Defined neuronal populations drive fatal phenotype in a mouse model of leigh syndrome

Altres ajuts: Seattle Children's Research Institute: Seed Funds;NINDS: R01 NIH/NS 102796; University of Washington Neurological Surgery Department: Ellenbogen Neurological Surgery Research Funds; University of Washington: The Ryan J. Murphy SUDEP Research Funds; Mitochondrial Research Guild: Seed FundsMitochondrial deficits in energy production cause untreatable and fatal pathologies known as mitochondrial disease (MD). Central nervous system affectation is critical in Leigh Syndrome (LS), a common MD presentation, leading to motor and respiratory deficits, seizures and premature death. However, only specific neuronal populations are affected. Furthermore, their molecular identity and their contribution to the disease remains unknown. Here, using a mouse model of LS lacking the mitochondrial complex I subunit Ndufs4, we dissect the critical role of genetically-defined neuronal populations in LS progression. Ndufs4 inactivation in Vglut2expressing glutamatergic neurons leads to decreased neuronal firing, brainstem inflammation, motor and respiratory deficits, and early death. In contrast, Ndufs4 deletion in GABAergic neurons causes basal ganglia inflammation without motor or respiratory involvement, but accompanied by hypothermia and severe epileptic seizures preceding death. These results provide novel insight in the cell type-specific contribution to the pathology, dissecting the underlying cellular mechanisms of MD

Estudio del perfil traduccional citosólico y mitocondrial de poblaciones neuronales susceptibles a la deficiencia del complejo I mitocondrial

El síndrome de Leigh (SL) és la malaltia mitocondrial més freqüent en infants. Els pacients amb SL, tot i tenir una clínica heterogènia, es caracteritzen per desenvolupar lesions neurològiques bilaterals en el tronc encefàlic i els ganglis basals que usualment acaben en la mort prematura del pacient. La restricció neuroanatòmica d’aquestes lesions ha posat de manifest que no totes les neurones són igual de susceptibles a la deficiència mitocondrial. En aquest sentit, l’estudi d’un ratolí deficient per Ndufs4 (Ndufs4KO), una de les mutacions més recurrents en el SL, el qual reprodueix pràcticament tota la patologia humana, ha establert que les neurones GABAèrgiques i les glutamatèrgiques són especialment vulnerables. No obstant, els determinants d’aquesta susceptibilitat estan encara per resoldre, evidenciant la importància de noves aproximacions per la investigació del SL, donat que actualment no existeix cap tipus de cura efectiva per aquesta malaltia. Per això, en aquesta tesis doctoral hem combinat un assaig per aïllar el ARNm associat a ribosomes de tipus cel·lulars específics, amb seqüenciació massiva, amb la finalitat de caracteritzar les alteracions del perfil traduccional citosòlic d’aquestes dues poblacions neuronals. L’anàlisi bioinformàtic d’aquestes dades ha evidenciat que, en resposta a la deficiència de Ndufs4, les neurones GABAèrgiques del bulb olfactori, una àrea amb prominent afectació en el ratolí Ndufs4KO, activen una resposta antiviral. Per altra banda, la mateixa mutació en les neurones glutamatèrgiques d’una altra àrea igualment afectada, el nucli vestibular, es tradueix en una alteració primerenca del metabolisme lipídic seguida d’un increment progressiu de la senyalització neuropeptídica i la biogènesis ribosomal. Així, aquestes dades senyalen la rellevància de la especificitat de tipus cel·lular i de la comunicació mitocondri-nucli en la regulació de la disfunció mitocondrial. Per una millor comprensió de les alteracions subjacents a aquesta deficiència mitocondrial, hem desenvolupat i validat una eina basada en un vector viral que permet d’una manera ràpida i eficient aïllar el ARNm associat als ribosomes mitocondrials de tipus cel·lulars definits en teixits complexes (MitoRiboTag). Amb l’aplicació d’aquesta eina hem pogut determinar que la deficiència de Ndufs4 en les neurones glutamatèrgiques vestibulars provoca una reducció selectiva de la associació al ribosoma mitocondrial del transcrit Nd1, probablement bloquejant la biogènesis del complex I mitocondrial. Aquesta tecnologia permet, per primer cop, entendre la regulació del perfil traduccional mitocondrial i avaluar la complexa comunicació mitocondri-nucli en poblacions genèticament definides en condicions fisiològiques i patològiques in vivo, facilitant el camí per el desenvolupament de tractaments efectius per el SL.El síndrome de Leigh (SL) es la enfermedad mitocondrial más recurrente en infantes. Los pacientes con SL, a pesar de tener un clínica heterogénea, se caracterizan por desarrollar lesiones neurológicas bilaterales en el tronco encefálico y los ganglios basales que suelen derivar en una muerte prematura. La restricción neuroanatómica de estas lesiones ha revelado que no todas las neuronas son igual de susceptibles a la deficiencia mitocondrial. De acuerdo con esto, el uso de un ratón deficiente para Ndufs4 (Ndufs4KO), una de las mutaciones más frecuentes en el SL, que recapitula fehacientemente la patología humana, ha establecido que las neuronas GABAérgicas y glutamatérgicas son especialmente vulnerables. Sin embargo, los determinantes de esta susceptibilidad están aún por resolver, resaltando la importancia de nuevas aproximaciones para el estudio del SL, dado que no existe cura para esta enfermedad. Por ello, en esta tesis doctoral hemos combinado un ensayo para el aislamiento del ARNm asociado a ribosomas de tipos celulares específicos, con secuenciación masiva, para caracterizar las alteraciones del perfil traduccional citosólico de estas dos poblaciones neuronales. El análisis bioinformático de estos datos ha revelado que, en respuesta a la deficiencia de Ndufs4, las neuronas GABAérgicas del bulbo olfatorio, un área con robusta afectación en el ratón Ndufs4KO, activan una respuesta antiviral. Por otro lado, la misma mutación en las neuronas glutamatérgicas de otra área igualmente afectada, el núcleo vestibular, se traduce en una alteración temprana del metabolismo lipídico seguido de un incremento progresivo de la señalización neuropeptídica y la biogénesis ribosomal. Así, estos datos resaltan la importancia de la especificidad de tipo celular y de la comunicación mitocondria-núcleo en la regulación de la disfunción mitocondrial. Para una mejor comprensión de las alteraciones subyacentes a la deficiencia mitocondrial, hemos desarrollado y validado una herramienta basada en un vector viral que permite de una manera rápida y eficiente aislar el ARNm asociado al ribosoma mitocondrial de tipos celulares específicos en tejidos complejos (MitoRiboTag). Con la aplicación de esta técnica hemos podido determinar que la deficiencia de Ndufs4 en las neuronas glutamatérgicas vestibulares causa una reducción selectiva de la asociación al ribosoma del transcrito Nd1, probablemente bloqueando la biogénesis del complejo I mitocondrial. Esta tecnología permite, por primera vez, entender la regulación del perfil traduccional mitocondrial y evaluar la compleja comunicación mitocondria-núcleo en poblaciones celulares genéticamente definidas en condiciones fisiológicas y patológicas in vivo, facilitando el camino para el desarrollo de tratamientos efectivos para el SL.Leigh syndrome (LS) is the most common childhood presentation of mitochondrial disease. Albeit clinically heterogeneous, LS is characterized by neurological damage, especially restricted to brainstem and basal ganglia, usually leading to early death. The anatomic restriction of brain lesions in LS has underscored that not all neurons are equally susceptible to mitochondrial deficiency. Accordingly, a well-stablished mouse model of LS presenting Ndufs4 deficiency (Ndufs4KO), one of the most prevalent mutated genes in LS, recapitulates the human disease. Using this mouse model, it has been established that GABAergic and glutamatergic neurons are especially vulnerable to the disease. However, the determinants of this susceptibility remain unknown, highlighting the need for novel approaches to study LS since there is no cure for this pathology. Hence, in this doctoral thesis we have combined cell-type specific ribosome-bound mRNA isolation with next generation sequencing to profile the cytosolic translational alterations of these two neuronal populations. Bioinformatic analysis of these data revealed that in response to Ndufs4 deficiency, GABAergic neurons in the olfactory bulb, a severely affected region in Ndufs4KO mice, activate an antiviral response. On the other hand, glutamatergic neurons in another affected area, the vestibular nuclei, lead to a premature impairment of lipid metabolism followed by a progressive increase in neuropeptide signaling and ribosome biogenesis. Thus, these results highlight the relevance of cell type specific regulation, and mitochondria-nuclear crosstalk in neuronal susceptibility to mitochondrial dysfunction. To further understand alterations in mitochondrial deficiency, we have developed and validated a novel viral vector-based approach to rapidly and efficiently isolate cell type-specific mitochondrial ribosome-bound mRNA from complex tissues (MitoRiboTag). Using this approach, we have identified that Ndufs4 deficiency in vestibular glutamatergic neurons causes a selective reduction in the ribosomal loading of Nd1 transcript, which may lead to blockage of complex I biogenesis. Thus, this technology allows, for the first time, to understand the mitochondrial translational profile regulation and to evaluate the complex mitochondria-nucleus crosstalk of genetically-defined populations in physiological and pathological conditions in vivo, paving the way for the development of effective therapies for LS.Universitat Autònoma de Barcelona. Programa de Doctorat en Neurocièncie

Mitochondrial Proteome of Affected Glutamatergic Neurons in a Mouse Model of Leigh Syndrome

Defects in mitochondrial function lead to severe neuromuscular orphan pathologies known as mitochondrial disease. Among them, Leigh Syndrome is the most common pediatric presentation, characterized by symmetrical brain lesions, hypotonia, motor and respiratory deficits, and premature death. Mitochondrial diseases are characterized by a marked anatomical and cellular specificity. However, the molecular determinants for this susceptibility are currently unknown, hindering the efforts to find an effective treatment. Due to the complex crosstalk between mitochondria and their supporting cell, strategies to assess the underlying alterations in affected cell types in the context of mitochondrial dysfunction are critical. Here, we developed a novel virus-based tool, the AAV-mitoTag viral vector, to isolate mitochondria from genetically defined cell types. Expression of the AAV-mitoTag in the glutamatergic vestibular neurons of a mouse model of Leigh Syndrome lacking the complex I subunit Ndufs4 allowed us to assess the proteome and acetylome of a subset of susceptible neurons in a well characterized model recapitulating the human disease. Our results show a marked reduction of complex I N-module subunit abundance and an increase in the levels of the assembly factor NDUFA2. Transiently associated non-mitochondrial proteins such as PKCδ, and the complement subcomponent C1Q were also increased in Ndufs4-deficient mitochondria. Furthermore, lack of Ndufs4 induced ATP synthase complex and pyruvate dehydrogenase (PDH) subunit hyperacetylation, leading to decreased PDH activity. We provide novel insight on the pathways involved in mitochondrial disease, which could underlie potential therapeutic approaches for these pathologies.This work was supported by a Marie Skłodowska-Curie COFUND action (H2020-MSCA-COFUND-2014-665919; AG), a Marie Skłodowska-Curie Individual Fellowship (H2020-MSCA-IF-2014-658352; ES), pre-doctoral fellowships (BES-2015-073041 to PP-D; 2018FI_B 00452 to AU), and a Ramón y Cajal fellowship (RyC-2012-11873; AQ). The Proteomics Laboratory CSIC/UAB is a member of Proteored, PRB3-ISCIII, and is supported by Grant PT17/0019/0008, funded by ISCIII and FEDER. ES received funds from MICIU Proyectos I+D+i “Retos Investigacion” (RTI2018-101838-J-I00). AQ received funds from the European Research Council (Starting grant NEUROMITO, ERC-2014-StG-638106), MINECO Proyectos I+D de Excelencia (SAF2014-57981P and SAF2017-88108-R), and AGAUR (2017SGR-323)