Specificity of time- and dose-dependent morphological endpoints in the fish embryo acute toxicity (FET) test for substances with diverse modes of action: : the search for a “fingerprint”

Acknowledgements This project has received funding from the European Union’s Horizon 2020 research and innovation program under grant agreement No 681002 (GA, art. 38.1.2). The raw data for valproic acid, acrylamide, and colchicine were provided by Katharina Brotzmann, Annika Batel, and Ann-Kathrin Lörracher, respectively. Range-finding experiments were previously also conducted by Susanna Mieck, Dr. Lisa Hanslik, and Dr. Florian Zindler. Thanks are due to Jonathan Griffiths and Christoph Gade for carefully editing parts of the manuscript. Funding Open Access funding enabled and organized by Projekt DEAL. This project has received funding from the European Union’s Horizon 2020 research and innovation program under the grand agreement No 681002.Publisher PD

Outils alternatifs à l'expérimentation animale pour l'évaluation de la toxicité des contaminants de l'environnement : lignées cellulaires et tests embryo-larvaires chez un poisson modèle le Médaka japonais, Oryzias latipes

Fish are among the most widely used aquatic model for assessing the chemicalthreat before they are placed on the European market (REACh (Registration,Evaluation, Authorization and Restriction of CHemicals)). Currently, this regulation aswell as the European directive on the protection of animals used for scientific purposes(2010/63/EU) promote the establishment of alternative methods in animal testing.These methods are intended to replace animal models whenever possible, to reducethe number of animals used in experiments and to optimize the methodology appliedto animals. This thesis aims to compare the sensitivity of two of these alternative tools,cell lines and fish embryo-larval tests, using model toxicants. Then, these tools wereused to evaluate the toxicity of environmental mixtures of pollutants: microplastics andhydrocarbons (Arabian Light oil). The model compounds (B(a)P, Cd, MMS, PCB126)valid three biomarkers: reactive oxygen species (ROS) production on fish cell lines,micronucleus assay by flow cytometry and infectious challenge on Medaka larvae andjuveniles. These biomarkers combined with chemical, biochemical and physiologicalanalyzes have assessed toxicity of environmental mixtures of hydrocarbons (aqueousextract of Arabian oil = WAF) and microplastics. WAF are toxic to fish cell lines (ERODactivity induction and genotoxicity) as well as to Medaka embryos and larvae (behavior,biometrics, EROD, genotoxicity). Fish like cells seem to be particularly susceptible toArabian Light WAF. Contamination with environmental microplastics (MP) hasrevealed a toxicity of MP-associated contaminants on cell lines and fish larvae. Theingestion of plastic particles by the larvae induced lethal and sublethal effects(biometrics, behavior and EROD). The ingestion of the plastic particles by the larvaewas confirmed by two-photon microscopy. This study assessed the sensitivity andcomplementarity of these in vitro tools for assessing hazards and risks associated withchemicals.Les poissons sont parmi les modèles aquatiques les plus utilisés pour l’évaluationdes dangers des substances chimiques avant leur mise sur le marché européen(REACh (Registration, Evaluation, Autorisation and Restriction of CHemicals)).Actuellement, cette réglementation ainsi que la directive européenne sur la protectiondes animaux utilisés à des fins scientifiques (2010/63/UE) promeuvent la mise enplace de méthodes alternatives en expérimentation animale. Ces méthodes ont pourbut de remplacer les modèles animaux chaque fois que cela est possible, de réduirele nombre d’animaux utilisés en expérimentation et d’optimiser la méthodologieappliquée aux animaux. Cette thèse vise à comparer la sensibilité de deux de cesoutils alternatifs, les lignées cellulaires et les tests embryo-larvaires poissons, enutilisant des toxiques modèles puis mettre en oeuvre ces outils pour évaluer la toxicitéde mélanges environnementaux de polluants : microplastiques et hydrocarbures(pétrole Arabian Light). Les composés modèles (B(a)P, Cd, MMS, PCB126) ont permisde valider trois biomarqueurs : la production d’espèces réactives de l’oxygène surlignées cellulaires de poissons, le test micronoyaux par cytométrie en flux et lechallenge infectieux sur larves de Médaka. Ces biomarqueurs associés à des analyseschimiques, biochimiques et physiologiques ont permis d’évaluer la toxicité demélanges environnementaux d’hydrocarbures (extrait aqueux de pétrole Arabian =WAF) et de microplastiques. Les WAF présentent une toxicité sur les lignéescellulaires de poissons (induction de l’activité EROD, génotoxicité) ainsi que surembryons et larves de Médaka (comportement, biométrie, EROD, génotoxicité). Lespoissons comme les cellules sont particulièrement sensibles au WAF de l’ArabianLight. La contamination aux microplastiques (MP) environnementaux a révélé unetoxicité des contaminants associés au MP sur les lignées cellulaires et les larves depoisson. L’ingestion de particules de plastiques par les larves a induit des effets létauxet sublétaux (biométrie, comportement et EROD). L’ingestion des particules plastiquespar les larves a été confirmée par microscopie biphotonique. Cette étude a permisd’évaluer la sensibilité et la complémentarité de ces outils in vitro pour l’évaluation desdangers et des risques associés aux substances chimiques

Alternative tools to animal testing for toxicity assessment of environmental contaminants : cell lines and embryo-larval assay in model fish Japanese Medaka, Oryzias latipes

Les poissons sont parmi les modèles aquatiques les plus utilisés pour l’évaluationdes dangers des substances chimiques avant leur mise sur le marché européen(REACh (Registration, Evaluation, Autorisation and Restriction of CHemicals)).Actuellement, cette réglementation ainsi que la directive européenne sur la protectiondes animaux utilisés à des fins scientifiques (2010/63/UE) promeuvent la mise enplace de méthodes alternatives en expérimentation animale. Ces méthodes ont pourbut de remplacer les modèles animaux chaque fois que cela est possible, de réduirele nombre d’animaux utilisés en expérimentation et d’optimiser la méthodologieappliquée aux animaux. Cette thèse vise à comparer la sensibilité de deux de cesoutils alternatifs, les lignées cellulaires et les tests embryo-larvaires poissons, enutilisant des toxiques modèles puis mettre en oeuvre ces outils pour évaluer la toxicitéde mélanges environnementaux de polluants : microplastiques et hydrocarbures(pétrole Arabian Light). Les composés modèles (B(a)P, Cd, MMS, PCB126) ont permisde valider trois biomarqueurs : la production d’espèces réactives de l’oxygène surlignées cellulaires de poissons, le test micronoyaux par cytométrie en flux et lechallenge infectieux sur larves de Médaka. Ces biomarqueurs associés à des analyseschimiques, biochimiques et physiologiques ont permis d’évaluer la toxicité demélanges environnementaux d’hydrocarbures (extrait aqueux de pétrole Arabian =WAF) et de microplastiques. Les WAF présentent une toxicité sur les lignéescellulaires de poissons (induction de l’activité EROD, génotoxicité) ainsi que surembryons et larves de Médaka (comportement, biométrie, EROD, génotoxicité). Lespoissons comme les cellules sont particulièrement sensibles au WAF de l’ArabianLight. La contamination aux microplastiques (MP) environnementaux a révélé unetoxicité des contaminants associés au MP sur les lignées cellulaires et les larves depoisson. L’ingestion de particules de plastiques par les larves a induit des effets létauxet sublétaux (biométrie, comportement et EROD). L’ingestion des particules plastiquespar les larves a été confirmée par microscopie biphotonique. Cette étude a permisd’évaluer la sensibilité et la complémentarité de ces outils in vitro pour l’évaluation desdangers et des risques associés aux substances chimiques.Fish are among the most widely used aquatic model for assessing the chemicalthreat before they are placed on the European market (REACh (Registration,Evaluation, Authorization and Restriction of CHemicals)). Currently, this regulation aswell as the European directive on the protection of animals used for scientific purposes(2010/63/EU) promote the establishment of alternative methods in animal testing.These methods are intended to replace animal models whenever possible, to reducethe number of animals used in experiments and to optimize the methodology appliedto animals. This thesis aims to compare the sensitivity of two of these alternative tools,cell lines and fish embryo-larval tests, using model toxicants. Then, these tools wereused to evaluate the toxicity of environmental mixtures of pollutants: microplastics andhydrocarbons (Arabian Light oil). The model compounds (B(a)P, Cd, MMS, PCB126)valid three biomarkers: reactive oxygen species (ROS) production on fish cell lines,micronucleus assay by flow cytometry and infectious challenge on Medaka larvae andjuveniles. These biomarkers combined with chemical, biochemical and physiologicalanalyzes have assessed toxicity of environmental mixtures of hydrocarbons (aqueousextract of Arabian oil = WAF) and microplastics. WAF are toxic to fish cell lines (ERODactivity induction and genotoxicity) as well as to Medaka embryos and larvae (behavior,biometrics, EROD, genotoxicity). Fish like cells seem to be particularly susceptible toArabian Light WAF. Contamination with environmental microplastics (MP) hasrevealed a toxicity of MP-associated contaminants on cell lines and fish larvae. Theingestion of plastic particles by the larvae induced lethal and sublethal effects(biometrics, behavior and EROD). The ingestion of the plastic particles by the larvaewas confirmed by two-photon microscopy. This study assessed the sensitivity andcomplementarity of these in vitro tools for assessing hazards and risks associated withchemicals

Usefulness of RTL-W1 and OLCAB-e3 fish cell lines and multiple endpoint measurements for toxicity evaluation of unknown or complex mixture of chemicals

International audienceFish are currently used for the assessment of chemical toxicity. The REACh regulation and the European directive on the protection of animals used for scientific purposes both recommend the use of methods other than animal testing. In view of this, fish cell lines are increasingly used to provide fast and reliable toxic and ecotoxic data on new chemicals. The sensitivity of the Rainbow trout liver cell line RTL-W1 and Japanese medaka embryos cell line OLCAB-e3 were used with different toxicity endpoints, namely cytotoxicity, EROD activity, ROS production and DNA damage for various classes of pollutants displaying different modes of action but also with complex environmental mixtures. Toxicity tests were coupled with chemical analysis to quantify the chemical concentrations in cell cultures. Differences in sensitivity were found between fish cell lines. MTT reduction assay revealed that OLCAB-e3 cells were more sensitive than RTL-W1 cells. On the contrary, RTL-W1 gave higher response levels for the Fpg-modified comet assay and ROS assay. The OLCAB-e3 cell line did not express EROD activity unlike RTL-W1. This study highlights the capacity of the two different fish cell lines to measure the toxicity of individual toxicants but also environmental mixtures. Then, results obtained here illustrate the interest of using different cell lines and toxicity endpoints to assess the toxicity of complex or unknown mixture of chemicals

Existe-t-il un transfert trophique des MP et quels sont les effets toxiques chez les larves et les juvéniles de soles ?

International audienceIntroduction En raison d’une forte pression anthropique, les zones estuariennes sont touchées par une importante pollution aux microplastiques (MP) et les espèces inféodées à ces zones y sont particulièrement exposées. L’objectif de cette étude, financée par le programme Seine-Aval, est d’évaluer les effets de MP environnementaux collectés en estuaire de Seine sur une espèce emblématique de nos côtes, la sole commune (Solea solea) à travers une exposition directe ou par voie trophique. Exposition Deux types d’expositions ont été réalisés. La première est une exposition directe de larves de sole à plusieurs plastiques industriels de différentes tailles et densités (27-35 μm et d=0.99 ; 27-32 μm et d=1.20 ; 63-75 μm et d=1.20) ainsi qu’à un cocktail d'échantillons environnementaux prélevés dans l’estuaire de la Seine (100 μm) afin de déterminer la cinétique d'ingestion et d'égestion. Pour mettre en évidence d'éventuelles différences en fonction du stade de développement, cette exposition a été réalisée avant (7 jours post éclosion, jpe), pendant (21-22 jpe) et après la métamorphose (41-42 jpe). Dans une seconde expérience, des juvéniles de sole ont été nourris avec des vers estuariens (Hediste diversicolor) préalablement exposés au MP via le sédiment. Comme précédemment les MP utilisés sont d’origines industrielles ou d'estuaire de Seine. Plusieurs marqueurs d’état de santé tels que la survie, la croissance, le comportement, le métabolisme énergétique, le système immunitaire, le système digestif ont été étudiés. Résultats Quelque soit le stade de développement, les larves ont ingérés tous les plastiques indépendamment de la taille et/ou du type et aucune différence de cinétique d'ingestion ou d'égestion n'a été mise en évidence. Pendant la métamorphose le comportement natatoire des larves de sole a été modifié : la distance parcourue est plus faible chez les larves ayant consommé des MP et pour tous les MP testés. Chez les juvéniles de soles nourris avec des vers exposés à des MP environnementaux (400 μm) ou industriels (100-250 μm) nous avons mis en évidence une modification de comportement dans le choix du sol proposé (noir ou blanc) et de couleur des individus exposés pour la concentration la plus haute et les MP enrobés de Benzo(a)Pyrène ou d’Oxybenzone. Ces observations sont indicatrices d'un stress physiologiques. Ces premiers résultats mettent en évidence les effets délétères des microplastiques lors d'expositions directes ou indirectes à différents stades de vie. Ce travail sera complété par une exposition de larves de soles pendant 1 mois à partir de l'éclosion à des copépodes (Acartia tonsa) ayant eux-mêmes été exposés à des MP

Existe-t-il un transfert trophique des MP et quels sont les effets toxiques chez les larves et les juvéniles de soles ?

International audienceIntroduction En raison d’une forte pression anthropique, les zones estuariennes sont touchées par une importante pollution aux microplastiques (MP) et les espèces inféodées à ces zones y sont particulièrement exposées. L’objectif de cette étude, financée par le programme Seine-Aval, est d’évaluer les effets de MP environnementaux collectés en estuaire de Seine sur une espèce emblématique de nos côtes, la sole commune (Solea solea) à travers une exposition directe ou par voie trophique. Exposition Deux types d’expositions ont été réalisés. La première est une exposition directe de larves de sole à plusieurs plastiques industriels de différentes tailles et densités (27-35 μm et d=0.99 ; 27-32 μm et d=1.20 ; 63-75 μm et d=1.20) ainsi qu’à un cocktail d'échantillons environnementaux prélevés dans l’estuaire de la Seine (100 μm) afin de déterminer la cinétique d'ingestion et d'égestion. Pour mettre en évidence d'éventuelles différences en fonction du stade de développement, cette exposition a été réalisée avant (7 jours post éclosion, jpe), pendant (21-22 jpe) et après la métamorphose (41-42 jpe). Dans une seconde expérience, des juvéniles de sole ont été nourris avec des vers estuariens (Hediste diversicolor) préalablement exposés au MP via le sédiment. Comme précédemment les MP utilisés sont d’origines industrielles ou d'estuaire de Seine. Plusieurs marqueurs d’état de santé tels que la survie, la croissance, le comportement, le métabolisme énergétique, le système immunitaire, le système digestif ont été étudiés. Résultats Quelque soit le stade de développement, les larves ont ingérés tous les plastiques indépendamment de la taille et/ou du type et aucune différence de cinétique d'ingestion ou d'égestion n'a été mise en évidence. Pendant la métamorphose le comportement natatoire des larves de sole a été modifié : la distance parcourue est plus faible chez les larves ayant consommé des MP et pour tous les MP testés. Chez les juvéniles de soles nourris avec des vers exposés à des MP environnementaux (400 μm) ou industriels (100-250 μm) nous avons mis en évidence une modification de comportement dans le choix du sol proposé (noir ou blanc) et de couleur des individus exposés pour la concentration la plus haute et les MP enrobés de Benzo(a)Pyrène ou d’Oxybenzone. Ces observations sont indicatrices d'un stress physiologiques. Ces premiers résultats mettent en évidence les effets délétères des microplastiques lors d'expositions directes ou indirectes à différents stades de vie. Ce travail sera complété par une exposition de larves de soles pendant 1 mois à partir de l'éclosion à des copépodes (Acartia tonsa) ayant eux-mêmes été exposés à des MP

A biomimetic hydrogel functionalized with adipose ECM components as a microenvironment for the 3D culture of human and murine adipocytes

International audienc

Environmental samples of microplastics induce significant toxic effects in fish larvae.

Microplastics (MPs) are present throughout aquatic ecosystems, and can be ingested by a wide variety of organisms. At present, the physical and chemical effects of environmental MPs on aquatic organisms are poorly documented. This study aims to examine the physiological and behavioral effects caused by fish consuming environmental microplastics at different life stages. MP samples were collected from beaches on three islands (Easter Island, Guam and Hawaii) located near the North and South gyres of the Pacific Ocean. Larvae and juveniles of Japanese Medaka were fed for 30days with three doses of MPs (0.01, 0.1 and 1% w/w in fish food) approximate to the concentrations measured in moderately and heavily contaminated ocean areas. Ingestion of MPs by medaka larvae caused (variously) death, decreased head/body ratios, increased EROD activity and DNA breaks and, alterations to swimming behavior. A diet of 0.1% MPs was the most toxic. Two-month-old juveniles fed with 0.01% MPs did not exhibit any symptoms except an increase in DNA breaks. Our results demonstrate ingestion and mainly sublethal effects of environmental MPs in early life stages of fish at realistic MP concentrations. The toxicity of microplastics varies from one sample to another, depending on polymer composition, weathering and pollutant content. This study examines the ecological consequences microplastic build-up in aquatic ecosystems, more particularly in coastal marine areas, which serve as breeding and growing grounds for a number of aquatic species