Identificación de microorganismos endógenos en cicadélidos y endófitos asociados a la crespera del café en el Valle Central occidental de Costa Rica.

Abstract

Proyecto de Graduación (Bachillerato en Ingeniería en Biotecnología). Instituto Tecnológico de Costa Rica, Escuela de Biología, 2008.Identificación de microorganismos asociados a Crespera del Café. Se muestrearon hojas de bandolas intermedias de plantas sintomáticas para la enfermedad “Crespera del Café” e insectos cicadélidos de campo a partir de una finca infectada ubicada en Naranjo de Alajuela del Valle Central Occidental de Costa Rica. Las muestras de plantas se procesaron mediante tres protocolos de aislamientos de endófitos: A: desinfección con NaClO4 al 10 (T1), 15 (T2) y 20% (T3), incubación a 31ºC; B: desinfección con NaClO4 1% 3,5% i.a (T1) y NaClO4 100% 1,0% i.a (T2) incubándose a 24ºC y C: desinfección con NaClO4 1% y extracción con buffer PBS en dilución concentrada (T1), 10-1 (T2) y 10-2 (T3) incubación a 26ºC. Los insectos se procesaron bajo un protocolo D: desinfección con Cloruro de Benzalconio al 2% de cabezas maceradas en 300ųl del buffer PBS 1X (T1) y cuerpos sin disección en 600ųl del buffer (T2)incubándose a 26ºC. Se inocularon todos los aislamientos en medio BCYE. Las bacterias se identificaron mediante el sistema BIOLOG, DAS-ELISA y validación de algunas muestras para detección de Xylella fastidiosa mediante PCR utilizando los primers 272-1 y 272-2; los aislamientos fúngicos se identificaron mediante la presencia de estructuras de reproducción. El protocolo C mostró ser el más apto para la obtención de endófitos y el D permitió obtener alta diversidad en los aislamientos. Se obtuvieron 21 aislamientos bacterianos siendo el más abundante Serratia marcenses seguido de Raoultella terrigena, Xylella fastidiosa y Enterobacter sp; 13 aislamientos fúngicos incluyendo los géneros Aspergillus, Cladosporium, Paecilomyces, Beauberia y Pythium. La temperatura de 28ºC, y la incubación en oscuridad en medio BCYE por los 22 días permitió aislar Xylella fastidiosa. No hay certeza que los resultados obtenidos en la prueba serológica DAS-ELISA correspondieron a deficiencias de sensibilidad de la misma salvo un aislamiento (Serratia marcenses). Evaluación de la patogenicidad de los aislamientos. Se aplicaron pruebas en disco de hoja, tronco de café y con segmentos de pellets sobre láminas enteras para medir la patogenicidad cualitativa de los aislamientos inoculando soluciones de 2.0X107 UFC/ml homogenizadas. La acumulación de cristales foliares ante la presencia de Geobacillus spp y Staphylococcus cohnii, y la proliferación de Pythium spp en las hojas, permitió discriminar su patogenicidad cualitativa. Bioensayos de microorganismos seleccionados para su correspondencia con la sintomatología de Crespera del Café. El cicadélido C07 (más abundantes en campo) mostró ser un vector eficiente para la transmisión de Xylella fastidiosa. Generalmente las poblaciones más abundantes de cicadélidos colectados presentaron las concentraciones más altas de Xylella fastidiosa. El método de inoculación en pecíolos mostró mayor eficiencia (96.7%) para incorporar a Xylella fastidiosa que el método de puntura en entrenudo (66.7%). El periodo de observación de posibles síntomas de Crespera en los bioensayos con Xylella fastidiosa, Geobacillus spp y Pseudomonas fluorescens se consideró insuficiente. Se realizaron ensayos de infección con cicadélidos de campo sobre plantas de invernadero en condiciones de 23ºC y 70% de humedad relativa por 15 días y se corroboró la incidencia del patógeno en los insectos luego del ensayo, así como la infección de Xylella fastidiosa mediante DAS-ELISA luego de 3 meses en las hojas jóvenes y maduras. Se emplearon dos métodos de infección mecánica para Xylella fastidiosa, Geobacillus sp y Pseudomonas fluorescens buscando reproducir los síntomas de Crespera. Se corroboró mediante DAS-ELISA la infección de Xylella fastidiosa luego de 3 meses de ensayo en hojas inoculadas y no inoculadas. En ambos ensayos de infección se utilizaron plantas de invernadero de dos meses de edad libres de Xylella fastidiosa. Se buscó relacionar los microorganismos endógenos en cicadélidos con los endófitos en plantas de café y la sintomatología de Crespera