Development of immobilized horse radish (Armoracia rusticana) peroxidase for polymerization reactions and removal of phenols from waste waters

U prvom delu ove teze je makroporozni kopolimer glicidil metakrilata i etilen glikol dimetakrilata, poly(GMA-co-EGDMA) sa dijametrom čestica od 150 do 500 μm i različitim karakteristikama površine i različitom srednjom veličinom dijametra pora od 44 do 200 nm sintetisan, modifikovan 1,2-diaminoetanom i testiran kao nosač za imobilizaciju peroksidaze iz rena (HRP) koristeći dve kovalentne metode, glutaraldehidnu i perjodatnu. Najveća specifična aktivnost od oko 35 U/g suve mase nosača je postignuta na poly(GMA-co-EGDMA) kopolimeru sa srednjom veličinom dijametra pora od 200 i 120 nm koristeći perjodatni metod. Proučavanjem kinetike deaktivacije na 65 oC i u 80% (v/v) dioksanu je otkriveno da perjodatna metoda takođe dovodi do značajne stabilizacije biokatalizatora, i da stabilizacioni faktor zavisi snažno od površinskih karakteristika kopolimera. HRP imobilizovana na kopolimeru sa srednjom veličinom dijametra pora od 120 nm perjodatnom metodom je pokazala najveću specifičnu aktivnost ali takođe i dobru stabilnost, tako da je u daljem radu dodatno karakterisana. Imobilizacija je dovela do stabilizacije enzima u širem opsegu pH, dok je Mihaelisova konstanta (Km) imobilizovane HRP bila 10,8 mM što je otprilike 5,6 puta više nego za slobodni enzim. Posle 6 upotreba u bač reaktoru za oksidaciju pirogalola imobilizovana peroksidaza je zadržala 45% polazne aktivnosti. U drugom delu ove teze ista serija makroporoznih kopolimera glicidil metakrilata i etilen glikol dimetakrilata, poly(GMA-co-EGDMA) sa veličinom pora od 200 nm (ZS9) pa do neporoznog (ZS6) je testirana kao nosač za imobilizaciju peroksidaze iz rena, ali ovaj put sa dijametrom čestica od 2 do 2,5 μm. HRP je imobilizovana na 4 načina, preko epoksidne grupe na kopolimeru, i nakon aminovanja kopolimera glutaraldehidnom, perjodatnom i karbodiimidnom metodom. Najveća aktivnost imobilizovane HRP od 14,5 U/g je dobijena glutaraldehidnom metodom, a odmah zatim najveća aktivnost od 13,7 U/g karbodiimidnom metodom na poly(GMA-co-EGDMA) označenom kao ZS9 čija je srednja veličina pora bila oko 200 nm. Prinos imobilizacije je bio veći u odnosu na seriju kopolimera sa većom veličinom čestica i iznosio je 33,5% za glutaraldehidnu metodu i 30,3 % za karbodiimidnu u odnosu na oko 5% prinosa dobijenog za seriju kopolimera sa većom veličinom čestica i...In the first part of this thesis macroporous copolymer of glycidyl methacrylate and ethylene glycol dimethacrylate, poly(GMA-co-EGDMA) with various surface characteristics and mean pore size diameters ranging from 44 to 200 nm was synthesized, modified with 1,2-diaminoethane and tested as a carrier for immobilization of horseradish peroxidase (HRP) by two covalent methods, glutaraldehyde and periodate. The highest specific activity of around 35 U/g of dry weight of carrier was achieved on poly(GMA-co-EGDMA) copolymers with mean pore diameter of 200 and 120 nm by the periodate method. Study of deactivation kinetics at 65oC and in 80% (v/v) dioxane revealed that the periodate immobilization also produced an appreciable stabilization of the biocatalyst, while stabilization factor depended strongly on the surface characteristics of the copolymers. HRP immobilized on copolymer with mean pore diameter of 120 nm by periodate method showing the highest specific activity but also good stability was further characterized. It appeared that the immobilization resulted in stabilization of enzyme over a broader pH range while the Michaelis constant value (Km) of the immobilized HRP was 10.8 mM, approximately 5.6 times higher than that of the free enzyme. After 6 cycles of repeated use in batch reactor for pyrogallol oxidation, the immobilized HRP retained 45% of its original activity. In the second part of this thesis the same series of macroporous copolymer of glycidyl methacrylate and ethylene glycol dimethacrylate, poly(GMA-co-EGDMA) with pore diameter from 200 nm (ZS9) to the nonporous (ZS6) was tested as carier for immobilization of HRP, but this time with particle diameter between 2 and 2.5 μm. HRP was immobilized in 4 ways, via epoxide group on copolymer and after amination of copolymer using glutaraldehyde, periodate and carbodiimide method. The highest activity of immobilized HRP of 14.5 U/g was obtained using glutaraldehyde method and immediately after 13.75 U/g using carbodiimide method on poly(GMA-co-EGDMA) named ZS9 with average pore size of 200 nm. Yield of immobilization was..

Nanobiokatalizatori za biogorivne ćelije i biosenzorne sisteme

This overview summarizes the application of enzymes in the manufacture and design of biofuel cells and biosensors. The emphasis will be put on the protein engineering techniques used for improving the properties of enzymes such as nanobiocatalysts, e.g. immobilization orientation, stability, activity and efficiency of electron transfer between immobilized enzymes and electrodes. Some possible applications in the military and some future designs of these electric devices will be discussed as well.U ovom preglednom članku je sumirana primena enzima u proizvodnji i dizajnu biogorivnih ćelija i biosenzora. Naglasak u pregledu literature je stavljen na tehnike proteinskog inžinjeringa, koje se koriste za poboljšanje osobina enzima u nanobiokatalizatorima kao što su orijentacija kod imobilizacije, stabilnost, aktivnost i efikasnost transfera elektrona između imobilizovanog enzima i elektrode. Na kraju pregleda je dato nekoliko primera moguće primene u vojsci. Nanobiokatalizatori su biokatalizatori u obliku enzima ili ćelija imobilizovani na nanomaterijalima. Koriste se kao sastavni elementi gorivnih ćelija u vidu imobilizovanih oksidoreduktaza na elektrodama. Na anodi se uz pomoć enzima oksiduju hemijska jedinjenja i elektroni predaju elektrodi, dok se na katodi elektroni uz pomoć druge oksidoreduktaze prebacuju sa elektrode na vodu ili kiseonik. Enzimi koji se koriste na anodi su glukoza oksidaza, formaldehid dehidrogenaza, alkohol dehidrogenaza i druge oksidaze šećera. Na katodi se uglavnom koriste lakaze, bilirubin oksidaza, peroksidaze i citohrom c oksidaza. Zahvaljujući razvoju nanotehnologije razvijaju se i minijaturne biogorivne ćelije koje proizvode električnu energiju za implantirane medicinske uređaje (insulinske pumpe, pejsmejkere, biosenzore) koristeći glukozu i kiseonik iz ljudske krvi. Biosenzori predstavljaju uređaje koji se sastoje iz biološke komponente, transducera i električne komponente. Oni pretvaraju koncen traciju hemijske supstance u električni signal i koriste se za analitiku. Kao biološka komponenta se mogu koristiti enzimi, monoklonska antitela, nukleinske kiseline i lipidi. Enzimska logička kola predstavljaju kombinaciju različitih biosenzora (enzimskih reakcija) koji mere nekoliko ulaznih parametara i na osnovu njih daju odgovarajući izlazni signal. Koristeći znanja kompjuterske tehnologije enzimskim logičkim kolima mogu se simulirati AND, OR, XOR, NOR, NAND, INHIB i XNOR logička kola. Za poboljšanje osobina biokatalizatora u cilju efikasnije primene u bioelektrokatalizi koriste se tehnike proteinskog inžinjeringa kao što su racionalni dizajn i dirigovana evolucija. Dirigovana evolucija koristi iterativne korake mutiranja i selekcije, kako bi biokatalizator evoluirao u pravcu koji nam je potreban. Najsporiji stupanj u ovoj tehnologiji predstavlja 'skrining', te se u novije vreme pomoću protočne citometrije i mikrofluidike pokušavaju razviti nove metode visoko propusnog skrininga. U literaturi opisani primeri dirigovane evolucije glukoza oksidaze, glukoza dehidrogenaze, formaldehid dehidrogenaze, laktat dehidrogenaze, peroksidaze i lakaze. Kombinacijom enzimskih logičkih kola i mikrofluidne tehnologije se pokušavaju napraviti laboratorije na čipu koje bi omogućile kontinuirano praćenje zdravstvenog stanja vojnika na bojnom polju i u slučaju šoka (ranjavanja) primenu odgovarajuće terapije u toku prvih 30 minuta od povrede. To bi obezbedilo veći stepen preživljavanja vojnika u ratu. Takođe upotrebom enzimskih logičkih kola i antitela moguće je postići uskladištenje i šifrovanje informacija, kao i zaštitu lozinkom, odgovarajućih elektronskih uređaja kao što su biogorivne ćelije Razvoj nanotehnologije, proteinskog inžinjeringa i molekularnog računarstva otvara vrata novim mogućnostima u proizvodnji i dizajnu biogorivnih ćelija i bisenzorskih sistema, kao i u skladištenju i zaštiti informacija

Enzimi zaštite od oksidacionih oštećenja u toku klijanja dve linije omorike [Picea omorika (Panč.) Purkyně]

dTwo lines of Picea omorika (Pane.) Purkyne were compared with respect to germination percentage as well as specific activity and isoenzyme pattern of catalase, superoxide dismutase, and peroxidase (POD) during germination. Line A had a higher gennination percentage and higher enzyme activities in dry seeds and seedlings compared to line C. Peroxidase activity was not detected in dry seeds, but measured up to 10 U/g and 28 U/g on the 7(th) day of germination in lines C and A, respectively. The most abundant POD basic isoform in seedlings of both lines (pl 8.2) was not found previously in needles of adult Serbian spruce trees of the same lines.Poređeni su procenat klijanja, specifična aktivnost i izoenzimski profil katalaze, superoksid dismutaze i peroksidaze u dve linije omorike [Picea omorika (Panč.) Purkyně] u toku klijanja. Linija A je imala veći procenat klijanja i veće enzimske aktivnosti u suvom semenu i klijancima, u poređenju sa linijom C. Peroksidazna aktivnost nije nađena u suvim semenima, a povećavala se do 10 U/g i 28 U/g sed- mog dana klijanja u linijama C i A, respektivno. Najzastupljenija bazna izoforma peroksidaze u klijancima obe linije (pI 8.2) nije nađena ranije u četinama odraslih jedinki istih linija.

Supplementary data for article: Prodanović, O.; Spasojević, D.; Prokopijević, M.; Radotić, K.; Markovic, N.; Blažić, M.; Prodanović, R. Tyramine Modified Alginates via Periodate Oxidation for Peroxidase Induced Hydrogel Formation and Immobilization. Reactive and Functional Polymers 2015, 93, 77–83. https://doi.org/10.1016/j.reactfunctpolym.2015.06.004

Supplementary material for: [https://doi.org/10.1016/j.reactfunctpolym.2015.06.004]Related to published version: [http://cherry.chem.bg.ac.rs/handle/123456789/1966

Supplementary data for article: Blažić, M.; Kovačević, G.; Prodanović, O.; Ostafe, R.; Gavrović-Jankulović, M.; Fischer, R.; Prodanović, R. Yeast Surface Display for the Expression, Purification and Characterization of Wild-Type and B11 Mutant Glucose Oxidases. Protein Expression and Purification 2013, 89 (2), 175–180. https://doi.org/10.1016/j.pep.2013.03.014

Supplementary material for: [https://doi.org/10.1016/j.pep.2013.03.014]Related to published version: [http://cherry.chem.bg.ac.rs/handle/123456789/1357

Supplementary data for article: Djokic, L.; Spasic, J.; Jeremic, S.; Vasiljevic, B.; Prodanovic, O.; Prodanovic, R.; Nikodinovic-Runic, J. Immobilization of Escherichia Coli Cells Expressing 4-Oxalocrotonate Tautomerase for Improved Biotransformation of β-Nitrostyrene. Bioprocess and biosystems engineering 2015, 38 (12), 2389–2395. https://doi.org/10.1007/s00449-015-1474-8

Supplementary material for: [https://doi.org/10.1007/s00449-015-1474-8]Related to published version: [http://cherry.chem.bg.ac.rs/handle/123456789/1990

Production of a novel opine dehydrogenase

Opine dehydrogenases are a family of NAD(P)H dependent oxidoreductases, whichcatalyze the reductive condensation of an α amino group from an amino acid with an αketo acid during anaerobic glycolysis by regenerating NAD. They are widespread incephalopods and mollusks. Opines are associated with crown gall tumor pathogenesiscaused by A. tumefaciens providing nutrients to the pathogen, and novel opine compoundsacting as metallophores have been identified. Besides, opine-type secondary aminedicarboxylic acids are chiral intermediates of angiotensin-converting enzyme inhibitors. Anovel enzyme originating from an extremophile bacterium, with assumed opinedehydrogenase function was successfully expressed in Escherichia coli STAR cells andpurified by affinity chromatography. Molecular mass determined by SDS-PAGE wasapproximately 40 kDa. The activity was measured by using pyruvate and alanine assubstrates, by which proved that it has opine dehydrogenase activity

Poređenje dve metode za imobilizaciju HRP u alginatu za prečišćavanje otpadnih voda

Poznato je da peroksidaze iz rena (HRP) reaguju sa fenolima iz vode gradeći nerastvorna jedinjenja, koja onda mogu jednostavno da se uklone iz vodene faze. Glavni nedostatak ovog procesa predstavlja inaktivacija enzima te je stoga dosta pažnje usmereno na imobilizaciju peroksidaze u cilju uklanjanja fenolnih jedinjenja. Cilj našeg rada bio je da uporedimo dve metode za imobilizaciju HRP na alginatnom matriksu i nađemo imobilizat sa najboljim osobinama. HRP je imobilisana na nativnom i perjodatno oksidovanom alginatu. Nakon imobilizacije u alginatnim kuglicama, enzimska aktivnost je određivana spektrofotometrijski sa pirogalolom i H2O2 kao supstratima. Rezultati koje smo dobili ukazuju da HRP imobilisana na perjodatno oksidovanom alginatu ima veći stepen vezane aktivnosti, i nižu specifičnu aktivnost u odnosu na imobilizaciju na nativnom alginatu nakon imobilizacije. Nakon pet dana ispiranja imobilizat HRP u perjodatno oksidovanom alginatu je imao veću i specifičnu aktivnost i stoga je bolji kandidat za uklanjanje fenola iz otpadnih voda u protočnom reaktoru

Biljni polisaharidi kao hidrogelovi

У последњих 20 година, расте интересовање за биополимере, не само међу биохемичарима и молекуларним биолозима, него и у другим научним областима, а посебно у области науке о материјалима. Главне предности биополимера у односу на полимере из фосилних горива, јесу јефтино добијање из обновљивих извора и биоразградивост. Полисахариди су најзаступљенија класа биополимера у природи. Целулоза је главна структурна компонента ћелијског зида виших биљака и по количини најобилнији биополимер на земљи. За њом следи хемицелулоза, која представља скуп хетерополисахарида различите структуре. Најзаступљенији морски полисахарид је алгинат, конституент ћелијског зида мрких морских алги. Полисахариди поседују бројне функционалне групе, погодне за различите врсте хемијских модификација. Јонизабилне групе обезбеђују им хидрофилност, као и способност везивања наелектрисаних молекула и јона. Све ове особине допринеле су да полисахариди постану одличан материјал за производњу хидрогелова. Хидрогелови на бази биополимера нашли су своју примену у индустрији, пољопривреди, фармацији, медицини, заштити животне средине..

Supplementary data for the article: Ilić Đurđić, K.; Ostafe, R.; Prodanović, O.; Đurđević Đelmaš, A.; Popović, N.; Fischer, R.; Schillberg, S.; Prodanović, R. Improved Degradation of Azo Dyes by Lignin Peroxidase Following Mutagenesis at Two Sites near the Catalytic Pocket and the Application of Peroxidase-Coated Yeast Cell Walls. Front. Environ. Sci. Eng. 2020, 15 (2), 19. https://doi.org/10.1007/s11783-020-1311-4

Supplementary material for: [https://link.springer.com/article/10.1007%2Fs11783-020-1311-4]Related to published version: [https://cherry.chem.bg.ac.rs/handle/123456789/4101