Nanocomposite polymer beads for cell detection

Circulating tumor cells (CTCs) may induce metastases when detached from the primary tumor. The numbers of these cells in blood offers a valuable prognostic indication. Magnetoresistive sensing is an attractive option for CTC counting. In this technique, cells are labeled with nancomposite polymer beads that provide the magnetic signal. Bead properties such as size and magnetic content must be optimized in order to be used as a detection tool in a magnetoresistive platform. Another important component of the platform is the magnet required for proper sensing. Both components are addressed in this work. Nanocomposite polymer beads were produced by nano-emulsion and membrane emulsification. Formulations of the oil phase comprising a mixture of aromatic monomers and iron oxide were employed. The effect of emulsifier (surfactant) concentration on bead size was studied. Formulations of polydimethilsiloxane (PDMS) with different viscosities were also prepared with nano-emulsion method resulting in colloidal beads. Polycaprolactone (PCL) beads were also synthetized by the membrane emulsification method. The beads were characterized by different techiques such as dynamic light scattering (DLS), thermogravimetric analysis (TGA) and scanning electron microscopy (SEM). Additionally, the magnet dimensions of the platform designed to detect CTCs were optimized through a COMSOL multiphysics simulation

Design of future distribution grids

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia Electrotécnica e de ComputadoresThis work presents the concept of voltage control in power distribution systems with distributed generation and electric vehicles penetration. The impact of DG and EV in the voltage supply is investigated. DG provides more power into the system, which can cause the inversion of the load flow and an increase in the voltage supply when the demand is low. EVs on the other hand are additional load in distribution systems, increasing power demand and voltage drop. Both might be a cause of voltage problems in the power supply, when no voltage control is applied. Devices such as the tap-changer transformer or the voltage regulator which were not essential in the past are now important solutions to solve voltage variation issues. In this work, several different solutions for voltage control are analyzed, both technically and economically. Overall, the results show that different strategies have different outcomes, and some solutions provide better voltage control than others. In order to have a proper solution for a system, when choosing a control strategy, it is necessary to always take into account the cable ampacity, the technical limits of each device and the costs associated with it

Exploring dynamic structures of bionanocages

Mini-ferritins also known as Dps (DNA-binding protein from starved cells) belong to the ferritin family. They are composed of 12 identical subunits forming a hollow quasi spherical structure with 9 nm outer diameter and 5 nm inner diameter. They can store up to 500 iron atoms per shell, being a vital piece in iron homeostasis. These proteins are able to oxidize Fe2+ ions using either H2O2 or O2, store it as a ferric mineral and release it in the ferrous form to the medium, when needed for various cellular processes. Dps proteins are also known to bind DNA thus protecting it from hazardous factors. In this Thesis the oligomeric states of Dps from Marinobacter (M.) hydrocarbonoclasticus were studied under different ionic strength conditions, in order to take advantage of the system for biotechnological uses. The present work has shown that the oligomerization is a dynamic process that can be controlled by the ionic strength and that the N- terminal tail is necessary for the dodecameric assembly. The DNA binding activity of Dps was also explored using DNA origami technology, which indicated that binding activity seems to occur in a wide range of pH values, being however not clear if there is a preferential binding to single or double stranded DNA. The biotechnological potential and versatility of this system to be employed as nanoreactor or a building block for the synthesis of novel enhanced supramolecular polymers were also demonstrated. The possibility to synthesise different metal nanoparticles/materials with constrained size inside the protein nanocage, using a simple procedure was proven.As mini-ferritinas também conhecidas como Dps (DNA-binding protein from starved cells) pertencem à família proteica das ferritinas. São compostas por 12 subunidades idênticas que formam uma estrutura quase esférica com cerca de 9 nm de diâmetro externo e 5 nm de diâmetro interno. Conseguem armazenar até 500 átomos de ferro por proteína, sendo uma peça vital no processo homeostático de ferro. Estas proteínas são capazes de oxidar Fe2+ através do uso de H2O2 ou O2, consequentemente são também capazes de mineralizar e libertar o ferro na sua forma ferrosa para o meio exterior, quando necessário para vários processos celulares. A Dps é também conhecida pela sua capacidade de ligar DNA e dessa forma protegê-lo de fatores nocivos. Neste trabalho os estados oligoméricos da Dps proveniente de Marinobacter (M.) hydrocarbonoclasticus foram estudados em diferentes condições de força iónica de modo a permitir a utilização biotecnológica do sistema. É evidenciado que o estado oligómerico da Dps pode ser controlado através da otimização da força iónica do tampão, e também a necessidade da existência da região N-terminal para a existência do decâmero. A atividade de ligação ao DNA foi explorada com recurso à tecnologia de DNA origami, indicando que a ligação ocorre numa gama extensa de valores de pH, não sendo clara uma preferência a cadeias simples ou duplas de DNA. O potencial biotecnológico e a versatilidade deste sistema para ser aplicado enquanto reator ou bloco de construção para a síntese de novas estruturas poliméricas supramolecurares foi também demonstrada. A possibilidade de sintetizar diferentes nanopartículas/materiais metálicos de tamanho limitado no interior da esfera proteica utilizando um procedimento simples foi provado

QUALITY EVALUATION OF 'SUNBURST' CHERRIES HARVESTED AT DIFFERENT RIPENESS STAGES .

The sweet cherry ‘Sunburst’ is highly appreciated by consumers due to its organoleptic traits. Regional producers tend to harvest cherries sooner in order to increase their profits. With the aim of understanding the consequences of this we have tested the effect of different ripeness stages at the moment of harvesting on fruit quality. Quality parameters tested included external colour (L*, a*, b*), fruit texture, total soluble solids (TSS), and titratable acidity (TA). To evaluate nutritional quality total antioxidant activity was measured too. Once again, and in agreement with results obtained in previous studies, we conclude that there is no advantage in picking less ripe cherries

Harvesting big data from residential building energy performance certificates: retrofitting and climate change mitigation insights at a regional scale

UID/AMB/04085/2019The reduction of energy consumption and the increase in energy efficiency is currently an important cornerstone of EU policy. Energy performance certificates (EPCs) were implemented as one of the tools to promote this agenda, and are used for the energy performance assessment of buildings. In this study, the characteristics of the Portuguese dwelling stock are regionally analysed using data from approximately 523,000 Portuguese residential EPCs. Furthermore, a bottom-up building typology approach is used to assess the regional energy needs impact of retrofitting actions and to estimate the heating and cooling energy performance gaps of the whole dwelling stock, as well as the potential CO2 emissions resulting from the gaps' potential offset due to increase thermal comfort. The results show that Portuguese residential buildings have very low energy performance, with windows and roofs being identified as the most energy inefficient elements. Roof retrofitting has the highest potential for the reduction of energy needs. The estimated heating and cooling energy performance gap amount to very significant percentages, due to the poor performing building stock but also very low energy consumption levels, with probable consequences for the thermal comfort of occupants. Assuming the current energy mix, carbon emissions would be 9.8 and 20.2 times higher associated with heating and cooling, respectively, if the actual final energy consumption were to match the estimated theoretical values derived from building regulation. This study demonstrates several application cases and leverages the potential of the individual EPC, increasing the detail in the dwelling stock characterization and energy performance estimation, revealing its value for energy retrofit and climate change mitigation assessments, as well as establishing the ground for future work related to building retrofits, energy efficiency measure implementation, climate change mitigation, thermal comfort, and energy poverty studies.publishersversionpublishe

Investigation of dynamic functional connectivity in cerebral small vessel disease

Tese de mestrado integrado em Engenharia Biomédica e Biofísica (Biofísica Médica e Fisiologia de Sistemas), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2020A doença dos pequenos vasos cerebrais ou Small Vessel Disease (SVD) é a principal causa de disfunção cognitiva em idosos e refere-se a um conjunto de processos patológicos e neurológicos que afetam os pequenos vasos do cérebro. As suas manifestações clínicas variam desde deficiências cognitivas, que podem levar a uma deterioração cognitiva progressiva e até demência, e incapacidades físicas, incluindo perda funcional em fases mais avançadas da doença. A neuroimagiologia é uma ferramenta essencial no diagnóstico e caracterização da SVD, em particular, a ressonância magnética funcional em repouso (rs-fMRI) já demonstrou potencial para fornecer biomarcadores da SVD, revelando interrupções da conectividade funcional (CF) em redes neuronais. No entanto, até o momento, apenas um estudo explorou as flutuações temporais da CF comumente observadas – a chamada conectividade funcional dinâmica (dFC). Em contraste com a CF, a dFC tem em consideração a natureza dinâmica da atividade cerebral, analisando-a em escalas de tempo mais rápidas de segundos a minutos. De facto, diversos estudos de dFC reportaram que esta abordagem pode fornecer uma maior compreensão das propriedades fundamentais das redes cerebrais e servir como um biomarcador de diversas doenças, uma vez que as alterações relacionadas com as mesmas nas propriedades dinâmicas da CF parecem ter origem neuronal. Deste modo, neste trabalho, o objetivo foi investigar a dFC medida por rs-fMRI em dois grupos de pacientes com SVD – do tipo esporádico (sSVD) e arteriopatia cerebral autossómica dominante com enfartes subcorticais e leucoencefalopatia (CADASIL) - em comparação com um grupo saudável. Para tal, a dFC foi estimada entre pares de regiões do cérebro em cada tempo de repetição, TR, com o método de Phase Coherence. Neste método, os padrões de dFC para todos os pontos de tempo foram obtidos calculando o alinhamento de fase entre cada par de regiões do cérebro, estimando a fase do sinal de cada ponto de tempo, em cada uma das 90 regiões do cérebro, com a transformada de Hilbert. De seguida, os padrões de dFC ao longo do tempo e de todos os sujeitos foram analisados utilizando o método Leading Eigenvector Dynamics Analysis (LEiDA), que considera apenas o autovetor principal de cada padrão de dFC obtido, reduzindo deste modo a dimensionalidade dos dados. Este vetor captura a orientação principal das fases do sinal sobre todas as áreas, onde cada elemento do mesmo representa a projeção da fase do sinal em cada área do cérebro no autovetor principal. Em seguida, o algoritmo k-médias foi aplicado a todos os autovetores principais de dFC para obter um número finito de estados de dFC, cada um representando um padrão dFC recorrente, para um k (número de estados) variável. Como este trabalho teve como objetivo explorar se existem estados de dFC que diferenciam pacientes SVD do grupo saudável, e não determinar o número ideal de estados de dFC, o número de estados foi variado de 2 a 20. Para cada k, examinámos as diferenças em termos de probabilidade de ocorrência, duração e perfis de transição dos estados de dFC entre o grupo de doentes e o grupo de controlos saudáveis. Adicionalmente, os estados de dFC foram correlacionados com sete redes neuronais de repouso comuns, nomeadamente a rede somatomotora, a rede de atenção ventral e dorsal, a rede visual, a rede frontoparietal, a rede límbica e a rede de modo padrão. Posteriormente, a fim de determinar se as alterações nas propriedades de dFC, encontradas neste trabalho, poderiam ser potenciais biomarcadores de declínio cognitivo causadas pela SVD, foi realizado uma análise de correlação entre as pontuações dos testes neuropsicológicos em quatro domínios relevantes (função executiva, velocidade de processamento, memória de trabalho e memória de longo prazo) e as propriedades de dFC dos pacientes. Do mesmo modo, uma análise de correlação entre os mapas probabilísticos dos tratos de substância branca mais frequentemente lesionados destes pacientes e as propriedades de dFC foi, também, realizada com o objetivo de determinar se as alterações nas propriedades de dFC, encontradas nos pacientes quando comparadas com o grupo saudável, poderiam estar correlacionadas com lesões estruturais dos mesmos. Quando comparado com o grupo de controlos saudáveis, o grupo de doentes apresentou uma probabilidade de ocorrência significativamente maior num estado de dFC fracamente conectado, composto por áreas clinicamente relevantes. Este estado compreende áreas dos lobos frontais e parietais e está significativamente associado a redes neuronais envolvidas na integração de informações sensoriais e processos específicos para o controlo da atenção, nomeadamente a rede somatomotora, a rede de atenção ventral e dorsal. Estas mesmas redes foram anteriormente identificadas, em estudos de CF, como afetadas em pacientes com SVD, mas também em indivíduos com deficiências cognitivas e com doença de Alzheimer. Além disso, estudos de dFC em doenças relacionadas com a SVD, como a demência e a doença de Alzheimer, relataram que os pacientes também apresentaram maiores probabilidades de ocorrência em estados fracamente e esparsamente conectados, com ausência de fortes conexões positivas e negativas. Em particular, o único estudo de dFC em SVD também descobriu que os pacientes com SVD tiveram mais ocorrências num estado fracamente conectado nas regiões do domínio sensório-motor, quando comparado ao grupo saudável. Deste modo, podendo indicar que mudanças dinâmicas na CF nestas áreas podem ser particularmente importantes para esta doença. É também importante ressaltar que as probabilidades de transição entre este estado fronto-parietal fracamente conectado para o estado de coerência global, fortemente conectado, foram significativamente correlacionadas com melhor desempenho no domínio cognitivo da velocidade de processamento. Estas descobertas estão de acordo com resultados anteriores de estudos de dFC em indivíduos com melhores e piores desempenhos cognitivos, onde indivíduos com melhores desempenhos cognitivos tiveram maior número de transições para este estado de coerência global. Da mesma forma, as probabilidades de transição do estado fortemente conectado para o estado fronto-parietal fracamente conectado, foram significativamente correlacionadas com um pior desempenho neste mesmo domínio cognitivo. De facto, défices na velocidade de processamento estão entre as primeiras e mais proeminentes manifestações cognitivas da SVD, com diversos estudos demonstrando associações entre o declínio na velocidade de processamento e medidas quantitativas de ressonância magnética. Assim, estudos futuros devem investigar com maior detalhe transições entre estes estados, de modo a determinar se alterações nesta propriedade de dFC podem ser biomarcadores do declínio cognitivo na SVD. Em relação à análise dos mapas probabilísticos dos tratos de substância branca mais frequentemente lesionados nestes pacientes, embora nenhuma correlação significativa tenha sido encontrada com as alterações nas propriedades da dFC encontradas neste trabalho, é interessante notar que vários estudos têm relatado associações entre estas lesões e o declínio cognitivo. O facto de a substância branca ser organizada no cérebro por tratos, conectando regiões cerebrais funcionais entre si, espera-se que danos a esses tratos levem a défices funcionais. Efetivamente, dois dos tratos frequentemente lesionados nestes pacientes, conectando regiões frontais, foram anteriormente relacionados com um pior desempenho cognitivo na velocidade de processamento em pacientes com SVD e demência. É, portanto, tentador sugerir que estes mesmo tratos frequentemente lesionados nos pacientes com SVD aqui estudados, poderiam ter alguma influência no pior desempenho no teste da velocidade de processamento encontrado neste estudo, que foi correlacionado com uma maior probabilidade de transição para o estado fracamente conectado, composto por regiões do lobo frontal e parietal. A compreensão dessa relação poderia ajudar a prever em quais das regiões do cérebro a patologia da substância branca causaria maiores défices funcionais, permitindo uma prevenção e terapia precoce. No geral, os nossos resultados fornecem um novo suporte de que a conectividade funcional dinâmica pode fornecer biomarcadores mais sensíveis da SVD e deste modo, futuras investigações deverão explorar o seu potencial para prever o declínio cognitivo relacionado com a mesma.Cerebral small vessel disease (SVD) is the leading contributor to cognitive dysfunction in the elderly and it refers to a set of pathological and neurological processes that affect the smallest vessels of the brain. Its clinical manifestations vary from cognitive impairments, which can lead to progressive cognitive deterioration and even dementia, and physical disabilities, including functional loss in more advanced stages. Neuroimaging is a crucial tool in the diagnosis and characterization of SVD; in particular, resting-state functional magnetic resonance imaging (rs-fMRI) has demonstrated potential to deliver sensitive biomarkers of SVD, by revealing disruptions in functional connectivity (FC) across brain networks. However, so far only one study has explored the commonly observed FC temporal fluctuations – so-called dynamic FC (dFC). Here we aim to further investigate dFC measured by rs-fMRI in two groups of patients with SVD – sporadic SVD (sSVD) and cerebral autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy (CADASIL) – compared with a healthy control group. For this purpose, dFC was estimated at each repetition time point, TR, using Phase Coherence between the BOLD signals in pairs of brain regions, and dFC patterns were then analysed over time and subjects using the Leading Eigenvector Dynamics Analysis (LEiDA) approach. Then, a finite number of dFC states, each representing a recurrent dFC pattern, was obtained by k-means clustering with varying k (number of clusters). For each k, we examined differences between SVD and healthy control groups in terms of the occurrence, duration and switching profiles of dFC states. Additionally, the correlations between each dFC state and seven common resting-state networks (RSNs) were computed. SVD patients showed a significant higher probability of a weakly connected dFC state, consisting of clinically relevant areas, when compared with healthy controls. This state comprises frontal and parietal areas and is significantly associated with the somatomotor, dorsal attention and ventral attention RSNs, which are involved in the integration of sensory information and specific processes for attention control. Further, the fact that the state is weakly connected agrees with the only previous study on dFC in SVD. Overall, our findings contribute with novel support that dFC may provide sensitive biomarkers of SVD and should be further explored in terms of its potential to predictive cognitive decline

Manipulation of cysteine cathepsins during Mycobacterium tubersulosis infection of human macrophages

Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the main causative agent of tuberculosis, is among the world’s most ancient and most successful pathogens. Its success can be attributed to its ability to avoid phagosomal destruction, survive and proliferate inside its host cells, of which the most important are the human macrophages. Besides being able to block phagosome-lysosome fusion, Mtb is able to inhibit the expression of lysosomal hydrolases, such as cathepsins. Cathepsins are a major class of lysosomal enzymes which have various functions. One in particular, cathepsin S, has been deeply implicated in peptide processing for antigen presentation, assuming in this way an important role in mediating the innate and adaptive immune responses to external invaders in the human body. In this work we analyzed a putative cathepsin gene regulation mechanism employed by Mtb, making use of miRNAs, small RNAs which post-transcriptionally regulate gene expression. The first part of this work was dedicated to unraveling the effect of Mtb in the expression of cathepsin S and the candidate regulator miRNA-106b-5p (miR-106b-5p) in the context of macrophage infection. We have determined that miR-106b-5p is up-regulated, while cathepsin S is down-regulated during Mtb infection of macrophages, in contrast with the non-pathogenic M. smegmatis which seems to have no effect in either. Bioinformatics data point out that the cathepsin S gene (CtsS) is a target for miR-106b-5p. As such, in the second part of this thesis we experimentally tested this hypothesis. First, the transfection of THP-1 cell line with miR-106b-5p mimics resulted in a decrease of cathepsin S, but not as exacerbated as we expected. The same effect has been reported for proteins that were shown to be very stable along time. Secondly, by using luciferase expression vectors and subsequent luciferase activity assays, we showed that the mRNA of CtsS is indeed a target for miR-106b-5p. Altogether, our results indicate that Mtb inhibits cathepsin S expression via miR-106b-5p up-regulation, during macrophage infection.A tuberculose é uma doença infecciosa que atormenta a humanidade desde há cerca de 9000 anos. A partir do século XVII, com a industrialização da sociedade e a concentração das pessoas em áreas urbanas, a tuberculose atingiu proporções catastróficas e transformou-se num verdadeiro flagelo, tornando-se numa das principais causas de morte na Europa. Ao longo dos tempos foi ganhando diferentes nomes, tais como tísica pulmonar, ou peste branca. Por ser uma doença tão devastadora e não ter ainda uma cura nessa época, a tuberculose era frequentemente abrangida e descrita em obras de arte e literatura como uma força inescapável do destino, semelhante à própria Morte. Com a descoberta do agente etiológico da doença, bem como o aparecimento dos antibióticos e o melhoramento da higiene e condições sanitárias, a incidência e mortalidade atribuídas à tuberculose começaram a declinar, e a doença foi sendo mantida sob controlo durante o século XX. No entanto, em 1992, a Organização Mundial de Saúde (OMS) declarou o ressurgimento da tuberculose como uma das doenças mais alarmantes a nível mundial: o surgimento e prevalência de estirpes com diversas formas de multi-resistência a antibióticos, e o consórcio oportunista entre o Mycobacterium tuberculosis e o vírus da imunodeficiência humana (VIH), foram as principais causas apontadas para este ressurgimento. Actualmente, a tuberculose é uma das doenças, associada a um agente patológico, que mais mortes causa no mundo; apenas em 2011, 8.7 milhões de pessoas contraíram a doença e 1.4 milhões morreram da doença. O primeiro agente etiológico da tuberculose a ser descoberto, no século XIX, foi o Mycobacterium tuberculosis, um ser procariota pertencente ao filo Actinobacteria. Mais tarde, 6 outras espécies do género Mycobacterium foram identificadas como igualmente capazes de causar a doença em humanos, e hoje integram um grupo designado por complexo Mycobacterium tuberculosis (CMTB); ainda assim, M. tuberculosis é o mais comum agente da doença a nível mundial. O género Mycobacterium, compreende maioritariamente espécies inofensivas e saprófitas, contendo apenas um pequeno número de espécies patogénicas, de entre as quais se pode listar M. leprae e M. ulcerans, agentes causadores da lepra e da úlcera de Buruli respectivamente, para além de M. tuberculosis. As micobactérias do CMTB estão entre os patogénios mais bem sucedidos do mundo. Grande parte deste sucesso pode atribuír-se à sua capacidade de conseguirem sobreviver dentro dos macrófagos humanos após terem sido fagocitadas. No processo geral de fagocitose em que o conteúdo internalizado é digerido, a maturação do fagossoma consiste numa série de fissões e fusões parciais do organelo com outros, em diferentes estádios de maturação com trocas parciais de componentes membranares e do lúmen. Estes fenómenos ocorrem durante o tráfego celular da periferia da célula até à região perinuclear onde existem os lisossomas funcionais e ao longo de elementos do citoesqueleto. Durante o transporte o fagossoma vai maturando, isto é, torna-se competente para fundir com o lisossoma, fusão essa da qual resulta o fagolisossoma, vesícula que contém enzimas hidrolíticas num lúmen acidificado a pH aproximadamente igual a 5, ambiente que proporciona uma forte digestão dos seus conteúdos. O M. tuberculosis e espécies aparentadas conseguem bloquear a maturação do fagossoma e desse modo controlar o seu próprio destino intracelular; estão descritos diversos mecanismos através dos quais estas micobactérias conseguem subverter as etapas da fagocitose em seu favor, e também impedir a sua morte intracelular por apoptose do macrófago infectado, originando uma resposta imunitária exacerbada e desregulada que, em última análise, origina os próprios sintomas da doença. Porém, na maior parte dos casos, e tratando-se de indivíduos à partida saudáveis e imunocompetentes, o sistema imunitário é capaz de controlar a infecção, confinando as bactérias em estruturas histológicas pulmonares denominadas granulomas; deste modo, diz-se que há uma infecção latente, em que a bactéria está viva e dentro do organismo, mas não causa sintomas de doença. Vários factores, tanto fisiológicos como imunitários, podem então desencadear o desenvolvimento de tuberculose activa a partir de uma infecção latente, ou então fazer com que a infecção primária origine imediatamente uma situação de doença activa. A nível sub-celular, o lisossoma contém vários tipos de enzimas hidrolíticas, de entre as quais se destaca um grupo de proteases denominadas catepsinas. Estas hidrolases lisossomais não só actuam na degradação de proteínas e processamento de péptidos para apresentação de antigénios como contribuem para a remodelação da matriz extracelular e para a reabsorção óssea. A maior parte das catepsinas são proteases de cisteína (catepsinas B, C, F, H, K, L, O, S, V, X e W), sendo duas delas proteases de serina (catepsinas A e G) e outras duas proteases de aspartato (catepsinas D e E). Os microRNAs (miRNAs) são pequenas moléculas de RNA em cadeia simples, compostas por cerca de 22 nucleótidos, que possuem funções de regulação da expressão genética a nível pós-transcricional. Até há cerca de três décadas atrás, o Dogma Central da Biologia estava bem estabelecido: segundo este, DNA origina RNA, e RNA origina proteínas, atribuindo ao RNA um papel simples, intermediário e passivo. A descoberta dos primeiros miRNAs veio revolucionar esta visão e modernizar o pensamento científico em genética, introduzindo pela primeira vez o conceito de um tipo de RNA com funções regulatórias. A biogénese e maturação dos miRNAs é complexa, envolvendo várias etapas de processamento e modificação, desde que são transcritos do genoma até se tornarem maduros e funcionais. Os miRNAs maduros encontram-se associados ao complexo silenciador induzido por miRNA (miRISC), e é nesta forma que exercem a sua função: os miRNAs possuem afinidade para uma sequência de 7-8 nucleótidos contida na região não traduzida a 3’ (3’-UTR) do mRNA dos seus genes alvo, e ao se ligarem ao mRNA através desta sequência, por complementaridade total ou parcial de bases, impedem que ele seja traduzido pelos ribossomas, provocando a sua degradação, ou destabilizando a sua estrutura molecular. O objectivo deste trabalho é investigar uma relação causal entre a infecção de macrófagos humanos por M. tuberculosis, miRNAs, e catepsinas. A catepsina S, uma protease de cisteína, tem sido fortemente implicada no processamento peptídico para apresentação de antigénios através do complexo principal de histocompatibilidade classe II (MHC-II); estudos anteriores já constataram a manipulação desta catepsina por Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guérin (BCG) em macrófagos, porém ainda nenhum estudo relacionado com a catepsina S foi feito em M. tuberculosis. Também, experiências preliminares evidenciaram que alguns miRNAs são diferencialmente expressos em macrófagos infectados com M. tuberculosis, entre os quais o miRNA-106b-5p (miR-106b-5p). Por análise bioinformática foi possível prever que o gene da catepsina S humana (CtsS) é um potencial alvo para o miR-106b-5p; deste modo, a hipótese de um modelo de regulação génica, durante a infecção, baseado na manipulação do miR-106b-5p e consequente alteração da expressão de CtsS, pode ser explorada. Na primeira parte do trabalho explorámos a existência ou não de associações entre M. tuberculosis e CtsS, e entre M. tuberculosis e o miR-106b-5p, no contexto da infecção. Numa triagem preliminar, usámos uma biblioteca de lentivírus para silenciar macrófagos, diferenciados a partir de células monocíticas da linha celular THP-1, para as diferentes catepsinas. As linhas celulares slenciadas para cada catepsina foram então infectadas com a espécie não patogénica M. smegmatis, e a sobrevivência intracelular das bactérias foi analisada através do método das unidades formadoras de colónias (CFUs). Os resultados mostram que várias catepsinas, incluindo a catepsina S, possuem um efeito bactericida induzindo a morte intracelular de M. smegmatis. De todas as catepsinas testadas procedemos a um estudo dirigido à função da catepsina S no contexto da infecção por um patogénio, o M. tuberculosis, e, no seguimento dos dados bioinformáticos que indicavam uma potencial regulação da catepsina S pelo miR-106b-5p, observámos que a expressão de catepsina S em macrófagos infectados com M. tuberculosis é marcadamente reduzida em comparação com macrófagos não infectados ou infectados com M. smegmatis. Estabelecemos ainda a relação com a expressão genética do miR-106b-5p que em macrófagos infectados com M. tuberculosis está claramente sobre-expresso, comparativamente com os infectados com M. smegmatis. Concluímos que os mecanismos de virulência do M. tuberculosis controlam o aumento na expressão genética do miR-106b-5p, acompanhado de uma redução da quantidade de proteína da catepsina S, durante a infecção em macrófagos humanos. Em seguida procurámos averiguar experimentalmente os dados bioinformáticos preditivos que obtivemos para o miR-106b-5p, ou seja, se o mRNA CtsS é realmente um alvo para este miRNA. Transfectámos macrófagos humanos com mimetizadores do miR-106b-5p para exacerbar o efeito do miRNA e avaliar os efeitos na quantidade de catepsina S. Os resultados mostram uma redução na quantidade de proteína catepsina S em macrófagos transfectados com os mimetizadores que não é muito exacerbada, mas que existe; o mesmo tipo de efeito tem sido reportado quando as proteínas celulares são estáveis, não se esperando valores diferenciais maiores que 20%. De seguida demonstrámos o efeito do miR-106b-5p sobre o seu alvo putativo, o mRNA do gene CtsS. Para estas experiências foram usados vectores plasmídicos produtores de luciferase, dentro dos quais foi clonado um fragmento da 3’-UTR do gene CtsS contendo uma cópia da sequência alvo do miR-106b-5p; este fragmento foi inserido a jusante do gene da luciferase no vector, e desse modo, ao ser transcrito, o mRNA do gene da luciferase irá também conter o fragmento clonado. Os vectores recombinantes obtidos desta forma foram então transfectados para células da linha HEK 293T juntamente com mimetizadores do miR-106b-5p; posteriormente, estas células foram lisadas para ser realizado um ensaio de leitura da actividade da luciferase nestas condições. Os resultados que obtivemos indicam uma redução da actividade da luciferase na presença do mimetizador do miR-106b-5p, em comparação com o controlo em que se transfectou com o vector mas sem o mimetizador. Uma redução na actividade da luciferase nestas condições significa que o mimetizador bloqueou a tradução do mRNA do gene da luciferase, fazendo com que este não fosse traduzido para proteína; sendo assim, com esta experiência foi possível concluir que o gene CtsS humano é um alvo para a regulação genética mediada pelo miR-106b-5p. O trabalho reflectido nesta tese permitiu-nos esclarecer os alicerces principais do modelo inicialmente proposto: determinámos que, durante a infecção em macrófagos, M. tuberculosis provoca um aumento na expressão do miR-106b-5p e uma diminuição na expressão da catepsina S. Demonstrámos que o mRNA CtsS é um alvo para o miR-106b-5p, e que a redução da catepsina S durante a infecção se deve, pelo menos em parte, à acção regulatória do miR-106b-5p, que se encontra sobre-expresso. Deste modo contribuímos para decifrar parte da complexidade de mecanismos que as micobactérias do CMTB realizam para sobreviverem dentro do seu hospedeiro humano

Promoção do desenvolvimento psicossocial de crianças e jovens com necessidades educativas especiais

Dissertação de mest., Psicologia, Faculdade de Ciências Humanas e Sociais, Univ. do Algarve, 2009A presente dissertação resulta da investigação feita junto de 90 alunos do Agrupamento de Escola Dr. António Francisco Colaço de Castro Verde, 60 dos quais sem necessidades educativas especiais e 30 alunos com necessidades educativas especiais, inquiridos através da aplicação de dois questionários, o que perfez um total de 120 questionários aplicados. O primeiro questionário aplicado, Questionário de Identificação das Práticas Recreativas e de Lazer na Infância (Q.I.P.R.L.I.), foi dividido em três partes distintas: Identificação, Contexto Escolar e Contexto Familiar e Social, e procurou identificar e avaliar as práticas recreativas e de lazer em contexto escolar, social e familiar. O segundo questionário, Self Perception Profile for Children de Harter, (S.P.P.C. de S. Harter), foi adaptado à população portuguesa, crianças e pré-adolescentes, para avaliação do auto-conceito físico. Esta investigação permitiu identificar e comparar o tipo de actividades recreativas e de lazer das crianças e jovens com e sem necessidades educativas especiais, traduzindo, concomitantemente, que a prática de actividades recreativas e de lazer são um bom motor de integração, aceitação social e desenvolvimento psicossocial. O facto das crianças e jovens praticarem actividades recreativas e de lazer em contexto social e escolar, promove-lhes o auto-conceito e o desenvolvimento psicossocial, proporcionando uma melhor integração e aceitação no caso das crianças com necessidades educativas especiais

EFFECT OF DIFFERENT STORAGE CONDITIONS ON NUTRITIONAL AND QUALITY PARAMETERS OF 'SWEETHEART' CHERRY.

Abstract The sweet cherry ‘Sweetheart’, although having a short shelf life, is highly appreciated by consumers due to its organoleptic characteristics. Different storage methods were tested to study the maintenance of quality during a period of 27 days: 1) cold (air at 1°C and 95% relative humidity) (CC), 2) cold and polypropylene film bags (1°C and 95% relative humidity) (MA) and 3) cold and controlled atmosphere (1°C, 95% RH, 10% CO2 and 8% O2) (CA). Quality parameters tested included external colour (L*, a*, b*), total soluble solids (TSS), and titratable acidity (TA). To evaluate nutritional quality anthocyanins, total antioxidant activity, and total phenolics were measured. Results allow us to say that phenolic compounds were relatively stable and similar during storage in CC and MA. Cherries stored under CA conditions presented lowest concentrations of phenolic compounds. Phenolic compounds, total anthocyanins and antioxidant activity were inversely correlated with values of colour coordinates. Considering all the evaluations done during this work it is unquestionable that fruits stored in controlled atmosphere conditions had significantly different quality