibitoren ermittelt werden (IV2-1, IV2-2, IV2-3). SelektivitĂ€tsuntersuchen mit HEK293-Zellen, die stabil Ratten-TRPV1, Ratten-TRPV2, Maus TRPV3, Maus-TRPV4 oder Maus-TRPM3 exprimieren, zeigten, dass alle drei Substanzen eine TRPV2-SelektivitĂ€t aufwiesen. Aufgrund des besseren IC50-Wertes wurde IV2-1 (IC50 = 6,3 ± 0.7 ”M) als Leitstruktur ausgewĂ€hlt und fĂŒr weitere Untersuchungen verwendet. In Fluoreszenz-basierten Einzelzell-Ca2+-Assays von HEKrTRPV2- und RBL-2H3-Zellen, welche TRPV2 endogen exprimieren, blockierte IV2-1 durch 2 APB oder 2 APB/Probenecid induzierte TRPV2-vermittelte Ca2+-Einströme. In elektrophysiologischen Patch-Clamp-Messungen konnten 2-APB-verursachte Ein- und AuswĂ€rtsströme des TRPV2-Kanals in HEKrTRPV2- und RBL-2H3-Zellen durch IV2-1 reversibel blockiert werden. MTT Assays zur Ermittlung zytotoxischer Effekte von IV2-1 auf HEK293-, HEKrTRPV2- und RBL-2H3-Zellen ergaben keine Minderung der ZellviabilitĂ€t bis zu einer Konzentration von 50 ”M. Somit konnte IV2 1 als neuer, nicht toxischer TRPV2-Inhibitor validiert werden.
In Zellen des angeborenen Immunsystems wie z.B. Makrophagen könnten TRPV2-vermittelte Ca2+-Signale wichtige Mechanismen wie Phagozytose und Migration beeinflussen. Um den physiologischen Einfluss von TRPV2 in primÀren Makrophagen zu untersuchen, wurden aus Stammzellen des Knochenmarks von MÀusen primÀre Makrophagen (BMDM) differenziert. Als BestÀtigung der funktionellen Expression von TRPV2-KanÀlen in BMDM konnten in Fluoreszenz-basierten Einzelzell-Analysen mittels 2-APB Ca2+-Einströme ermittelt werden, welche durch Zugabe von IV2 1 blockiert wurden. Weiterhin wurde ein siRNA-vermittelter knockdown von TRPV2 in BMDM etabliert. Mittels quantitativer Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) konnte sowohl die Expression von TRPV2-mRNA als auch der knockdown um etwa 70 Prozent in BMDM beobachtet werden. Die Kombination 2 APB/Probenecid induzierte auch in moderaten Konzentrationen einen TRPV2-vermittelten Ca2+Einstrom in BMDM, ohne zytotoxische Effekte zu verursachen.
Als nĂ€chstes sollte in BMDM der Einfluss der TRPV2-AktivitĂ€t auf die Phagozytose von Zymosan- und Staphylococcus aureus-Biopartikeln untersucht werden, welche mit einem pH-sensitiven Fluoreszenzindikator gekoppelt waren. Sowohl siRNA-vermittelter knockdown von TRPV2 als auch TRPV2-Inhibition durch IV2-1 oder Valdecoxib reduzierten die PhagozytoseaktivitĂ€t der BMDM auf etwa 70 Prozent im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen. Diese Ergebnisse bestĂ€tigen eine Beteiligung von TRPV2 bei der Phagozytose. AnschlieĂend wurden Transwell-Migrationsassays von BMDM in einem Gradienten aus Lipopolysacchariden (LPS) durchgefĂŒhrt. WĂ€hrend die TRPV2-Inhibiton mit IV2 1, Valdecoxib oder ein TRPV2-knockdown die LPS-induzierte Migration von BMDM signifikant verringerte, steigerte die TRPV2-Aktivierung durch 2-APB/Probenecid die Anzahl migrierter BMDM im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen signifikant. Somit konnte ebenso eine TRPV2-Beteiligung bei der Migration von Makrophagen gezeigt werden. Da Phagozytose und Migration zielgerichtete Prozesse darstellen, sollten auch die Ca2+-Signale rĂ€umlich und zeitlich koordiniert auftreten. Solche lokal begrenzten, kurzen Ca2+-Fluktuationen können durch Ca2+-MikrodomĂ€nen verursacht werden, welche der AktivitĂ€t einzelner oder weniger KanĂ€le entsprechen. Mittels TIRF-Mikroskopie und eines niederaffinen Ca2+-Indikators können hohe Ca2+-Fluktuationen in unmittelbarer NĂ€he zur Zellmembran selektiv detektiert und somit potenzielle durch TRPV2 generierte Ca2+ MikrodomĂ€nen in Makrophagen untersucht werden. Nach der TRPV2-Aktivierung mit 2 APB/Probenecid konnten punktuelle, hohe Ca2+ Fluktuationen in BMDM ermittelt werden, welche nach Zugabe von IV2-1 inhibiert wurden. Unter physiologischeren Bedingungen wurden zudem basal aktive Ca2+ MikrodomĂ€nen beobachtet, welche durch IV2 1 inhibiert wurden. Dementsprechend scheint TRPV2 in BMDM basal aktive Ca2+-MikrodomĂ€nen ausbilden zu können.
Bisher konnte nur die Kombination aus 2-APB und Probenecid in moderaten Konzentrationen genutzt werden, um TRPV2-IonenkanĂ€le ohne zytotoxische Effekte durch hohe Konzentrationen der Einzelsubstanzen zu aktivieren. Allerdings zeigt 2-APB keine Wirkung auf humane TRPV2 KanĂ€le, weshalb neue Möglichkeiten der TRPV2-Aktivierung essentiell sind. Um weitere potenzierende Effekte zu untersuchen, wurde Cannabidiol (CBD) als potentester TRPV2-Aktivator aus der Gruppe der Cannabinoide in Kombination mit Probenecid untersucht. In einer zweidimensionalen Analyse von CBD- und Probenecid-VerdĂŒnnungsreihen konnte eine potenzierende Wirkung der Kombination festgestellt werden, die sowohl humane als auch Ratten TRPV2-KanĂ€le superadditiv aktivierte. Mittels Fluoreszenz-basierten Einzelzell-Analysen sowie elektrophysiologischen Patch-Clamp-Messungen von HEKrTRPV2- und HEKhuTRPV2-Zellen konnte dieser superadditive Effekt von CBD/Probenecid bestĂ€tigt werden. Die CBD/Probenecid-induzierte AktivitĂ€t humaner oder Ratten TRPV2-KanĂ€le konnte durch IV2-1 inhibiert werden, wohingegen Valdecoxib zwar Ratten-TRPV2 blockierte, jedoch humanen TRPV2 nicht vollstĂ€ndig inhibieren konnte.
Mastzellen sind maĂgeblich an der Freisetzung von allergischen und inflammatorischen Mediatoren beteiligt und stellen somit einen wichtigen Bestandteil des angeboren Immunsystems dar. WĂ€hrend die AusschĂŒttung von Leukotrienen, ÎČ-Hexosaminidase oder Histamin gröĂtenteils IgE-vermittelt stattfindet, können davon unabhĂ€ngig auch andere Signalkaskaden, wie z.B. durch MRGPRX2-vermittelt, die Degranulation von Mastzellen induzieren. Da Mastzellen ebenfalls TRPV2-IonenkanĂ€le exprimieren, könnte ein TRPV2-vermittelter Ca2+ Einstrom die Freisetzung von Mediatoren beeinflussen. Mit Hilfe der neuen TRPV2-Modulatoren und Fluoreszenz-basierten Einzelzell-Ca2+-Analysen wurde zunĂ€chst die endogene TRPV2-Expression in basophilen RBL-2H3-Zellen als alternatives Zellmodell zu Mastzellen bestĂ€tigt. Zudem konnten keine zytotoxischen Effekte bis zu Konzentrationen von 50 ”M IV2-1 oder Valdecoxib sowie einer Kombination aus 12.5 ”M CBD und 500 ”M Probenecid festgestellt werden. In Fluoreszenz-basierten Einzelzell-Ca2+-Analysen konnte nach physiologischer Stimulation der FcΔ-Rezeptoren ein Anstieg der intrazellulĂ€ren Ca2+ Konzentration gemessen werden, der durch TRPV2-Inhibition mit IV2-1 oder Valdecoxib nicht blockiert wurde. In Untersuchungen zur Freisetzung von ÎČ-Hexosaminidase steigerte die Kombination CBD/Probenecid die MediatorausschĂŒttung hingegen deutlich. Dieser Effekt konnte durch TRPV2-Inhibition mit IV2-1 oder Valdecoxib inhibiert werden. Eine Kombination des TRPV2-vermittelten sowie des IgE-induzierten Stimulus fĂŒhrte zu einer additiv gesteigerten Freisetzung. Somit könnte TRPV2 unabhĂ€ngig von der IgE-Signalkaskade eine wichtige physiologische Funktion bei der Degranulation von Mastzellen spielen.
Daher wurden im nĂ€chsten Schritt primĂ€re Mastzellen aus dem Knochenmark von MĂ€usen differenziert (BMMC) und die mRNA- sowie funktionelle Expression von TRPV2 durch qPCR und Fluoreszenz-basierte Ca2+-Assays bestĂ€tigt. Die verwendeten Modulatoren induzierten auch in BMMC in gleichen Konzentrationen wie in RBL 2H3-Zellen keine zytotoxischen Effekte. Die vorherigen Ergebnisse des Einflusses der TRPV2-AktivitĂ€t auf die AusschĂŒttung von ÎČ-Hexosaminidase konnten mit BMMC ebenso bestĂ€tigt werden. Mittels ELISA wurde zuletzt ein TRPV2-vermittelter Effekt auf die Histaminfreisetzung aus BMMC untersucht. Demnach steigerte die Kombination CBD/Probenecid die HistaminausschĂŒttung deutlich, was durch TRPV2-Inhibition mit IV2 1 blockiert werden konnte. Auch hier hatte IV2-1 keinen Effekt auf die IgE-induzierte Histaminfreisetzung. Die simultane Stimulation der FcΔ-Rezeptoren und der TRPV2-KanĂ€le resultierte in einer additiv gesteigerten HistaminausschĂŒttung. Folglich scheint TRPV2-AktivitĂ€t die Freisetzung von Mediatoren wie Histamin oder ÎČ-Hexosaminidase unabhĂ€ngig von der klassischen IgE-vermittelten Signalkaskade zu beeinflussen, was TRPV2 zu einer vielversprechenden Zielstruktur zur weiteren Erforschung im pathophysiologischen Kontext von entzĂŒndlichen und allergischen Reaktionen macht
Physiologische Funktion und Modulation des TRPV2-Ionenkanals in Zellen des angeborenen Immunsystems
Obwohl der Ca2+ permeable Ionenkanal TRPV2 in zahlreichen Immunzellen exprimiert wird, ist wenig ĂŒber seine physiologische Funktion bekannt. Bisherige Studien verlieĂen sich gröĂtenteils auf die Anwendung von unspezifischen Modulatoren, TRPV2-defizienten MĂ€usen oder siRNA-vermittelten TRPV2-knockdown. Weder zellulĂ€re Kompensationsmechanismen noch unspezifische Effekte können dabei ausgeschlossen werden. Daher haben wir eine etwa 5.500 Substanzen umfassende Substanzbibliothek auf niedermolekulare Modulatoren mit einer TRPV2-AktivitĂ€t untersucht. Mittels Fluoreszenz-basiertem Mediumdurchsatz-Screening und HEK293-Zellen, die stabil Ratten-TRPV2-IonenkanĂ€le exprimieren (HEKrTRPV2), konnten 3 strukturchemisch verwandte neuartige Inhibitoren ermittelt werden (IV2-1, IV2-2, IV2-3). SelektivitĂ€tsuntersuchen mit HEK293-Zellen, die stabil Ratten-TRPV1, Ratten-TRPV2, Maus TRPV3, Maus-TRPV4 oder Maus-TRPM3 exprimieren, zeigten, dass alle drei Substanzen eine TRPV2-SelektivitĂ€t aufwiesen. Aufgrund des besseren IC50-Wertes wurde IV2-1 (IC50 = 6,3 ± 0.7 ”M) als Leitstruktur ausgewĂ€hlt und fĂŒr weitere Untersuchungen verwendet. In Fluoreszenz-basierten Einzelzell-Ca2+-Assays von HEKrTRPV2- und RBL-2H3-Zellen, welche TRPV2 endogen exprimieren, blockierte IV2-1 durch 2 APB oder 2 APB/Probenecid induzierte TRPV2-vermittelte Ca2+-Einströme. In elektrophysiologischen Patch-Clamp-Messungen konnten 2-APB-verursachte Ein- und AuswĂ€rtsströme des TRPV2-Kanals in HEKrTRPV2- und RBL-2H3-Zellen durch IV2-1 reversibel blockiert werden. MTT Assays zur Ermittlung zytotoxischer Effekte von IV2-1 auf HEK293-, HEKrTRPV2- und RBL-2H3-Zellen ergaben keine Minderung der ZellviabilitĂ€t bis zu einer Konzentration von 50 ”M. Somit konnte IV2 1 als neuer, nicht toxischer TRPV2-Inhibitor validiert werden.
In Zellen des angeborenen Immunsystems wie z.B. Makrophagen könnten TRPV2-vermittelte Ca2+-Signale wichtige Mechanismen wie Phagozytose und Migration beeinflussen. Um den physiologischen Einfluss von TRPV2 in primÀren Makrophagen zu untersuchen, wurden aus Stammzellen des Knochenmarks von MÀusen primÀre Makrophagen (BMDM) differenziert. Als BestÀtigung der funktionellen Expression von TRPV2-KanÀlen in BMDM konnten in Fluoreszenz-basierten Einzelzell-Analysen mittels 2-APB Ca2+-Einströme ermittelt werden, welche durch Zugabe von IV2 1 blockiert wurden. Weiterhin wurde ein siRNA-vermittelter knockdown von TRPV2 in BMDM etabliert. Mittels quantitativer Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) konnte sowohl die Expression von TRPV2-mRNA als auch der knockdown um etwa 70 Prozent in BMDM beobachtet werden. Die Kombination 2 APB/Probenecid induzierte auch in moderaten Konzentrationen einen TRPV2-vermittelten Ca2+Einstrom in BMDM, ohne zytotoxische Effekte zu verursachen.
Als nĂ€chstes sollte in BMDM der Einfluss der TRPV2-AktivitĂ€t auf die Phagozytose von Zymosan- und Staphylococcus aureus-Biopartikeln untersucht werden, welche mit einem pH-sensitiven Fluoreszenzindikator gekoppelt waren. Sowohl siRNA-vermittelter knockdown von TRPV2 als auch TRPV2-Inhibition durch IV2-1 oder Valdecoxib reduzierten die PhagozytoseaktivitĂ€t der BMDM auf etwa 70 Prozent im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen. Diese Ergebnisse bestĂ€tigen eine Beteiligung von TRPV2 bei der Phagozytose. AnschlieĂend wurden Transwell-Migrationsassays von BMDM in einem Gradienten aus Lipopolysacchariden (LPS) durchgefĂŒhrt. WĂ€hrend die TRPV2-Inhibiton mit IV2 1, Valdecoxib oder ein TRPV2-knockdown die LPS-induzierte Migration von BMDM signifikant verringerte, steigerte die TRPV2-Aktivierung durch 2-APB/Probenecid die Anzahl migrierter BMDM im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen signifikant. Somit konnte ebenso eine TRPV2-Beteiligung bei der Migration von Makrophagen gezeigt werden. Da Phagozytose und Migration zielgerichtete Prozesse darstellen, sollten auch die Ca2+-Signale rĂ€umlich und zeitlich koordiniert auftreten. Solche lokal begrenzten, kurzen Ca2+-Fluktuationen können durch Ca2+-MikrodomĂ€nen verursacht werden, welche der AktivitĂ€t einzelner oder weniger KanĂ€le entsprechen. Mittels TIRF-Mikroskopie und eines niederaffinen Ca2+-Indikators können hohe Ca2+-Fluktuationen in unmittelbarer NĂ€he zur Zellmembran selektiv detektiert und somit potenzielle durch TRPV2 generierte Ca2+ MikrodomĂ€nen in Makrophagen untersucht werden. Nach der TRPV2-Aktivierung mit 2 APB/Probenecid konnten punktuelle, hohe Ca2+ Fluktuationen in BMDM ermittelt werden, welche nach Zugabe von IV2-1 inhibiert wurden. Unter physiologischeren Bedingungen wurden zudem basal aktive Ca2+ MikrodomĂ€nen beobachtet, welche durch IV2 1 inhibiert wurden. Dementsprechend scheint TRPV2 in BMDM basal aktive Ca2+-MikrodomĂ€nen ausbilden zu können.
Bisher konnte nur die Kombination aus 2-APB und Probenecid in moderaten Konzentrationen genutzt werden, um TRPV2-IonenkanĂ€le ohne zytotoxische Effekte durch hohe Konzentrationen der Einzelsubstanzen zu aktivieren. Allerdings zeigt 2-APB keine Wirkung auf humane TRPV2 KanĂ€le, weshalb neue Möglichkeiten der TRPV2-Aktivierung essentiell sind. Um weitere potenzierende Effekte zu untersuchen, wurde Cannabidiol (CBD) als potentester TRPV2-Aktivator aus der Gruppe der Cannabinoide in Kombination mit Probenecid untersucht. In einer zweidimensionalen Analyse von CBD- und Probenecid-VerdĂŒnnungsreihen konnte eine potenzierende Wirkung der Kombination festgestellt werden, die sowohl humane als auch Ratten TRPV2-KanĂ€le superadditiv aktivierte. Mittels Fluoreszenz-basierten Einzelzell-Analysen sowie elektrophysiologischen Patch-Clamp-Messungen von HEKrTRPV2- und HEKhuTRPV2-Zellen konnte dieser superadditive Effekt von CBD/Probenecid bestĂ€tigt werden. Die CBD/Probenecid-induzierte AktivitĂ€t humaner oder Ratten TRPV2-KanĂ€le konnte durch IV2-1 inhibiert werden, wohingegen Valdecoxib zwar Ratten-TRPV2 blockierte, jedoch humanen TRPV2 nicht vollstĂ€ndig inhibieren konnte.
Mastzellen sind maĂgeblich an der Freisetzung von allergischen und inflammatorischen Mediatoren beteiligt und stellen somit einen wichtigen Bestandteil des angeboren Immunsystems dar. WĂ€hrend die AusschĂŒttung von Leukotrienen, ÎČ-Hexosaminidase oder Histamin gröĂtenteils IgE-vermittelt stattfindet, können davon unabhĂ€ngig auch andere Signalkaskaden, wie z.B. durch MRGPRX2-vermittelt, die Degranulation von Mastzellen induzieren. Da Mastzellen ebenfalls TRPV2-IonenkanĂ€le exprimieren, könnte ein TRPV2-vermittelter Ca2+ Einstrom die Freisetzung von Mediatoren beeinflussen. Mit Hilfe der neuen TRPV2-Modulatoren und Fluoreszenz-basierten Einzelzell-Ca2+-Analysen wurde zunĂ€chst die endogene TRPV2-Expression in basophilen RBL-2H3-Zellen als alternatives Zellmodell zu Mastzellen bestĂ€tigt. Zudem konnten keine zytotoxischen Effekte bis zu Konzentrationen von 50 ”M IV2-1 oder Valdecoxib sowie einer Kombination aus 12.5 ”M CBD und 500 ”M Probenecid festgestellt werden. In Fluoreszenz-basierten Einzelzell-Ca2+-Analysen konnte nach physiologischer Stimulation der FcΔ-Rezeptoren ein Anstieg der intrazellulĂ€ren Ca2+ Konzentration gemessen werden, der durch TRPV2-Inhibition mit IV2-1 oder Valdecoxib nicht blockiert wurde. In Untersuchungen zur Freisetzung von ÎČ-Hexosaminidase steigerte die Kombination CBD/Probenecid die MediatorausschĂŒttung hingegen deutlich. Dieser Effekt konnte durch TRPV2-Inhibition mit IV2-1 oder Valdecoxib inhibiert werden. Eine Kombination des TRPV2-vermittelten sowie des IgE-induzierten Stimulus fĂŒhrte zu einer additiv gesteigerten Freisetzung. Somit könnte TRPV2 unabhĂ€ngig von der IgE-Signalkaskade eine wichtige physiologische Funktion bei der Degranulation von Mastzellen spielen.
Daher wurden im nĂ€chsten Schritt primĂ€re Mastzellen aus dem Knochenmark von MĂ€usen differenziert (BMMC) und die mRNA- sowie funktionelle Expression von TRPV2 durch qPCR und Fluoreszenz-basierte Ca2+-Assays bestĂ€tigt. Die verwendeten Modulatoren induzierten auch in BMMC in gleichen Konzentrationen wie in RBL 2H3-Zellen keine zytotoxischen Effekte. Die vorherigen Ergebnisse des Einflusses der TRPV2-AktivitĂ€t auf die AusschĂŒttung von ÎČ-Hexosaminidase konnten mit BMMC ebenso bestĂ€tigt werden. Mittels ELISA wurde zuletzt ein TRPV2-vermittelter Effekt auf die Histaminfreisetzung aus BMMC untersucht. Demnach steigerte die Kombination CBD/Probenecid die HistaminausschĂŒttung deutlich, was durch TRPV2-Inhibition mit IV2 1 blockiert werden konnte. Auch hier hatte IV2-1 keinen Effekt auf die IgE-induzierte Histaminfreisetzung. Die simultane Stimulation der FcΔ-Rezeptoren und der TRPV2-KanĂ€le resultierte in einer additiv gesteigerten HistaminausschĂŒttung. Folglich scheint TRPV2-AktivitĂ€t die Freisetzung von Mediatoren wie Histamin oder ÎČ-Hexosaminidase unabhĂ€ngig von der klassischen IgE-vermittelten Signalkaskade zu beeinflussen, was TRPV2 zu einer vielversprechenden Zielstruktur zur weiteren Erforschung im pathophysiologischen Kontext von entzĂŒndlichen und allergischen Reaktionen macht
Fluorescent analogs of peptoid-based HDAC inhibitors: Synthesis, biological activity and cellular uptake kinetics
Fluorescent tagging of bioactive molecules is a powerful tool to study cellular uptake kinetics and is considered as an attractive alternative to radioligands. In this study, we developed fluorescent histone deacetylase (HDAC) inhibitors and investigated their biological activity and cellular uptake kinetics. Our approach was to introduce a dansyl group as a fluorophore in the solvent-exposed cap region of the HDAC inhibitor pharmacophore model. Three novel fluorescent HDAC inhibitors were synthesized utilizing efficient submonomer protocols followed by the introduction of a hydroxamic acid or 2-aminoanilide moiety as zinc-binding group. All compounds were tested for their inhibition of selected HDAC isoforms, and docking studies were subsequently performed to rationalize the observed selectivity profiles. All HDAC inhibitors were further screened in proliferation assays in the esophageal adenocarcinoma cell lines OE33 and OE19. Compound 2, 6-((N-(2-(benzylamino)-2-oxoethyl)-5-(dimethylamino)naphthalene)-1-sulfonamido)-N-hydroxyhexanamide, displayed the highest HDAC inhibitory capacity as well as the strongest anti-proliferative activity. Fluorescence microscopy studies revealed that compound 2 showed the fastest uptake kinetic and reached the highest absolute fluorescence intensity of all compounds. Hence, the rapid and increased cellular uptake of 2 might contribute to its potent anti-proliferative properties