Stiffness of Extracellular Matrix Components Modulates the Phenotype of Human Smooth Muscle Cells in Vitro and Allows for the Control of Properties of Engineered Tissues

AbstractSmooth muscle cells (SMCs) play a significant role in the pathogenesis of atherosclerosis. 2D cultures elucidated valuable information about the interaction between SMCs and extracellular matrix (ECM) components. However, 3D constructs better represent the native vascular environment. Furthermore, a limited number of studies addressed the effect of ECM stiffness on SMCs phenotype. We investigated the effect of stiffness of different ECM substrates by modulating their concentrations, including the effect on morphology, proliferation, expression of the contractile protein α-smooth muscle actin (α-SMA) and deposition of collagen type I (Col I) and collagen type III (Col III) proteins. At low concentrations of Col I gels and Col I gels supplemented with 10% fibronectin (Fn), SMCs exhibited non-elongated, ‘hill-and-valley’ shape and large mean cellular area, indicating a hypertrophic morphology, characteristic of the synthetic phenotype. However, with increasing concentration, mean cellular area and proliferation relative to cells cultured in 2D dropped. Whole protein secretion into the culture media and deposition of Col I and Col III generally decreased with increasing stiffness. Moreover, percentage of α-SMA+ SMCs decreased with increasing gel concentration, pointing to a shift towards the synthetic phenotype. Supplementing Col I with 10% Laminin (Ln) maintained higher cellular area and aspect ratio at all gel concentrations and did not change α-SMA expression significantly, compared to Col I alone or Col I + Fn. Overall, these results demonstrate that ECM components and stiffness could provide the tools to modulate the phenotype and function of SMCs in vitro, which allows for the control of properties of engineered tissues

Etude de l'activité de l'enzyme de réparation NucS à l'échelle de la molécule unique

As DNA reparation enzymes are essential to preserve genome integrity, understanding the regulation pathway dynamics is crucial. Pyrococcus Abyssi NucS is a recently discovered nuclease acting on branched DNA substrates with free ssDNA extremities, called flaps. The biochemical characterization of NucS has shown a nanomolar affinity for both 5' and 3' flaps with the existence of two DNA binding sites (site I and II) as well as a bidirectional activity characterized by the ability to cleave both 5 'and 3 ' flaps. The mechanisms that are responsible for this activity, particularly its association and dissociation modalities, however, remain poorly understood. In order to probe the dynamics of NucS interactions with its substrate, we set up a total internal reflection fluorescence microscope that allows the detection and tracking of single interaction events between fluorescently labeled NucS and DNA substrates tethered to a glass surface. Using Quantum dots, we furthermore developed a new colocalization technique based on multilateration that allows for drift correction and colocalization with an accuracy of 50 nm. In our experiments, we investigated the association and dissociation kinetics of the protein-DNA complex and studied the mechanism that regulates the activity of the NucS at different conditions. First, we report a bidirectional and oriented binding on 3' and 5' flaps and reveal that NucS/DNA dissociation follows a mechanism that is not dependent on NucS diffusion on ssDNA towards the junction but rather by the NucS/ssDNA energy landscape. We moreover demonstrated a central role of salt concentration in the modulation of NucS/DNA interactions. Second, we show that the dissociation mechanism follows single step process with one rate limiting dissociation constant and conclude that NucS can stochastically unbind its substrate in non cleavage conditions at 23 ◦ C. Thereafter, we studied the association and dissociation kinetics of the NucS-DNA complex at 45 ◦ Cin the presence of the repair cofactor PCNA. We demonstrated that PCNA increases the NucS association rate for 3 'and 5' substrates. This indicates that PCNA acts as a platform that facilitates the recognition of the lesion and the specific loading of NucS at the junction. In addition, we showed that PCNA destabilizes the NucS-DNA complex, presumably by exerting a force to bend the DNA in order to load the flap extremity into the active site II. In the case of 5' flaps, we have shown that the dissociation follows a two-step mechanism, which is independent of the flap length. We thus proposed a model where NucS binds its substrate directly at the junction thanks to its site I and then threads the free extremity of the flap into site II for cleavage with the help of PCNA that enables substrate bending. In this model, the observed dissociation kinetics may be due to the dissociation of the two independent binding sites. We also showed that the dissociation of NucS on 3' flaps follows a first-order dissociation process which might be due to the speed of the second step in the proposed mechanism for 5' flaps. Altogether, our results constitute a notable contribution to the characterization of the DNA-NucS interactionsand to thenucleotide excision repair mechanism more generally. The methods we developed furthermore constitute an original way to probe DNA/protein intramolecular kinetics.Les enzymes de réparation de l'ADN sont des facteurs essentiels pour assurer l'intégrité du génome. Ainsi, la compréhension de la dynamique de leurs mécanismes d'interaction est capitale. NucS est une nucléase récemment découverte chez l'archée Pyrococcus abyssi, qui interagit avec des structures branchées de l'ADN à simple brin libre, appelées flaps. Sa caractérisation biochimique a mis en évidence une affinité nanomolaire pour l'ADN simple brin, avec l'existence de deux sites de liaison (site I et II) ainsi qu'une activité bidirectionnelle caractérisée par la capacité à cliver les flaps 5' et 3'. Les mécanismes qui sont à l'origine de cette activité, notamment ses modalités de chargement, de localisation et de dissociation, restent toutefois peu connus. Afin de sonder la dynamique des interactions de NucS avec son substrat, nous avons mis en place un microscope à illumination en onde évanescente permettant la détection et le suivi des événements d'interaction individuels entre la protéine marquée avec un fluorophore et un substrat d'ADN attaché à la surface. Nous avons ensuite développé une nouvelle technique de colocalisation qui permet de positionner une protéine individuelle par rapport à son substrat avec une précision de 50 nm pour des durées arbitraires. Nous avons alors étudié la cinétique d'association et de dissociation des complexes NucS-ADN individuels afin de résoudre les mécanismes qui régulent l'activité de l'enzyme dans différentes conditions. Dans des conditions où le clivage est inhibé, nous avons montré que l'association était dépendante du site I, bidirectionnelle et symétrique pour les flaps 3' et 5' et que la dissociation était orientée avec une affinité supérieure pour les flap 5'. Nous avons également montré que la dissociation suivait une cinétique du premier ordre indépendante de la diffusion de NucS sur le flap. Ceci indique que, dans ces conditions non clivantes, NucS s'associe et/ou se dissocie à des positions arbitraires sur le flap. Par la suite, nous avons étudié la cinétique d'association et de dissociation du complexe NucS-ADN à 45 ◦ C en présence du cofacteur de la réparation PCNA. Nous avons démontré que PCNA augmente la vitesse d'association de NucS avec les substrats 3' et 5'. Ceci indique que PCNA agit comme une plateforme qui facilite la reconnaissance de la lésion, avec un chargement ciblé de NucS à la jonction. De plus, nous avons montré que PCNA déstabilise le complexe NucS-ADN, vraisemblablement en exerçant une force pour plier l'ADN afin d'amener l'extrémité du flap vers le site II. Dans le cas de flaps 5', nous avons montré que la dissociation suit un mécanisme en deux étapes, qui est indépendant de la longueur du flap. Ceci nous a permis de proposer un modèle où NucS se charge par son site I directement à la jonction, courbe le substrat pour capturer l'extrémité simple brin par le site II pour le cliver. Dans le cas d'un flap 3', nous avons montré que la dissociation suit un mécanisme du premier ordre ce qui est probablement dû à la rapidité de la seconde étape dans le mécanisme proposé pour les flaps 5'. Nos résultats constituent ainsi une nouvelle contribution à la caractérisation intramoléculaire des interactions NucS-ADN. Les méthodes que nous avons développées constituent en outre un moyen original pour sonder la cinétique des interactions entre biomolécules et pourront être appliquées à de multiples systèmes

Etude de l'activité de l'enzyme de réparation NucS à l'échelle de la molécule unique

Les enzymes de réparation de l'ADN sont des facteurs essentiels pour assurer l'intégrité du génome. Ainsi, la compréhension de la dynamique de leurs mécanismes d'interaction est capitale. NucS est une nucléase récemment découverte chez l'archée Pyrococcus abyssi, qui interagit avec des structures branchées de l'ADN à simple brin libre, appelées aps. Sa caractérisation biochimique a mis en évidence une a nité nanomolaire pour l'ADN simple brin, avec l'existence de deux sites de liaison (site I et II) ainsi qu'une activité bidirectionnelle caractérisée par la capacité à cliver les aps 5' et 3'. Les mécanismes qui sont à l'origine de cette activité, notamment ses modalités de chargement, de localisation et de dissociation, restent toutefois peu connus. A n de sonder la dynamique des interactions de NucS avec son substrat, nous avons mis en place un microscope à illumination en onde évanescente permettant la détection et le suivi des événements d'interaction individuels entre la protéine marquée avec un uorophore et un substrat d'ADN attaché à la surface. Nous avons ensuite développé une nouvelle technique de colocalisation qui permet de positionner une protéine individuelle par rapport à son substrat avec une précision de 50 nm pour des durées arbitraires. Nous avons alors étudié la cinétique d'association et de dissociation des complexes NucS-ADN individuels a n de résoudre les mécanismes qui régulent l'activité de l'enzyme dans di érentes conditions. Dans des conditions où le clivage est inhibé, nous avons montré que l'association était dépendante du site I, bidirectionnelle et symétrique pour les aps 3' et 5' et que la dissociation était orientée avec une a nité supérieure pour les ap 5'. Nous avons également montré que la dissociation suivait une cinétique du premier ordre indépendante de la di usion de NucS sur le ap. Ceci indique que, dans ces conditions non clivantes, NucS s'associe et/ou se dissocie à des positions arbitraires sur le ap. Par la suite, nous avons étudié la cinétique d'association et de dissociation du complexe NucS-ADN à 45 C en présence du cofacteur de la réparation PCNA. Nous avons démontré que PCNA augmente la vitesse d'association de NucS avec les substrats 3' et 5'. Ceci indique que PCNA agit comme une plateforme qui facilite la reconnaissance de la lésion, avec un chargement ciblé de NucS à la jonction. De plus, nous avons montré que PCNA déstabilise le complexe NucS-ADN, vraisemblablement en exerçant une force pour plier l'ADN a n d'amener l'extrémité du ap vers le site II. Dans le cas de aps 5', nous avons montré que la dissociation suit un mécanisme en deux étapes, qui est indépendant de la longueur du ap. Ceci nous a permis de proposer un modèle où NucS se charge par son site I directement à la jonction, courbe le substrat pour capturer l'extrémité simple brin par le site II pour le cliver. Dans le cas d'un ap 3', nous avons montré que la dissociation suit un mécanisme du premier ordre ce qui est probablement dû à la rapidité de la seconde étape dans le mécanisme proposé pour les aps 5'. Nos résultats constituent ainsi une nouvelle contribution à la caractérisation intramoléculaire des interactions NucS-ADN. Les méthodes que nous avons développées constituent en outre un moyen original pour sonder la cinétique des interactions entre biomolécules et pourront être appliquées à de multiples systèmes.As DNA reparation enzymes are essential to preserve genome integrity, understanding the regulation pathway dynamics is crucial. Pyrococcus Abyssi NucS is a recently discovered nuclease acting on branched DNA substrates with free ssDNA extremities, called aps. The biochemical characterization of NucS has shown a nanomolar a nity for both 5' and 3' aps with the existence of two DNA binding sites (site I and II) as well as a bidirectional activity characterized by the ability to cleave both 5 'and 3 ' aps. The mechanisms that are responsible for this activity, particularly its association and dissociation modalities, however, remain poorly understood. In order to probe the dynamics of NucS interactions with its substrate, we set up a total internal re ection uorescence microscope that allows the detection and tracking of single interaction events between uorescently labeled NucS and DNA substrates tethered to a glass surface. Using Quantum dots, we furthermore developed a new colocalization technique based on multilateration that allows for drift correction and colocalization with an accuracy of 50 nm. In our experiments, we investigated the association and dissociation kinetics of the protein-DNA complex and studied the mechanism that regulates the activity of the NucS at di erent conditions. First, we report a bidirectional and oriented binding on 3' and 5' aps and reveal that NucS/DNA dissociation follows a mechanism that is not dependent on NucS di usion on ssDNA towards the junction but rather by the NucS/ssDNA energy landscape. We moreover demonstrated a central role of salt concentration in the modulation of NucS/DNA interactions. Second, we show that the dissociation mechanism follows single step process with one rate limiting dissociation constant and conclude that NucS can stochastically unbind its substrate in non cleavage conditions at 23 C. Thereafter, we studied the association and dissociation kinetics of the NucS-DNA complex at 45 Cin the presence of the repair cofactor PCNA. We demonstrated that PCNA increases the NucS association rate for 3 'and 5' substrates. This indicates that PCNA acts as a platform that facilitates the recognition of the lesion and the speci c loading of NucS at the junction. In addition, we showed that PCNA destabilizes the NucS-DNA complex, presumably by exerting a force to bend the DNA in order to load the ap extremity into the active site II. In the case of 5' aps, we have shown that the dissociation follows a two-step mechanism, which is independent of the ap length. We thus proposed a model where NucS binds its substrate directly at the junction thanks to its site I and then threads the free extremity of the ap into site II for cleavage with the help of PCNA that enables substrate bending. In this model, the observed dissociation kinetics may be due to the dissociation of the two independent binding sites. We also showed that the dissociation of NucS on 3' aps follows a rst-order dissociation process which might be due to the speed of the second step in the proposed mechanism for 5' aps. Altogether, our results constitute a notable contribution to the characterization of the DNA-NucS interactionsand to thenucleotide excision repair mechanism more generally. The methods we developed furthermore constitute an original way to probe DNA/protein intramolecular kinetics.PALAISEAU-Polytechnique (914772301) / SudocSudocFranceF

Analyse théorique du comportement mécanique d'une poutre sandwich NIDA en flexion 3 points

Ce travail présente une étude théorique du comportement mécanique des poutres sandwiches dont le cœur est en nid d'abeilles (NIDA) soumises à un essai de flexion 3 points. Les poutres étudiées sont obtenues à partir de plaques sandwiches destinées à la fabrication de bateaux de plaisance. Deux types de poutres sandwichs sont utilisés. Chaque poutre est composée de deux peaux symétriques dont les fibres sont en verres disposées en mat pour la poutre 1 et en plis croisés pour la poutre 2. L'âme est constituée de feuilles de polyéthylène dont les cellules sont de forme hexagonale. Les modules d'Young longitudinal et transversal des peaux sont obtenus expérimentalement par essai de traction, ils servent au calcul des contraintes normales et de cisaillement. L'effet de la cinématique, de l'élancement (rapport de la longueur de la poutre sandwich par son épaisseur totale), $\frac{L}{h}$, du rapport de l'épaisseur de l'âme par celle de la peau, et de l'effet du rapport du module d'Young longitudinal de la peau Ep par celui de l'âme Ea sur les contraintes normales et de cisaillement sont analysés. Les résultats des contraintes normales et de cisaillement pour trois champs de déplacement différents sont comparés. La différence des résultats justifie les conditions d'utilisation des théories simplifiées de Bernoulli et celle de Timoshenko pour ces types de poutres sandwiches

A New Nitrogen and Potassium Fertilization Management Program for Clementine Mandarin under Mediterranean Climate

Leaf analysis is a useful tool to evaluate the nutrient status of citrus trees, but diagnosis standards for ‘Clementine mandarin’ are not available. Thus, a three-year (2005-2007) field experiment was conducted in North East Tunisia with 25 years old ‘Clementine mandarin’ trees (Citrus reticulata Osbeck) on ‘Sour orange’ (Citrus aurantium Osbeck) rootstock; grown on a sandy soil (loamy mixed thermic mollic xerofluvent); to establish leaf nutrient (N and K) concentration standards for optimum fruit production and Quality. Nitrogen and potassium rates from 160 to 232 kg ha-1yr-1 and 200 to 290 kg ha-1yr-1, respectively, were applied through a drip irrigation system. Irrigation was scheduled based on tensiometer readings at the root zone. Fruit yield was significantly correlated with N (r2=0.91) and K (r2=0.84) rates; it was also correlated with leaf N concentrations (r2=0.92). These findings indicate that 192 and 200 kg ha-1yr-1 of N and K2O, respectively, are needed to support optimal fruit yield of 43 Mg ha-1yr-1 and optimum fruit quality. At 90% of maximum relative fruit yield, leaf N and K concentrations were 27 to 29 and 10 to 12 g kg-1, respectively. These leaf nutrient concentration ranges could be recommended as optimum levels of N and K for ‘Clementine mandarin’ grown under similar Mediterranean conditions to those of this work.Keywords: Leaf nutritional status; optimum fruit yield; Clementine mandarin; Mediterranean conditions; fruit quality

A New Nitrogen and Potassium Fertilization Management Program for Clementine Mandarin under Mediterranean Climate

Leaf analysis is a useful tool to evaluate the nutrient status of citrus trees, but diagnosis standards for ‘Clementine mandarin’ are not available. Thus, a three-year (2005-2007) field experiment was conducted in North East Tunisia with 25 years old ‘Clementine mandarin’ trees (Citrus reticulata Osbeck) on ‘Sour orange’ (Citrus aurantium Osbeck) rootstock; grown on a sandy soil (loamy mixed thermic mollic xerofluvent); to establish leaf nutrient (N and K) concentration standards for optimum fruit production and Quality. Nitrogen and potassium rates from 160 to 232 kg ha-1yr-1 and 200 to 290 kg ha-1yr-1, respectively, were applied through a drip irrigation system. Irrigation was scheduled based on tensiometer readings at the root zone. Fruit yield was significantly correlated with N (r2=0.91) and K (r2=0.84) rates; it was also correlated with leaf N concentrations (r2=0.92). These findings indicate that 192 and 200 kg ha-1yr-1 of N and K2O, respectively, are needed to support optimal fruit yield of 43 Mg ha-1yr-1 and optimum fruit quality. At 90% of maximum relative fruit yield, leaf N and K concentrations were 27 to 29 and 10 to 12 g kg-1, respectively. These leaf nutrient concentration ranges could be recommended as optimum levels of N and K for ‘Clementine mandarin’ grown under similar Mediterranean conditions to those of this work.Keywords: Leaf nutritional status; optimum fruit yield; Clementine mandarin; Mediterranean conditions; fruit quality

Dimethyl sulfoxide reduces the stability but enhances catalytic activity of the main SARS-CoV-2 protease 3CLpro

Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) is responsible for coronavirus disease 2019 (COVID-19), one of the most challenging global pandemics of the modern era. Potential treatment strategies against COVID-19 are yet to be devised. It is crucial that antivirals that interfere with the SARS-CoV-2 life cycle be identified and developed. 3-Chymotrypsin-like protease (3CLpro) is an attractive antiviral drug target against SARS-CoV-2, and coronaviruses in general, because of its role in the processing of viral polyproteins. Inhibitors of 3CLpro activity are screened in enzyme assays before further development of the most promising leads. Dimethyl sulfoxide (DMSO) is a common additive used in such assays and enhances the solubility of assay components. However, it may also potentially affect the stability and efficiency of 3CLpro but, to date, this effect had not been analyzed in detail. Here, we investigated the effect of DMSO on 3CLpro-catalyzed reaction. While DMSO (5%-20%) decreased the optimum temperature of catalysis and thermodynamic stability of 3CLpro, it only marginally affected the kinetic stability of the enzyme. Increasing the DMSO concentration up to 20% improved the catalytic efficiency and peptide-binding affinity of 3CLpro. At such high DMSO concentration, the solubility and stability of peptide substrate were improved because of reduced aggregation. In conclusion, we recommend 20% DMSO as the minimum concentration to be used in screens of 3CLpro inhibitors as lead compounds for the development of antiviral drugs against COVID-19