Regulation of Schwann cells and osteoclasts with an emphasis on NF1-deficient cells

ABSTRACT Neurofibromatosis type 1 (NF1) is a dominantly inherited cancer predisposition syndrome, which affects one in 2000 individuals worldwide. NF1 exhibits a variety of clinical symptoms. Neurofibromas, the hallmarks of NF1, carry two different genotypes of Schwann cells: cells with a germline mutation and a healthy NF1 allele (NF1+/- ) and those with an inactivation of both alleles (NF1-/- ). These tumors typically start to appear during puberty, and their number and size grow during pregnancy indicating hormone responsiveness. The present study showed that cultured NF1-/- Schwann cells were more sensitive to the effects of estradiol, testosterone, and human chorionic gonadotropin (hCG) than NF1+/- cells. Multinucleated osteoclasts are responsible for bone resorption and actin ring formation is essential to bone resorption. The dynamic actin structure undergoes rapid changes and plays several roles including cellular movement and maintenance of the cell shape. The osteoclast actin structure consists of a podosome belt with a loose actin “cloud” on its top. STED and confocal microscopy revealed a new insight into osteoclast actin structure. This was a curved and branched actin structure extended from the substratum level to the top of the cell co-localizing with membrane lipids. In addition, thick actin containing micrometer-level tubes were bridging adjacent osteoclasts above the level of the substratum. The roles of the Ras/PI3K/Akt/mTOR, Ras/Raf/MEK1/2/ERK1/2, calcium-PKC, and p38 signaling pathways in human osteoclast differentiation and bone resorption were evaluated. Down-regulation of most of these pathways by chemical inhibitors decreased the number of osteoclasts from NF1 patients and controls. However, inhibition of p38 increased osteoclastogenesis but not the function of the cells. In addition, inhibition of Ras increased the number of control osteoclasts but decreased the number of NF1 cells. We found that the number of osteoclasts appeared to correlate with the phosphorylation of ERK1/2, which may act as a key driver of human osteoclast differentiation. The aim of this in vitro study was to further develop, characterize, and test culture conditions for cell types involved in the pathogenesis of two distinct hallmark lesions of NF1. Specifically, these lesions include the neurofibroma tumors largely composed of Schwann cells; and the skeletal lesions such as osteoporosis and false joints, where osteoclasts apparently play a major role. Keywords: Neurofibromatosis 1, Schwann cell, osteoclast, actin, signaling pathwayTIIVISTELMÄ Neurofibromatoosi tyyppi 1 (NF1) on vallitsevasti periytyvä syöpätyypeille altistava oireyhtymä, jonka esiintyvyys on maailmanlaajuisesti 1/2000. NF1 sairauteen liittyy useita erilaisia kliinisiä löydöksiä. Neurofibroomat ovat NF1 sairauden keskeisimpiä tunnusmerkkejä, jotka sisältävät kahden eri genotyypin Schwannin soluja: osassa soluista on heterotsygoottinen NF1+/- genotyyppi, jossa toinen alleeli on toimiva, kun taas osalle soluista on tapahtunut toisenkin alleelin katoaminen NF1-/- . Neurofibroomilla on taipumus ilmestyä murrosiän aikana ja niiden koko sekä määrä kasvavat raskauden aikana. Kasvainten ajatellaan reagoivan hormoneihin. Tässä tutkimuksessa osoitettiin, että erityisesti NF1-/- genotyypin Schwannin solut ovat erityisen herkkiä estradiolille, testosteronille ja koriongonadotropiinille. Monitumaisten osteoklastien tehtävä on hajottaa luuta. Aktiinirenkaan muodostuminen on välttämätöntä luun hajotukselle. Aktiinin dynaaminen rakenne muuttuu nopeasti ja aktiinilla on useita rooleja solujen liikkumisesta solun tukirangan muodostumiseen. Osteoklastien aktiinirakenne muodostuu niin kutsutusta podosomivyöstä ja sen päällä olevasta löyhästä aktiini pilvestä. Väitöskirjassa tutkittiin STED- ja konfokaalimikroskopian avulla osteoklastien aktiinirakennetta. Tutkimuksessa havaittiin, että taipuisa ja haarautuva aktiinirakenne ulottui osteoklastin kasvualustalta solun yläosaan asti. Tutkimuksessa löydettiin mikrometrin kokoisia tunneleita kahden eri osteoklastin välillä, jotka kulkeutuivat yhdestä solusta toiseen. Väitöskirjassa tutkittiin Ras/PI3K/Akt/mTOR, Ras/Raf/MEK1/2/ERK1/2, kalsiumPKC, and p38 signalointiteiden roolia osteoklastien erilaistumisessa. Useimpien signalointiteiden todettiin vähentävän osteoklastien erilaistumista sekä kontrolli että NF1-potilaiden soluilla. Tutkimuksessa havaittiin, että p38 signaloinnin estäminen lisäsi osteoklastien erilaistumista molemmilla tutkituilla solutyypeillä. Lisäksi havaittiin, että Ras-signaloinnin estäminen lisäsi kontrolli solujen määrää, kun taas NF1 potilaiden osteoklastien määrä väheni. Väitöskirjatutkimuksessa todettiin osteoklastien määrän korreloivan ERK1/2 fosforylaation kanssa, joka saattaa olla osteoklastien erilaistumisen avaintekijä. Tämän in vitro tutkimuksen tarkoituksena oli tutkia soluja, jotka ovat osallisina NF1-sairauden patogeneesissä ja erityisesti sairauden keskeisimmissä tunnusmerkeissä. Näihin kuuluvat ihon neurofibroomat, jotka koostuvat suurelta osin Schwannin soluista sekä luuston leesiot, kuten osteoporoosi tai valenivelen muodostuminen, joissa osteoklasteilla on ilmeisesti merkittävä rooli. Avainsanat: Neurofibromatoosi 1, Schwannin solu, osteoklasti, aktiini, signalointiti

Suorituskykymittaristo lääketieteellisen opetusohjelman uudistusprojektiin

This thesis constructs performance measures for the use of monitoring the curriculum reform project at the Faculty of Medicine at the University of Helsinki. Medical education is in turmoil not only due to developments in modern health care, but also due to the changing role of the physician. Changes are always disruptive and should be planned and managed accordingly to reduce the disruption to operations. This thesis studies not only the performance measures used to manage curriculum reforms and evaluate the outcomes of these reforms, but also the change agendas behind these reforms. It is important to understand these agendas as they influence the goals set for a project. Based on the literature study on the performance measures and change agendas, performance metrics for the curriculum reform project at the Faculty of Medicine at the University of Helsinki are constructed. The metrics utilise the well-known balanced scorecard framework, adapting the four perspectives to a higher education environment. The resulting scorecard utilises many existing feedback and evaluation channels as well as several new metrics.Tässä diplomityössä kehitetään suorituskykymittaristo Helsingin yliopiston lääketieteellisen tiedekunnan opetusohjelman uudistusprojektin seurantaan ja arviointiin. Lääketieteen opetus on murroksessa, johtuen paitsi modernin terveydenhuollon kehityksestä, myös lääkärin roolin muuttumisesta. Muutokset ovat aina häiriöksi organisaation toiminnalle ja siksi ne tulee suunnitella huolella ja toteuttaa halliten häiriön minimoimiseksi. Tässä työssä tutkitaan paitsi opetussuunnitelmien uudistusprojektien seurantaan ja arviointiin käytettäviä suorituskykymittareita, myös muutosprojektien sisäisiä ja ulkoisia taustoja ja tarkoitusperiä. Ne vaikuttavat projektin tavoitteiden asettamiseen ja niiden ymmärtäminen on siksi tärkeää. Suorituskykymittareihin ja muutosprojektien taustoihin keskittyvän kirjallisuuskatsauksen pohjalta kehitetään mittaristo Helsingin yliopiston lääketieteellisen tiedekunnan opetusohjelman uudistusprojektin seurantaan ja arviointiin. Mittareissa hyödynnetään tunnettua tasapainotettu tuloskortti -runkoa, jonka neljä näkökulmaa mukautetaan korkean asteen koulutuksen käsittelyyn. Lopputuloksena saadaan tuloskortti, jossa hyödynnetään useita eri palaute- ja arviointikanavia sekä useita uusia metriikoita

The effect of estradiol, testosterone, and human chorionic gonadotropin on the proliferation of Schwann cells with NF1 +/− or NF1 −/− genotype derived from human cutaneous neurofibromas

Dermal neurofibromas are the hallmarks of neurofibromatosis type 1 (NF1). Neurofibromas harbor Schwann cells with two different genotypes: Schwann cells which carry the germline mutation and a healthy NF1 allele (NF1 +/−), and a subpopulation of Schwann cells which harbor the so-called second hit leading to inactivation of both NF1 alleles (NF1 −/−). The second hit in the NF1 gene of Schwann cells is considered to be the initial step in the development of neurofibromas. Dermal neurofibromas typically start to grow in puberty, and their number and size increase during pregnancy, indicating hormone responsiveness. This is the first study to address the effect of human chorionic gonadotropin (hCG) on the proliferation of human NF1 +/− and NF1 −/− Schwann cells in vitro. In addition, the effects of estradiol and testosterone were also investigated. The results showed that NF1 −/− Schwann cells were more sensitive to estradiol, testosterone, and human chorionic gonadotropin than NF1 +/− cells. Specifically, the proliferation of NF1 −/− Schwann cells was increased by up to 99, 110, and 170% compared to vehicle control when treated with estradiol, testosterone, and hCG, respectively. Interestingly, no effect of estradiol, testosterone, or hCG on the proliferation of the cells with NF1 +/− genotype was observed. To conclude, the somatic second hit in the NF1 gene sensitizes Schwann cells to sex hormones resulting in a highly increased proliferation. Our results highlight the significance of sex hormones in the regulation of neurofibroma growth.</p

Circulating free DNA in the plasma of individuals with neurofibromatosis type 1

Neurofibromatosis type 1 (NF1) is an autosomal dominant syndrome whose characteristic manifestations include benign neurofibromas, yet NF1 is also associated with a high risk of cancer. Measurements of circulating free plasma DNA (cfDNA) are gaining wider applicability in cancer diagnostics, targeting of therapy, and monitoring of therapeutic response. Individuals with NF1 are likely to be followed up using this method, but the effects of NF1 and neurofibromas on cfDNA levels are not known. We studied peripheral blood samples from 19 adults with NF1 and 12 healthy controls. The cfDNA was isolated from plasma with QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit and quantified using the Qubit 2.0 Fluorometer. The cfDNA concentration of each sample was normalized relative to the plasma protein concentration. The normalized median concentration of cfDNA in plasma was 19.3 ng/ml (range 6.6–78.6) among individuals with NF1 and 15.9 ng/ml (range 4.8–47.0) among controls (p = .369). Individuals with NF1 who also had plexiform neurofibroma (pNF) showed non‐significantly elevated cfDNA concentration compared to individuals with NF1 and without known pNF (median 25.4 vs. 18.8 ng/ml, p = .122). The effect of NF1 on cfDNA seems to be relatively small and NF1 is therefore unlikely to hamper the use of cfDNA‐based assays.</p

Signaling pathways in human osteoclasts differentiation: ERK1/2 as a key player

Little is known about the signaling pathways involved in the differentiation of human osteoclasts. The present study evaluated the roles of the Ras/PI3K/Akt/mTOR, Ras/Raf/MEK1/2/ERK1/2, calcium-PKC, and p38 signaling pathways in human osteoclast differentiation. Mononuclear cells were isolated from the peripheral blood of control persons and patients with neurofibromatosis 1 (NF1), and the cells were differentiated into osteoclasts in the presence of signaling pathway inhibitors. Osteoclast differentiation was assessed using tartrate-resistant acid phosphatase 5B. Inhibition of most signaling pathways with chemical inhibitors decreased the number of human osteoclasts and disrupted F-actin ring formation, while the inhibition of p38 resulted in an increased number of osteoclasts, which is a finding contradictory to previous murine studies. However, the p38 inhibition did not increase the bone resorption capacity of the cells. Ras-inhibitor FTS increased osteoclastogenesis in samples from control persons, but an inhibitory effect was observed in NF1 samples. Inhibition of MEK, PI3K, and mTOR reduced markedly the number of NF1-deficient osteoclasts, but no effect was observed in control samples. Western blot analyses showed that the changes in the phosphorylation of ERK1/2 correlated with the number of osteoclasts. Our results highlight the fact that osteoclastogenesis is regulated by multiple interacting signaling pathways and emphasize that murine and human findings related to osteoclastogenesis are not necessarily equivalent.</p

Density and function of actin-microdomains in healthy and NF1 deficient osteoclasts revealed by the combined use of atomic force and stimulated emission depletion microscopy

Actin and myosins (IIA, IIB, and X) generate mechanical forces in osteoclasts that drive functions such as migration and membrane trafficking. In neurofibromatosis, these processes are perturbed due to a mutation in neurofibromatosis type 1 (NF1) gene. This mutation leads to generation of hyperactive bone-resorbing osteoclasts that increases incidence of skeletal dysplasia e.g. early-onset osteoporosis in patients suffering from neurofibromatosis. To study the density and function of actin clusters in mutated cells we introduce a new approach for combined use of a stimulated emission depletion (STED) microscope with an atomic force microscope (AFM). We resolved actin-cores within actin-microdomains at four typical structures (podosome-belt, podosome raft, actin patches, and sealing zone) for osteoclasts cultured on bone as well as on glass. Densities of actin-cores in these structures were higher on bone than on glass, and the nearest neighbor distances were shortest in sealing zones, where also an accumulation of vesicular material was observed at their center. In NF1 deficient osteoclasts, the clustering was tighter and there was also more vesicular material accumulated inside the sealing zone. Using the STED-AFM system, we measured the condensation of the actin structures in real-time after a bone-coated cantilever was placed in contact with a differentiated osteoclast and found that the condensation of actin was initiated at 40 min, after sufficient local actin concentration was reached. A functional implication of the less dense clustering in NF1 deficient cells was that the adhesion of these cells was less specific for bone. The data and new methodologies presented here build a foundation for establishing novel actomyosin dependent mechanisms during osteoclast migration and resorption.</p

Digitaalisten palvelujen vaikutukset sosiaali- ja terveydenhuollossa

Selvityksen tavoitteena oli luoda ajantasainen kuva digipalvelujen vaikutuksista sosiaali- ja terveydenhuollossa eri toimijoiden näkökulmista. Digipalveluja hyödynnetään etenkin terveydenhuollossa, erityisesti avosairaanhoidossa asiakaspolun eri vaiheissa. Myös kotihoidossa digipalveluita hyödynnetään runsaasti. Muissa sosiaalihuollon palveluissa digipalveluja havaittiin vähemmän, erityisesti vammais- ja hoivapalveluissa. Sosiaalihuollon digipalvelut ovat myös enemmän pistemäisiä; sähköisiä hakemuksia ja lomakkeita. Digipalvelujen käyttäjät ovat pääosin tyytyväisiä palveluihin. Asiakkaille kriittistä on digipalvelujen saavutettavuus ja integraatio, etenkin jos henkilöllä on useita pitkäaikaisia sairauksia, vammoja tai toiminnanvajausta. Ammattilaisten kokemukset digipalveluista ovat osin positiivisia, mutta huolia työmäärän lisääntymisestä esiintyy. Käyttöönotoissa tulisi tehdä enemmän työtä digipalvelujen viimekätisten hyötyjen ja vaikutusten saavuttamiseksi. Palvelujärjestelmän johto kokee, että digipalvelujen vaikutusten ja vaikuttavuuden arviointia tulisi lisätä, mutta mittaaminen on haasteellista. Yksi ratkaisu on sitoa mittaaminen voimakkaammin tavoitteisiin, mikä edellyttäisi selkeämpää tavoiteasetantaa. Digipalvelujen vaikuttavuus ei juurikaan näy lainsäädännössä, ja lainsäädännössä on useita kehittämistarpeita. Lain tulkinnat aiheuttavat haasteita digipalvelujen käytölle.Tämä julkaisu on toteutettu osana valtioneuvoston selvitys- ja tutkimussuunnitelman toimeenpanoa. (tietokayttoon.fi) Julkaisun sisällöstä vastaavat tiedon tuottajat, eikä tekstisisältö välttämättä edusta valtioneuvoston näkemystä

Density and function of actin-microdomains in healthy and NF1 deficient osteoclasts revealed by the combined use of atomic force and stimulated emission depletion microscopy

n/