Biological roles of Schistosoma mansoni Histone deacetylase 8

La schistosomiase est la seconde endémie parasitaire mondiale après le paludisme puisqu’en 2016, environ 200 millions de personnes ont été traitées pour cette parasitose. Plusieurs espèces de schistosomes peuvent être la cause de cette maladie dont Schistosoma mansoni, responsable de la schistosomiase intestinale. Son cycle de vie est complexe et comprend deux hôtes : un hôte définitif vertébré, l’Humain et un hôte intermédiaire qui est un mollusque d’eau douce. Actuellement, un seul médicament, le praziquantel, est utilisé contre toutes les espèces de schistosomes, mais son utilisation de façon massive et répétée à favoriser l’émergence de souches parasitaire tolérantes et/ou résistantes. La nécessité de trouver de nouveaux médicaments et de nouveaux traitements est donc devenue impérative.Les lysines désacétylases ou KDAC(s) constituent des cibles thérapeutiques intéressantes, notamment parce que ce sont des enzymes impliquées dans des processus cellulaires essentiels tels que la régulation de l'expression des gènes et du cycle cellulaire, ou encore la différenciation cellulaire. À ce jour, des inhibiteurs de KDAC(s) sont déjà approuvés dans le traitement du cancer et d’autres sont en essais cliniques.Chez S. mansoni, trois KDAC(s) de classe I ont été identifiées: HDAC 1, 3 et 8. D'autre part, l'utilisation d'inhibiteurs de KDAC(s) a démontré qu'il était possible d'induire l'apoptose et la mort des parasites en culture. Des études réalisées sur la protéine HDAC8 humaine et SmHDAC8 ont montré qu'il existait des différences significatives au niveau de la poche catalytique entre ces deux protéines. Ces données soulignent l’intérêt de développer des inhibiteurs sélectifs de SmHDAC8. Il est devenu, néanmoins essentiel de déterminer le rôle de SmHDAC8 dans la biologie du parasite et notamment ses partenaires protéiques. De ce fait, la première partie de ce travail de thèse s’est focalisé sur la mise en évidence de l’interactome de l’enzyme parasitaire SmHDAC8. Par l’utilisation du système en double hybride chez la levure et de la co-immunoprécipitation couplée à la spectrométrie de masse, nous avons identifié plusieurs partenaires de SmHDAC8 qui sont impliqués dans des processus essentiels à la cellule tel que la régulation de la transcription et de la traduction, le cycle cellulaire, le métabolisme, la réparation de l’ADN, la protéolyse ou encore le transport des protéines. Parmi ces interactants, nous avons également retrouvé la GTPase SmRho1 suggérant que l’enzyme SmHDAC8 serait impliqué dans la modulation de l’organisation du cytosquelette.Dans une seconde partie, nous nous sommes donc intéresser à l’interaction entre SmHDAC8 et la SmRho1. Nous avons initialement démontré que cette interaction était bien présente chez le parasite et notamment chez les vers adultes et les schistosomules. L’acétylation de SmRho1 sur la lysine K136 a également été mise en évidence par spectrométrie de masse et nous avons aussi pu observer un effet de l’inhibition de SmHDAC8 sur l’organisation du cytosquelette d’actine chez le parasite.Deux isoformes de SmRho1 (SmRho1.1 et SmRho1.2) ont été identifiées et caractérisées. La technique du double hybride chez la levure et la co-immunoprécipitation en ovocytes de xénope, a permis de démontrer que seule SmRho1.1 pouvait interagir avec SmHDAC8. Enfin, la caractérisation des motifs d'interaction entre SmHDAC8 et SmRho1.1, par co-immunoprécipitation en ovocytes de xénope, suggère que le domaine C-terminal de SmRho1 serait impliqué dans cette interaction. Ces données sont en faveur d’un rôle potentiel de SmHDAC8 dans la modulation du cytosquelette d’actine via son interaction spécifique avec la GTPase SmRho1.1.Schistosoma mansoni is the major parasitic platyhelminth species causing intestinal schistosomiasis, for which around 200 million people are in need of treatment. The schistosome life cycle is complex and includes two hosts: a definitive mammalian host, mainly humans in the case of S. mansoni, and an intermediate snail host. Currently one drug, praziquantel, is the treatment of choice against all species of schistosomes, but tolerant/resistant strains have been isolated in endemic areas following its extensive use in mass treatment programs, as well as in laboratory studies. The need to find new drugs and new treatments is therefore imperative.Lysine deacetylases (KDACs) form a family of enzymes that are conserved in metazoans. They are attractive therapeutic targets in a variety of pathologies, particularly cancer, because they are involved in the regulation of gene transcription and several KDAC inhibitors have already been approved as drugs. Our previous studies identified and characterized three class I KDACS in Schistosoma mansoni: HDAC 1, 3 and 8. Invalidation of the transcription of SmHDAC8 by RNAi led to the impaired survival of the worms after the infection of mice, showing that it is a valid therapeutic target.The analysis of the 3D structure of SmHDAC8 by X-ray crystallography showed that the catalytic domain structure diverges significantly from that of human HDAC8 and this was exploited to identify selective inhibitors that induce apoptosis and death of the worms and are thus lead compounds for the development of novel anti-schistosomal drugs.The precise biological roles of mammalian or schistosomal HDAC8 are unknown and in order to determine why SmHDAC8 knockdown or inhibition causes apoptosis and death it is essential to study the cellular signaling pathways involving SmHDAC8. In the first part of the work described in this thesis, protein partners of SmHDAC8 were characterized by screening a yeast two-hybrid cDNA library and co-immunoprecipitation/mass spectrometry (MS) analysis. SmHDAC8 partners are involved in different processes, included transcriptional and translational regulation, cell cycle, metabolism, DNA repair, proteolysis or protein transport. Among the partners thus identified the schistosome orthologue of the human RhoAGTPase, suggesting that SmHDAC8 may be involved in the modulation of the organization of the cytoskeleton.The second part of the work focused on the interaction between SmHDAC8 and SmRho1. In adult worms and schistosomula S. mansoni, SmHDAC8 interacts with SmRho1 GTPase which is acetylated on lysine K136. Treatment with an SmHDAC8 inhibitor caused massive disruption of the worm and schistosomula actin cytoskeleton. We have also identified two closely related isoforms of SmRho1 (SmRho1.1 and SmRho1.2). By using two heterologous expression systems (the yeast two hybrid assay and Xenopus oocytes), we have demonstrated a specific interaction between SmHDAC8 and SmRho1.1 involving its C-terminal moiety. Our results show that SmHDAC8 is potentially involved in cytoskeleton organization via its interaction with the SmRho1.1 isoform

Rôles biologiques de l'histone désacétylase 8 chez le parasite Schistosoma mansoni

Schistosoma mansoni is the major parasitic platyhelminth species causing intestinal schistosomiasis, for which around 200 million people are in need of treatment. The schistosome life cycle is complex and includes two hosts: a definitive mammalian host, mainly humans in the case of S. mansoni, and an intermediate snail host. Currently one drug, praziquantel, is the treatment of choice against all species of schistosomes, but tolerant/resistant strains have been isolated in endemic areas following its extensive use in mass treatment programs, as well as in laboratory studies. The need to find new drugs and new treatments is therefore imperative.Lysine deacetylases (KDACs) form a family of enzymes that are conserved in metazoans. They are attractive therapeutic targets in a variety of pathologies, particularly cancer, because they are involved in the regulation of gene transcription and several KDAC inhibitors have already been approved as drugs. Our previous studies identified and characterized three class I KDACS in Schistosoma mansoni: HDAC 1, 3 and 8. Invalidation of the transcription of SmHDAC8 by RNAi led to the impaired survival of the worms after the infection of mice, showing that it is a valid therapeutic target.The analysis of the 3D structure of SmHDAC8 by X-ray crystallography showed that the catalytic domain structure diverges significantly from that of human HDAC8 and this was exploited to identify selective inhibitors that induce apoptosis and death of the worms and are thus lead compounds for the development of novel anti-schistosomal drugs.The precise biological roles of mammalian or schistosomal HDAC8 are unknown and in order to determine why SmHDAC8 knockdown or inhibition causes apoptosis and death it is essential to study the cellular signaling pathways involving SmHDAC8. In the first part of the work described in this thesis, protein partners of SmHDAC8 were characterized by screening a yeast two-hybrid cDNA library and co-immunoprecipitation/mass spectrometry (MS) analysis. SmHDAC8 partners are involved in different processes, included transcriptional and translational regulation, cell cycle, metabolism, DNA repair, proteolysis or protein transport. Among the partners thus identified the schistosome orthologue of the human RhoAGTPase, suggesting that SmHDAC8 may be involved in the modulation of the organization of the cytoskeleton.The second part of the work focused on the interaction between SmHDAC8 and SmRho1. In adult worms and schistosomula S. mansoni, SmHDAC8 interacts with SmRho1 GTPase which is acetylated on lysine K136. Treatment with an SmHDAC8 inhibitor caused massive disruption of the worm and schistosomula actin cytoskeleton. We have also identified two closely related isoforms of SmRho1 (SmRho1.1 and SmRho1.2). By using two heterologous expression systems (the yeast two hybrid assay and Xenopus oocytes), we have demonstrated a specific interaction between SmHDAC8 and SmRho1.1 involving its C-terminal moiety. Our results show that SmHDAC8 is potentially involved in cytoskeleton organization via its interaction with the SmRho1.1 isoform.La schistosomiase est la seconde endémie parasitaire mondiale après le paludisme puisqu’en 2016, environ 200 millions de personnes ont été traitées pour cette parasitose. Plusieurs espèces de schistosomes peuvent être la cause de cette maladie dont Schistosoma mansoni, responsable de la schistosomiase intestinale. Son cycle de vie est complexe et comprend deux hôtes : un hôte définitif vertébré, l’Humain et un hôte intermédiaire qui est un mollusque d’eau douce. Actuellement, un seul médicament, le praziquantel, est utilisé contre toutes les espèces de schistosomes, mais son utilisation de façon massive et répétée à favoriser l’émergence de souches parasitaire tolérantes et/ou résistantes. La nécessité de trouver de nouveaux médicaments et de nouveaux traitements est donc devenue impérative.Les lysines désacétylases ou KDAC(s) constituent des cibles thérapeutiques intéressantes, notamment parce que ce sont des enzymes impliquées dans des processus cellulaires essentiels tels que la régulation de l'expression des gènes et du cycle cellulaire, ou encore la différenciation cellulaire. À ce jour, des inhibiteurs de KDAC(s) sont déjà approuvés dans le traitement du cancer et d’autres sont en essais cliniques.Chez S. mansoni, trois KDAC(s) de classe I ont été identifiées: HDAC 1, 3 et 8. D'autre part, l'utilisation d'inhibiteurs de KDAC(s) a démontré qu'il était possible d'induire l'apoptose et la mort des parasites en culture. Des études réalisées sur la protéine HDAC8 humaine et SmHDAC8 ont montré qu'il existait des différences significatives au niveau de la poche catalytique entre ces deux protéines. Ces données soulignent l’intérêt de développer des inhibiteurs sélectifs de SmHDAC8. Il est devenu, néanmoins essentiel de déterminer le rôle de SmHDAC8 dans la biologie du parasite et notamment ses partenaires protéiques. De ce fait, la première partie de ce travail de thèse s’est focalisé sur la mise en évidence de l’interactome de l’enzyme parasitaire SmHDAC8. Par l’utilisation du système en double hybride chez la levure et de la co-immunoprécipitation couplée à la spectrométrie de masse, nous avons identifié plusieurs partenaires de SmHDAC8 qui sont impliqués dans des processus essentiels à la cellule tel que la régulation de la transcription et de la traduction, le cycle cellulaire, le métabolisme, la réparation de l’ADN, la protéolyse ou encore le transport des protéines. Parmi ces interactants, nous avons également retrouvé la GTPase SmRho1 suggérant que l’enzyme SmHDAC8 serait impliqué dans la modulation de l’organisation du cytosquelette.Dans une seconde partie, nous nous sommes donc intéresser à l’interaction entre SmHDAC8 et la SmRho1. Nous avons initialement démontré que cette interaction était bien présente chez le parasite et notamment chez les vers adultes et les schistosomules. L’acétylation de SmRho1 sur la lysine K136 a également été mise en évidence par spectrométrie de masse et nous avons aussi pu observer un effet de l’inhibition de SmHDAC8 sur l’organisation du cytosquelette d’actine chez le parasite.Deux isoformes de SmRho1 (SmRho1.1 et SmRho1.2) ont été identifiées et caractérisées. La technique du double hybride chez la levure et la co-immunoprécipitation en ovocytes de xénope, a permis de démontrer que seule SmRho1.1 pouvait interagir avec SmHDAC8. Enfin, la caractérisation des motifs d'interaction entre SmHDAC8 et SmRho1.1, par co-immunoprécipitation en ovocytes de xénope, suggère que le domaine C-terminal de SmRho1 serait impliqué dans cette interaction. Ces données sont en faveur d’un rôle potentiel de SmHDAC8 dans la modulation du cytosquelette d’actine via son interaction spécifique avec la GTPase SmRho1.1

Analysis of the interactome of <i>Schistosoma mansoni</i> histone deacetylase 8

<div><p>Background</p><p>Histone deacetylase 8 from <i>Schistosoma mansoni</i> (<i>Sm</i>HDAC8) is essential to parasite growth and development within the mammalian host and is under investigation as a target for the development of selective inhibitors as novel schistosomicidal drugs. Although some protein substrates and protein partners of human HDAC8 have been characterized, notably indicating a role in the function of the cohesin complex, nothing is known of the partners and biological function of <i>Sm</i>HDAC8.</p><p>Methodology/Principal findings</p><p>We therefore employed two strategies to characterize the <i>Sm</i>HDAC8 interactome. We first used <i>Sm</i>HDAC8 as a bait protein in yeast two-hybrid (Y2H) screening of an <i>S</i>. <i>mansoni</i> cDNA library. This allowed the identification of 49 different sequences encoding proteins. We next performed co-immunoprecipitation (Co-IP) experiments on parasite extracts with an anti-<i>Sm</i>HDAC8 antibody. Mass spectrometry (MS) analysis allowed the identification of 160 different proteins.</p><p>Conclusions/Significance</p><p><i>Sm</i>HDAC8 partners are involved in about 40 different processes, included expected functions such as the cohesin complex, cytoskeleton organization, transcriptional and translational regulation, metabolism, DNA repair, the cell cycle, protein dephosphorylation, proteolysis, protein transport, but also some proteasome and ribosome components were detected. Our results show that <i>Sm</i>HDAC8 is a versatile deacetylase, potentially involved in both cytosolic and nuclear processes.</p></div

Histone deacetylase 8 interacts with the GTPase SmRho1 in Schistosoma mansoni

International audienceSchistosoma mansoni histone deacetylase 8 (SmHDAC8) has elicited considerable interestas a target for drug discovery. Invalidation of its transcripts by RNAi leads to impaired survivalof the worms in infected mice and its inhibition causes cell apoptosis and death. Todetermine why it is a promising therapeutic target the study of the currently unknown cellularsignaling pathways involving this enzyme is essential. Protein partners of SmHDAC8 werepreviously identified by yeast two-hybrid (Y2H) cDNA library screening and by mass spectrometry(MS) analysis. Among these partners we characterized SmRho1, the schistosomeorthologue of human RhoA GTPase, which is involved in the regulation of the cytoskeleton.In this work, we validated the interaction between SmHDAC8 and SmRho1 and exploredthe role of the lysine deacetylase in cytoskeletal regulation

Confirmation of interactions by candidate-specific Y2H experiments.

<p>In order to confirm the screening results, the isolated clones CtBP, MBD2, tensin and actin-1 (cloned into pGADT7 vector) transformed in the AH109 strain were mated with the bait construct <i>Sm</i>HDAC8 pGBKT7 transformed in the Y187 strain. After incubation, diploid yeasts were plated on selective medium lacking leucine and tryptophan (left panel) and then on another high stringency selective medium lacking adenine, histidine, leucine and tryptophan (right panel) showing, as expected, that <i>Sm</i>HDAC8 interacts with the clones tested.</p

Biological processes involving the proteins identified by Y2H and Co-IP/MS as <i>Sm</i>HDAC8 interactors.

<p>Histogram (left for Y2H and right for Co-IP/MS) showing the biological processes in which the identified protein partners of <i>Sm</i>HDAC8 are involved. The processes were defined using the Blast2GO software. Bars represent the protein percentage belonging to one biological process. Red and black bars highlight common and specific processes between Y2H and Co-IP/MS, respectively.</p

Venn diagram presenting the proteins identified by Y2H and Co-IP/MS as <i>Sm</i>HDAC8 interactors.

<p>Forty-nine and 160 different proteins were identified by Y2H and Co-IP/MS respectively. Four proteins are common between Y2H and Co-IP/MS: the Proliferation-associated protein 2G4, 38kDa (PA2G4, n°G4LXR6), Cathepsin-B1 (SmCB1, n°Q8MNY2), putative NADH-ubiquinone oxidoreductase (n°G4VK53) and microsomal glutathione <i>S</i>-transferase 3 (GST-3, n°G4VH65).</p

Not4 and Not5 modulate translation elongation by Rps7A ubiquitination, Rli1 moonlighting, and condensates that exclude eIF5A

In this work, we show that Not4 and Not5 from the Ccr4-Not complex modulate translation elongation dynamics and change ribosome A-site dwelling occupancy in a codon-dependent fashion. These codon-specific changes in not5Δ cells are very robust and independent of codon position within the mRNA, the overall mRNA codon composition, or changes of mRNA expression levels. They inversely correlate with codon-specific changes in cells depleted for eIF5A and positively correlate with those in cells depleted for ribosome-recycling factor Rli1. Not5 resides in punctate loci, co-purifies with ribosomes and Rli1, but not with eIF5A, and limits mRNA solubility. Overexpression of wild-type or non-complementing Rli1 and loss of Rps7A ubiquitination enable Not4 E3 ligase-dependent translation of polyarginine stretches. We propose that Not4 and Not5 modulate translation elongation dynamics to produce a soluble proteome by Rps7A ubiquitination, dynamic condensates that limit mRNA solubility and exclude eIF5A, and a moonlighting function of Rli1