Identificación de microorganismos endógenos en cicadélidos y endófitos asociados a la crespera del café en el Valle Central occidental de Costa Rica.

Proyecto de Graduación (Bachillerato en Ingeniería en Biotecnología). Instituto Tecnológico de Costa Rica, Escuela de Biología, 2008.Identificación de microorganismos asociados a Crespera del Café. Se muestrearon hojas de bandolas intermedias de plantas sintomáticas para la enfermedad “Crespera del Café” e insectos cicadélidos de campo a partir de una finca infectada ubicada en Naranjo de Alajuela del Valle Central Occidental de Costa Rica. Las muestras de plantas se procesaron mediante tres protocolos de aislamientos de endófitos: A: desinfección con NaClO4 al 10 (T1), 15 (T2) y 20% (T3), incubación a 31ºC; B: desinfección con NaClO4 1% 3,5% i.a (T1) y NaClO4 100% 1,0% i.a (T2) incubándose a 24ºC y C: desinfección con NaClO4 1% y extracción con buffer PBS en dilución concentrada (T1), 10-1 (T2) y 10-2 (T3) incubación a 26ºC. Los insectos se procesaron bajo un protocolo D: desinfección con Cloruro de Benzalconio al 2% de cabezas maceradas en 300ųl del buffer PBS 1X (T1) y cuerpos sin disección en 600ųl del buffer (T2)incubándose a 26ºC. Se inocularon todos los aislamientos en medio BCYE. Las bacterias se identificaron mediante el sistema BIOLOG, DAS-ELISA y validación de algunas muestras para detección de Xylella fastidiosa mediante PCR utilizando los primers 272-1 y 272-2; los aislamientos fúngicos se identificaron mediante la presencia de estructuras de reproducción. El protocolo C mostró ser el más apto para la obtención de endófitos y el D permitió obtener alta diversidad en los aislamientos. Se obtuvieron 21 aislamientos bacterianos siendo el más abundante Serratia marcenses seguido de Raoultella terrigena, Xylella fastidiosa y Enterobacter sp; 13 aislamientos fúngicos incluyendo los géneros Aspergillus, Cladosporium, Paecilomyces, Beauberia y Pythium. La temperatura de 28ºC, y la incubación en oscuridad en medio BCYE por los 22 días permitió aislar Xylella fastidiosa. No hay certeza que los resultados obtenidos en la prueba serológica DAS-ELISA correspondieron a deficiencias de sensibilidad de la misma salvo un aislamiento (Serratia marcenses). Evaluación de la patogenicidad de los aislamientos. Se aplicaron pruebas en disco de hoja, tronco de café y con segmentos de pellets sobre láminas enteras para medir la patogenicidad cualitativa de los aislamientos inoculando soluciones de 2.0X107 UFC/ml homogenizadas. La acumulación de cristales foliares ante la presencia de Geobacillus spp y Staphylococcus cohnii, y la proliferación de Pythium spp en las hojas, permitió discriminar su patogenicidad cualitativa. Bioensayos de microorganismos seleccionados para su correspondencia con la sintomatología de Crespera del Café. El cicadélido C07 (más abundantes en campo) mostró ser un vector eficiente para la transmisión de Xylella fastidiosa. Generalmente las poblaciones más abundantes de cicadélidos colectados presentaron las concentraciones más altas de Xylella fastidiosa. El método de inoculación en pecíolos mostró mayor eficiencia (96.7%) para incorporar a Xylella fastidiosa que el método de puntura en entrenudo (66.7%). El periodo de observación de posibles síntomas de Crespera en los bioensayos con Xylella fastidiosa, Geobacillus spp y Pseudomonas fluorescens se consideró insuficiente. Se realizaron ensayos de infección con cicadélidos de campo sobre plantas de invernadero en condiciones de 23ºC y 70% de humedad relativa por 15 días y se corroboró la incidencia del patógeno en los insectos luego del ensayo, así como la infección de Xylella fastidiosa mediante DAS-ELISA luego de 3 meses en las hojas jóvenes y maduras. Se emplearon dos métodos de infección mecánica para Xylella fastidiosa, Geobacillus sp y Pseudomonas fluorescens buscando reproducir los síntomas de Crespera. Se corroboró mediante DAS-ELISA la infección de Xylella fastidiosa luego de 3 meses de ensayo en hojas inoculadas y no inoculadas. En ambos ensayos de infección se utilizaron plantas de invernadero de dos meses de edad libres de Xylella fastidiosa. Se buscó relacionar los microorganismos endógenos en cicadélidos con los endófitos en plantas de café y la sintomatología de Crespera

Callogenesis and cell suspension establishment of tropical highland blackberry (Rubus adenotrichos Schltdl.) and its microscopic analysis

Artículo científicoBlackberries are fruits produced worldwide, with 25 % of their production centered in Mexico, Central and South America. Tropical highland blackberry is a fruit that can potentially enhance human health, due to their high content in phenolic compounds, which include anthocyanins, phenolic acids, tannins (gallotannins and elagitannins) and flavonoids. Therefore, the overall aim of this study is the development of a callus induction protocol, the establishment of blackberry cell suspensions (Rubus adenotrichos Schltdl.) and their cell analysis through optical microscopy and TEM, for the potential production of phenolic compounds. In order to produce callogenesis, segments of blackberry leaves were disinfected and placed in different concentrations of 2,4-D and the control media (0; 0.5; 1.0; 1.5; 2.0; 2.5 and 3.0 mg/l of 2,4-D); obtaining the higher size of calli in the medium with 1.5 mg/l of 2,4-D. After this determination, and for this specific treatment, a growth curve was performed through the use of fresh and dry weight parameters, in order to identify each of the growth stages. Furthermore, the calli obtained from the 1.5 mg/l of 2,4-D treatment were placed in two different culture media (MS and MS supplemented with 1.5 mg/l of 2,4-D) in order to establish the cell suspensions and the growth curve. To the best treatment, the total polyphenols were also quantified. It was determined that the MS medium is ideal for the growth and disintegration of the cell suspensions, obtaining 0.0256 mg of gallic acid/g of fresh sample. Finally, a cell callus and cell suspension analysis was performed through OM and TEM, evidencing a higher hystological differentiation in the calli, as well as the observation of antioxidant storage in the plastids

Quince (Cydonia oblonga) in vitro plant root formation through an automated temporary inmersion system, and its acclimation

Artículo científicoQuince (Cydonia oblonga) is a non-traditional fruit tree found in Costa Rica that has therapeutic and nutritional properties; however its slow growth and root formation prevents the production of a homogeneous population when using conventional farming techniques. Hence, the aim of this research project was to generate uniform plant material in a reduced time span using a temporary immersion bioreactor system (RITAS ®). A semisolid rooting MS culture medium supplemented with 0.1 mg L-1 NAA; 0.3 mg L-1 IBA and 3% sucrose (pH 6.5), developed in the Centro de Investigación en Biotecnología (CIB), Instituto Tecnológico de Costa Rica (ITCR), in Cartago, was used as a reference medium. Four different variations in the sucrose concentration (1%, 2%, 3%, and 4%) were performed in liquid medium. Each trial was evaluated with in vitro plants which had been previously exposed to the culture medium of the corresponding treatments, in a stationary mode and for a 15 day long period, and with in vitro plants without any previous treatment (a total of eight treatments). The comparison of the root formation percentages evidenced the clear effect of sucrose concentration used, with the best results obtained when using the 2% sucrose trial with no pre-treatment (73.3%). The in vitro plants were acclimated in cylinders made out of peat, have previously been disinfected with fungicide, and placed in a humidity chamber at a 20.5°C average temperature and a 75,5% relative humidity for the establishment of weekly fertilizing cycles. The acclimation process generated an 80% survival rate, since several seedlings experienced stem strangulation caused by a fungal attack. The conidiophores identified through optical and scanning electron microscopy evidenced the presence of Cladosporium spp., which was controlled with carbendazim and iprodione fungicides

RNAi Crop Protection Advances

RNAi technology is a versatile, effective, safe, and eco-friendly alternative for crop protection. There is plenty of evidence of its use through host-induced gene silencing (HIGS) and emerging evidence that spray-induced gene silencing (SIGS) techniques can work as well to control viruses, bacteria, fungi, insects, and nematodes. For SIGS, its most significant challenge is achieving stability and avoiding premature degradation of RNAi in the environment or during its absorption by the target organism. One alternative is encapsulation in liposomes, virus-like particles, polyplex nanoparticles, and bioclay, which can be obtained through the recombinant production of RNAi in vectors, transgenesis, and micro/nanoencapsulation. The materials must be safe, biodegradable, and stable in multiple chemical environments, favoring the controlled release of RNAi. Most of the current research on encapsulated RNAi focuses primarily on oral delivery to control insects by silencing essential genes. The regulation of RNAi technology focuses on risk assessment using different approaches; however, this technology has positive economic, environmental, and human health implications for its use in agriculture. The emergence of alternatives combining RNAi gene silencing with the induction of resistance in crops by elicitation and metabolic control is expected, as well as multiple silencing and biotechnological optimization of its large-scale production

Optimización de las condiciones de crecimiento de la bacteria endófita Klebsiella oxytoca en matraz y en biorreactor

Endophytic bacteria are characterized for living within plant cells and tissue without causing any harm to the plants. Klebsiella oxytoca is an endophyte that promotes plant growth and also has a bio-controlling effect; therefore, the objective of the current study is to determine the optimal growth conditions, in flask culture as well as in a bioreactor, for this bacteria collected from previous studies performed on fig plants (Ficus carica). To achieve this, biomass growth of K. oxytoca flask cultured in nutritive broth was assessed under different agitation and temperature conditions, and it was determined that 200 rpm and 30 °C produced the highest biomass yield. On the other hand, using a broth culture in a 3.7 L bioreactor, it was established that 500 rpm presents higher KLa values and a shorter fermentation time than when using an agitation speed of 750 rpm. Additionally, under an agitation speed of 500 rpm, the use of culture media based on agro-industrial residues can provide an alternate source of energy for this microorganism. Finally, the treatment using culture broth at 500 rpm was modeled using a logistic model and Pirt’s equation, resulting in both cases, on a coefficient of determination higher than 0.95. Las bacterias endófitas son aquellas que viven en el interior de las células o los tejidos de plantas superiores sin causar daño. Klebsiella oxytoca es una bacteria endófita promotora del crecimiento vegetal y con efecto biocontrolador, razón por la cual, el objetivo del presente estudio fue determinar las condiciones óptimas de crecimiento de esta bacteria, en matraz y en biorreactor, obtenida de plantas de higo (Ficus carica) en estudios anteriores. Para esto, se evaluó el crecimiento de la biomasa de K. oxytoca en caldo nutritivo bajo diferentes condiciones de agitación y temperatura en matraz, determinando que las condiciones a 200 rpm y 30 °C fueron las que produjeron una mayor biomasa. Posteriormente, utilizando medio caldo nutritivo en el biorreactor de 3,7 L, se determinó que una agitación de 500 rpm presenta valores de KLa más altos y tiempos de fermentación menores que si se trabaja a 750 rpm. Además, bajo una agitación de 500 rpm, se determinó que medios basados en residuos agroindustriales pueden funcionar como fuentes de crecimiento alternativas para este microorganismo. Por último, el tratamiento de caldo nutritivo a 500 rpm fue modelado mediante el modelo logístico y la ecuación de Pirt, obteniendo, en ambos casos, coeficientes de determinación superiores a 0,95.

Pectin Microspheres: Synthesis Methods, Properties, and Their Multidisciplinary Applications

There is great contemporary interest in using cleaner technologies through green chemistry and utilizing biopolymers as raw material. Pectin is found on plant cell walls, and it is commonly extracted from fruit shells, mostly apples or citrus fruits. Pectin has applications in many areas of commercial relevance; for this reason, it is possible to find available information about novel methods to transform pectin and pursuing enhanced features, with the structuring of biopolymer microspheres being highly cited to enhance its activity. The structuring of polymers is a technique that has been growing in recent decades, due to its potential for diverse applications in various fields of science and technology. Several techniques are used for the synthesis of microspheres, such as ionotropic gelation, extrusion, aerosol drying, or emulsions, with the latter being the most commonly used method based on its reproducibility and simplicity. The most cited applications are in drug delivery, especially for the treatment of colon diseases and digestive-tract-related issues. In the industrial field, it is used for protecting encapsulated compounds; moreover, the environmental applications mainly include the bioremediation of toxic substances. However, there are still many possibilities for expanding the use of this biopolymer in the environmental field

Pectin Microspheres: Synthesis Methods, Properties, and Their Multidisciplinary Applications

There is great contemporary interest in using cleaner technologies through green chemistry and utilizing biopolymers as raw material. Pectin is found on plant cell walls, and it is commonly extracted from fruit shells, mostly apples or citrus fruits. Pectin has applications in many areas of commercial relevance; for this reason, it is possible to find available information about novel methods to transform pectin and pursuing enhanced features, with the structuring of biopolymer microspheres being highly cited to enhance its activity. The structuring of polymers is a technique that has been growing in recent decades, due to its potential for diverse applications in various fields of science and technology. Several techniques are used for the synthesis of microspheres, such as ionotropic gelation, extrusion, aerosol drying, or emulsions, with the latter being the most commonly used method based on its reproducibility and simplicity. The most cited applications are in drug delivery, especially for the treatment of colon diseases and digestive-tract-related issues. In the industrial field, it is used for protecting encapsulated compounds; moreover, the environmental applications mainly include the bioremediation of toxic substances. However, there are still many possibilities for expanding the use of this biopolymer in the environmental field

Cultivo de tejidos en Ficus carica con miniestacas

Este ensayo se llevó a cabo en el CeCentro de Investigación en Biotecnología, del Instituto Tecnológico de Costa RiRica, CaCartago, Costa RiRica, entre los años 2006-2008. Tuvo como objetivo evaluar el cultivo in vitro del higo. Para el establecimieiento del materiaial vegetal in vitro se utilizaron minieiestacas de 3 cm, de longitud provenieientes de materiaial propapagado vegetativamente. Para su desinfección se lavaron y se sumergieieron en una solución de 6 g/l de benomilo (50 % i.a.), 6 g/l de sulfato de gentamicina (2 % i.a.) y de clorhidrato de oxitetraciclina (6 % i.a.) y 3,5 g/l de dimetiltiocarbamato (76 % i.a.) durante 90 minutos. Luego se reaealizó una segunda desinfección con hipipoclorito de calcio al 3,5 % p/v durante 10 minutos. SeSe inocularon en un medio M-S (1962) completo, más 1mg/l de BAP, 300 mg/l de acido ascórbico y 175 mg/l de ciprofloxacina. En la etapa de multiplicación se separaron los brotes desarrollados, se inocularon y se empleó como medio base M-S (1962) completo, suplementado con 1,0; 0,5 y 0 mg/l de BAP. Para la etapa de enraiaizamieiento, se implementaron dos tratamieientos, M-S (1962) completo con 0,5 y 0 mg/l de AIAIB. SeSe obtuvo un 31,67 % de supepervivenciaia y asepepsiaia del materiaial en la etapaapaapa de introducción y un promedio de tres brotes por explante al mes de incubación. El mayor promedio de brotes por explante se logró en el tratamieiento con 1,0 mg/l de BAP y el mayor porcentaje de enraiaizamieiento se obtuvo en el tratamieiento sin regulador. Durante la fase de aclimatación, se logró un 100 % de supepervivenciaia

Detección del virus del enanismo amarillo de la cebolla (OYDV) y el virus latente común del ajo (GCLV) en ajo (Allium sativum L) costarricense

Las enfermedades virales son responsables de pérdidas importantes en el rendimiento del cultivo de ajo alrededor del mundo, ya que limitan su producción. En esta investigación se analizó material de ajo costarricense para determinar la incidencia de los virus: Garlic Common Latent Virus (GCLV) y Onion Yellow Dwarf Virus (OYDV), mediante la técnica DAS-ELISA, con el fin de conocer el estado fitosanitario del material criollo. Se utilizaron bulbos de campo de apariencia normal (N), normales con túnica amarilla (TA) y con deformaciones (D); y hojas de campo normales (N), sintomáticas (S) y con presencia de posibles vectores  virales (VT). Se analizaron vitroplantas producto de la introducción de ápices de 1,0 y 0,5cm de longitud procedentes de dientes normales (N) y con túnica amarilla (TA); así como dos lotes de bulbillos obtenidos in vitro de introducciones de ápices de 1,0cm de largo a partir de bulbos de apariencia normal. Se encontró que el 33% de los bulbos de campo analizados para GCLV fueron positivos (TA), mientras que OYDV se detectó en el 100%, sin importar la apariencia. El 100% de las hojas fue positivo para GCLV, y para OYDV soloaquellas de apariencia normal (33%). El 100% de las vitroplantas no presentaron infección de GCLV, mientras que para OYDV solo las introducidas de ápices de 1,0cm provenientes de bulbos con túnica amarillenta no mostraron incidencia. Se determinó GCLV en el 100% de lasmuestras para ambos lotes de bulbificación in Vitro, y OYDV solo en el 50%. Se concluye que los virus OYDV y GCLV están presentes en el ajo costarricense y se detectaron mediante la técnica DASELISA, con una alta incidencia en el material local y con infección diferencial según el órgano analizado. Se recomienda combinar diversas metodologías junto con el cultivo de ápices in vitro, para obtener mayor eficacia en la limpieza viral, lo que contribuiría a incrementar el valor y potenciar el cultivo de la semilla local