Aplicación al aprendizaje de técnicas de purificación y análisis de proteínas

A menudo el aprendizaje de técnicas experimentales en el laboratorio se ofrece en forma de prácticas independientes inconexas en las que el alumno aprende una o unas pocas de ellas en cada sesión. En esta comunicación se presenta una propuesta alternativa para facilitar el aprendizaje significativo de técnicas experimentales (en este caso algunas de las más habituales en purificación y análisis de proteínas), integrándolas como parte de un proyecto que se prolongará durante varias sesionesPostprint (published version

Peroxidación lipídica y factores de riesgo cardovascular

INTRODUCCIÓN: La lesión más incipiente que ha sido descrita en la patogénesis de la arteriosclerosis es la estría grasa. En este proceso los monocitos y los macrófagos juegan un papel muy importante. Los macrófagos no poseen receptores para las LDL negativas, sin embargo son capaces de reconocer las LDL modificadas a través del receptor scraveger. Ello provocará la entrada masiva de ésteres de colesterol en el interior de la célula, al no estar sujeta a ningún sistema de control, originando la formación de las células espumosas.De entre las diversas modificaciones que puede sufrir la partícula LDL, la oxidación es de todas ellas la más importante. Se ha podido comprobar un incremento en la susceptibilidad a oxidarse las LDL en pacientes con factor de riesgo coronario.OBJETIVOS: 1- Estudiar los niveles de peroxidación lipídica en plasma y en la fracción LDL en un grupo de población general y en sujetos con factores de riesgo coronario. 2- Estudiar los niveles de peroxidación lipídica en plasma y en la fracción LDL en pacientes hipercolesterolémicos. 3- Valorar las modificaciones de la peroxidación lipídica en plasma y en la fracción LDL en los pacientes hipercolesterolémicos tratados con probucol. 4- Estudiar los niveles de peroxidación lipídica en plasma y en la fracción LDL en pacientes diabéticos. 5- Estudiar los niveles de peroxidación lipídica en plasma en pacientes con obesidad mórbida. 6- Valorar los cambios en los niveles de peroxidación lipídica en plasma inducidos por una dieta muy baja e calorías. 7- Valorar los niveles de peroxidación lipídica en plasma y en la fracción LDL en relación a la edad y por último valorar los niveles de peroxidación lipídica en plasma y en la fracción LDL en relación al consumo de tabaco.MATERIAL Y MÉTODOS : Se seleccionaron un total de ochenta y tres pacientes (37&#9794; y 46&#9792;) con edades comprendidas entre los veintitrés y los sesenta y cuatro años, que acudían a control a la Unidad de Lípidos y de Enfermedades Metabólicas del Hospital de "Sant Joan de Reus". Estos pacientes estaban afectos de hipercolesterolemia aislada (n=33), diabetes tipo II (n=25) y obesidad mórbida (n=25).Asimismo, se reclutaron un total de noventa y tres individuos de la población sana (58&#9794; y 35&#9792;) con edades comprendidas entre los diecisiete y los ochenta y ocho años. Para su posterior estudio fueron divididos en relación a la edad (menores de 30, entre 30 y 64 y mayores de 65), ellos a su vez fueron estudiados en relación a su hábito tabáquico.Se incluyeron hipercolesterolémicos con niveles de colesterol en plasma > 6.5 mmol/L y niveles de triglicéridos Las pacientes con obesidad mórbida fueron hospitalizadas durante un periodo de veintiún días, durante los cuales fueron sometidas a una dieta muy baja en calorías e hiperproteica (VLCD) (MODIFAST). Se obtuvieron muestras sanguíneas al inicio y al finalizar dicho periodo.Se elaboró una historia clínica y exploración física completa, se determinaron los valores lipídicos y las fracciones lipoproteicas así como los valores de peroxidación lipídica en plasma y en a fracción LDL a todos los individuos incluidos en el estudio.RESULTADOS: En los pacientes hipercolesterolémicos observamos un descenso significativo en los niveles de colesterol total y colesterol LDL (15 y 13%) y (14 y 10%) respectivamente tras las 12 y 24 semanas de haber iniciado el tratamiento (pEn el grupo de pacientes diabéticos el nivel de colesterol en plasma fue de 5.28±0.82 y de triglicéridos 1.62±2.03, no apreciándose diferencias significativas en relación al grupo control de población sana. Sin embargo, los niveles de oxidación en plasma en diabéticos fue 6.89±1.53 y en el grupo control fue 5.14±1.74 (pEn el grupo de pacientes con obesidad mórbida normolipémicos observamos, al comparar el periodo de pre-dieta con el post-dieta, un descenso (pEl grupo de población sana de mayor edad presentó niveles de colesterol en plasma y colesterol HDL superiores a los otros grupos de forma significativa (p En el grupo de población sana no fumadora, los valores lipídicos fueron superiores a los fumadores aunque sin diferencias a excepción de los triglicéridos con una p De las diferentes correlaciones estudiadas solamente vimos una correlación positiva entre el colesterol plasmático y la oxidación en plasma en el grupo de varones fumadores y entre la edad y los niveles de oxidación en plasma y en la fracción LDL en el grupo de población sana. CONCLUSIONES: 1- Los sujetos con factores de riesgo vascular estudiados por nosotros, presentaron niveles de oxidación lipídica superiores al grupo control. 2- Los pacientes hipercolesterolémicos presentaron niveles de oxidación lipídica en plasma y en la fracción LDL superiores en un 33% y un 32% (p65 años presentaron niveles de oxidación lipídica en plasma y en LDL superiores en un 35% y un 30% respectivamente a los sujetos de edad entre los 30-64 años. Los varones 65 años, aunque en LDL la oxidación fue superior. 7- Los varones fumadores presentaron niveles de oxidación lipídica en LDL, significativamente superiores al grupo de no fumadores en un 31%. En plasma estas diferencias no fueron significativas.We have analysed the plasma and LDL oxidation susceptibility in individuals with and without the presence od cardiovascular risk factors. OBJECTIVES: To study the lipid peroxidation levels in plasma and LDL fraction in subjects with and without DHD risk factors: Hipercholesterolemia, Obesity, Diabetis, Odl age and Tabacco. To study the modification induced in the lipid peroxidation levels in plasma and LDL in hypercholesterolemia subjects after Probucol treatment and in obese subjects after a very low calory diet. SUBJECTES AND METHODS: Were recruited 83 patients attending to the metabolic Unit of Sant Joan Hospital (33 hypercholesterolemia, 25 diabetic, 25 obese). As control group were recruited 93 apparenty healthy individuals. A complete lipoprotein profile was determined by ultracentrifugation in them all. Thiobarbituric acid reacting substances were measured inn plasma and LDL fraction. In the hypercholesterolemia patients similar measurement were also carried out after 3 and 6 month if Probucol treatment. In the morbide obesity patients TBARS were analysed after 4 weeks on a very calory diet. RESULTS: Hipercholesterolemia patients had a higher concentration of TBARS both in plasma and LDL that the normalcholesterolemia subjects (7.69±2.19 vs 5.14±1.74 p65 years respect to the 30-64 years group (8.09±1.30 vs 5.14±1.74), 30-64 years group (8.09±1.30 vs 5.14±1.74 p<0.01, 3.07±0.54 vs 2.19±0.54 p<0.01). TBARS and age were lineally correlated r:0.6543 p<0.01, r:0.5923 p<0.01, when smokers were excluded. Smokers had higher TBARS in plasma and LDL oxidation concentration tham non smokers (6.72±1.73 vs 6.03±1.96, 4.0±1.15 vs 2.74±0.86 p<0.01). CONCLUSIONS: Hypercholesteolemia, diabetis, morbide obesity, smoking and ageing are associated to increased plasma and LDL oxidability. This could be a mechanism to explain the increased CHD risk associated the this conditions. Probucol and weight lose tend to correct the susceptibility to oxidation

Distribució i caracterització de les proteïnes espermàtiques bàsiques a peixos, agnats i procordats

En aquest treball es caracteritzen les proteïnes espermàtiques bàsiques (PEB) que condensen el DNA de l'espermatozoide de diferents grups de deuteròstoms, tant procordats (tunicats o urocordats i cefalocordats) com vertebrats (agnats, peixos cartilaginosos i peixos ossis), fent especial èmfasi en el cas dels peixos ossis. L'objecte d'aquesta anàlisi ha estat l'intent d'obtenir més informació sobre l'evolució molecular de les PEB en els deuteròstoms, ja que no hi havia informació fins al moment referent als urocordats, cefalocordats i agnats.Concretament, dins dels tunicats s'han estudiat extensivament dues espècies del gènere Styela (classe Ascidiacea) així com 7 espècies més pertanyents també a aquesta classe i una pertanyent a la classe Thaliacea. Els resultats mostren que la PEB característica dels ascidiads és la proteïna que hem anomenat PI, apareixent en el gènere Styela una proteïna específica adicional P2. Aquestes proteïnes (PI, P2), malgrat ser totes dues altament bàsiques (50-70%), presenten característiques diferents tant en la mida, mobilitat electroforètica, composició i estructura. L'estudi de la PI à'Styela alicata mostra que es tracta d'una proteïna relacionada amb la histona HI o proteïnes afins; així presenta un nucli resistent a la tripsina la composició aminoacídica del qual és molt similar al d'aquesta família de proteïnes. Igualment, l'estudi de la seqüència parcial d'aquesta proteïna (extrem N-terminal, zona globular central i part de l'extrem C-terminal) mostra una estreta relació entre ambdós tipus de proteïnes. Una peculiaritat de la PI és el presentar un braç Nterminal extraordinàriament reduït, consistent només en dues arginines. Per la seva banda, la P2 es mostra com una molècula més especialitzada, de mida menor, menor diversitat aminoacídica i major basicitat (per un major acúmul d'Arg). La composició de la P2 recorda molt la de la PI, fet que fa pensar en un possible origen d'aquesta proteïna a partir de la PI.L'única espècie estudiada d'entre els cefalocordats, Branchiostoma floridae, mostra al nucli del seu espermatozoide una proteïna molt especialitzada que substitueix pràcticament la totalitat de les histones al llarg de l'espermiogènesi. Aquesta proteïna consta només de 6 tipus diferents d'aminoàcids destacant-ne els aminoàcids bàsics (24.7% de Lys, 25.3% d'Arg). Hem estudiat la seqüència aminoacídica parcial de l'extrem N-terminal d'aquesta proteïna descobrint la presència del motiu alternant Arg-Ser (que es troba també en altres PEB de grups no relacionats).Durant l'espermiogènesi de Petromyzon marinus (agnat cefalaspidomorf) les histones no es veuen substituïdes per cap altra proteïna específica de l'espermatozoide sinó que es mantenen com a úniques proteïnes responsables de la condensació de la cromatina del nucli espermàtic.Dins dels peixos cartilaginosos, hem estudiat les PEB d'Hydrolagus colliei (condricti de la línia dels holocèfals) i hem vist que malgrat el "model" de contingut de proteïnes espermàtiques bàsiques és el mateix (una proteïna no queratinosa més dues de queratinoses), les característiques de les molècules en sí difereixen substancialment. Així, l'estudi de la seqüència parcial de la proteïna no queratinosa R3 d'aquesta espècie mostra diferències importants respecte a la corresponent proteïna trobada als elasmobranquis i amb la protamina típica dels peixos ossis, amb qui sovint se l'ha relacionada.Entre els osteïctis hem estudiat les PEB de 32 espècies representants de 24 famílies corresponents a 9 ordres diferents de teleostis. Es disposa de la caracterització electroferètica de totes, l'anàlisi composicional de 16, i s'han estudiat les estructures primàries de dues espècies més. En aquest grup hem trobat una gran varietat de continguts de proteïnes espermàtiques bàsiques: a) protamines típiques; b) histones sense cap altra proteïna addicional; c) histones somàtiques amb un increment de l'Hi; d) histones amb proteïnes específiques addicionals; e) proteïnes específiques diferents de les protamines típiques (però que també substitueixen les histones). La distribució d'aquests diferents tipus de continguts no mostra una relació amb la classificació filogenètica de les espècies implicades (no obstant, el model de PEB presentat és consistent dins de cada família). Tenint en compte aquesta distribució, així com consideracions de tipus funcional, es discuteixen les posibles explicacions d'aquesta "esporadicitat" observada.Hem seqüenciat les PEB de dos peixos representants dels dos casos generals de substitució de les histones al nucli espermàtic que hem trobat. Així, hem seqüenciat completament la PEB de Dicentrarchus labrax (protamina típica) i parcialment la de Mullus surmuletus (proteïna específica de l'espermatozoide diferent de les protamines típiques). Aquesta última proteïna es mostra relacionada amb la família de les histones HI o afins. Així, consta d'uns extrems N i C-terminals enriquits en aminoàcids bàsics i una zona central resistent a la tripsina on s'acumulen els residus hidrofòbics. Tant l'anàlisi de la seva estructura primària parcial (extrem N-terminal, zona globular i part de l'extrem C-terminal) com de l'estructura secundària predida mostren una gran similitud amb les corresponents de les histones HI, especialment en la zona globular central, que és el domini més conservat en les His.Hem classificat les diferents PEB trobades als grups estudiats en dos tipus generals de molècules: a) proteïnes relacionades amb histones (generalment l'Hi); i b) proteïnes especialitzades. Les primeres correspondrien a molècules grans amb una zona més hidrofòbica resistent a la tripsinització, i un o dos extrems molt bàsics i no resistents (ex. PI dels ascidiacis, PEB del Mullus ï altres proteïnes específiques addicionals trobades en peixos ossis). Les molècules que anomenem especialitzades correspondrien a proteïnes menors i amb baixa proporció o sense aminoàcids hidrofòbics, sent l'Arg i la Lys els aminoàcids que constitueixen la major part de la molècula (ex. P2 d'Sty ela, P de l'amfiox, R3 d'H. colliei, protamines típiques dels peixos ossis).No sembla existir una relació d'homologia entre les proteïnes bàsiques del nucli de l'espermatozoide trobades en cada un dels grups de deuteròstoms estudiats sinó que més aviat es tracta de solucions a un mateix problema adoptades amb independència (encara que per camins similars en alguns casos)

Experiencia para fomentar la motivación y el aprendizaje en los trabajos en grupo presentados en el aula. Cambiando el enfoque

Tot i els innegables beneficis del treball en grup, freqüentment ens trobem amb problemes de falta de motivació per part de l'alumnat. En la present comunicació es mostra una experiència desenvolupada a fi de fomentar la motivació en els treballs en grup exposats a classe emmarcant aquestes presentacions en un context més proper a situacions reals i conferint un major protagonisme a l'alumne. Aquesta major motivació ha afavorit al seu torn un major aprenentatge. Despite the undeniable benefits of group work, we frequently encounter problems raising from student’s lack of motivation. This communication shows an experience developed in order to encourage motivation in group works exposed in class by framing these pr esentations in a context closer to real situations and conferring greater prominence to the student. This greater motivation has in turn favored greater learning.Postprint (published version

Determination of trace levels of nickel(II) by adsorptive stripping voltammetry using a disposable and low-cost carbon screen-printed electrode

A commercial and disposable screen-printed carbon electrode (SPCE) has been proposed for a fast, simple and low-cost determination of Ni(II) at very low concentration levels by differential pulse adsorptive stripping voltammetry (DPAdSV) in the presence of dimethylglyoxime (DMG) as complexing agent. In contrast with previously proposed methods, the Ni(II)-DMG complex adsorbs directly on the screen-printed carbon surface, with no need of mercury, bismuth or antimony coatings. Well-defined stripping peaks and a linear dependence of the peak area on the concentration of Ni(II) was achieved in the range from 1.7 to 150 microg/L, with a limit of detection of 0.5 microg/L using a deposition time of 120 s. An excellent reproducibility and repeatability with 0.3% (n = 3) and 1.5% (n = 15) relative standard deviation, respectively, were obtained. In addition, the suitability of the SPCE as sensing unit has been successfully assessed in a wastewater certificated reference material with remarkable trueness and very good reproducibility

Crown ether-modified electrodes for the simultaneous stripping voltammetric determination of Cd(II), Pb(II) and Cu(II)

This work describes the immobilization of 4-carboxybenzo-18-crown-6 (CB-18-crown-6) and 4-carboxybenzo-15-crown-5 (CB-15-crown-5) assisted by lysine on aryl diazonium salt monolayers anchored to the surface of graphite-epoxy composite electrodes (GEC), and their use for the simultaneous determination of Cd(II), Pb(II) and Cu(II) by differential pulse anodic stripping voltammetry (DPASV). These modified electrodes display a good repeatability and reproducibility with detection and quantification limits at levels of µg L(-1) (ppb), confirming their suitability for the determination of Cd(II), Pb(II) and Cu(II) ions in environmental samples. The overlapped nature of the multimetal stripping measurements was resolved by employing the two-sensor array CB-15-crown-5-GEC and CB-18-crown-6-GEC, since the metal complex selectivity exhibited by the considered ligands could add some discrimination power. For the processing of the voltammograms, Discrete Wavelet Transform and Causal Index were selected as preprocessing tools for data compression coupled with an artificial neural network for the modeling of the obtained responses, allowing the resolution of mixtures of these metals with good prediction of their concentrations (correlation with expected values for an external test subset better than 0.942)

Crown ether-modified electrodes for the simultaneous stripping voltammetric determination of Cd(II), Pb(II) and Cu(II)

This work describes the immobilization of 4-carboxybenzo-18-crown-6 (CB-18-crown-6) and 4-carboxybenzo-15-crown-5 (CB-15-crown-5) assisted by lysine on aryl diazonium salt monolayers anchored to the surface of graphite-epoxy composite electrodes (GEC), and their use for the simultaneous determination of Cd(II), Pb(II) and Cu(II) by differential pulse anodic stripping voltammetry (DPASV). These modified electrodes display a good repeatability and reproducibility with detection and quantification limits at levels of µg L−1 (ppb), confirming their suitability for the determination of Cd(II), Pb(II) and Cu(II) ions in environmental samples. The overlapped nature of the multimetal stripping measurements was resolved by employing the two-sensor array CB-15-crown-5-GEC and CB-18-crown-6-GEC, since the metal complex selectivity exhibited by the considered ligands could add some discrimination power. For the processing of the voltammograms, Discrete Wavelet Transform and Causal Index were selected as preprocessing tools for data compression coupled with an artificial neural network for the modeling of the obtained responses, allowing the resolution of mixtures of these metals with good prediction of their concentrations (correlation with expected values for an external test subset better than 0.942)

Propagació de la incertesa en laboratoris d'anàlisi

El document és una guia per al càlcul de la propagació de la incertesa en laboratoris d'anàlisi