Development of a Novel Anti-CD19 Chimeric Antigen Receptor : A Paradigm for an Affordable CAR T Cell Production at Academic Institutions

Genetically modifying autologous T cells to express an anti-CD19 chimeric antigen receptor (CAR) has shown impressive response rates for the treatment of CD19+ B cell malignancies in several clinical trials (CTs). Making this treatment available to our patients prompted us to develop a novel CART19 based on our own anti-CD19 antibody (A3B1), followed by CD8 hinge and transmembrane region, 4-1BB- and CD3z-signaling domains. We show that A3B1 CAR T cells are highly cytotoxic and specific against CD19+ cells in vitro, inducing secretion of pro-inflammatory cytokines and CAR T cell proliferation. In vivo, A3B1 CAR T cells are able to fully control disease progression in an NOD.Cg-Prkdc Il2rd/SzJ (NSG) xenograph B-ALL mouse model. Based on the pre-clinical data, we conclude that our CART19 is clearly functional against CD19+ cells, to a level similar to other CAR19s currently being used in the clinic. Concurrently, we describe the implementation of our CAR T cell production system, using lentiviral vector and CliniMACS Prodigy, within a medium-sized academic institution. The results of the validation phase show our system is robust and reproducible, while maintaining a low cost that is affordable for academic institutions. Our model can serve as a paradigm for similar institutions, and it may help to make CAR T cell treatment available to all patients

Development of a novel anti-CD19 chimeric antigen receptor: A paradigm for an affordable CAR T cell production at academic institutions

Genetically modifying autologous T cells to express an anti-CD19 chimeric antigen receptor (CAR) has shown impressive response rates for the treatment of CD19+ B cell malignancies in several clinical trials (CTs). Making this treatment available to our patients prompted us to develop a novel CART19 based on our own anti-CD19 antibody (A3B1), followed by CD8 hinge and transmembrane region, 4-1BB- and CD3z-signaling domains. We show that A3B1 CAR T cells are highly cytotoxic and specific against CD19+ cells in vitro, inducing secretion of pro-inflammatory cytokines and CAR T cell proliferation. In vivo, A3B1 CAR T cells are able to fully control disease progression in an NOD.Cg-Prkdcscid Il2rdtm1Wjl/SzJ (NSG) xenograph B-ALL mouse model. Based on the pre-clinical data, we conclude that our CART19 is clearly functional against CD19+ cells, to a level similar to other CAR19s currently being used in the clinic. Concurrently, we describe the implementation of our CAR T cell production system, using lentiviral vector and CliniMACS Prodigy, within a medium-sized academic institution. The results of the validation phase show our system is robust and reproducible, while maintaining a low cost that is affordable for academic institutions. Our model can serve as a paradigm for similar institutions, and it may help to make CAR T cell treatment available to all patients

Inmunoterapia dirigida: estudio preclínico de la eficacia anti-tumoral de CAR-T y CAR-CB-NK para el tratamiento de neoplasias hematológicas de célula B madura

Programa de Doctorat en Biomedicina / Tesi realitzada a l'Institut d’Investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer (IDIBAPS)[spa] El cáncer es definido como el crecimiento anormal de un grupo de células debido a anomalías en los circuitos de regulación que lideran la proliferación y homeóstasis de las células sanas. Las neoplasias hematológicas son generalmente enfermedades de gente de edad avanzada siendo la media entre los 65 y 70 años. El aumento de la esperanza de vida en los países desarrollados incrementará no solo el número de pacientes sino también de mayor edad con enfermedades hematológicas en los próximos años. Las neoplasias hematológicas de células B, en concreto el mieloma múltiple (MM) y el linfoma no Hodgkin (LNH) de célula B son enfermedades incurables o con un mal pronóstico después de una primera recaída, respectivamente. Este hecho pone de manifiesto la necesidad de invertir en nuevas terapias que den más opciones de tratamiento a estos pacientes. En los últimos años, la inmunoterapia se ha desarrollado exponencialmente dando lugar a nuevos tratamientos para distintas enfermedades. En concreto, la terapia CAR basada en la modificación genética de los linfocitos T para que expresen en su membrana un receptor antigénico quimérico (Chimeric Antigen Receptor, CARs por sus siglas en inglés) se ha posicionado como una nueva terapia con grandes resultados en neoplasias hematológicas, especialmente el CAR-antiCD19 para la leucemia linfoide aguda (LLA). Los CARs reconocerán específicamente un antígeno tumoral y ejercerán una respuesta citotóxica frente a las células tumorales que presenten ese antígeno. Sin embargo, uno de los principales problemas de esta terapia es la pérdida temprana del CAR produciendo recaídas de la enfermedad, que podría deberse a la reacción inmunológica frente a los CARs de origen murino. Además, los linfocitos T autólogos tras las varias líneas de tratamiento que reciben los pacientes, pueden no estar en condiciones óptimas para la terapia CAR. Recientemente han aparecido las células NK como fuente alternativa de células inmunes en la terapia CAR que podrían usarse de forma universal. Sin embargo, los primeros resultados en preclínica y clínica no son los esperados, debido a la dificultad de modificar las NK y la necesidad de añadir citoquinas para su proliferación. Estudio 1: La proteína BCMA fue identificada como un antígeno muy prometedor para ser usado en la terapia CART para tratar pacientes de MM en 2013. Des de entonces, varios estudios se han ido relevando en el tiempo, permitiéndonos el diseño y desarrollo de nuestro propio CARTBCMA (ARI2) y su posterior versión humanizada para evitar la posible pérdida temprana del CAR debido a la parte murina del CAR. Todos los ensayos in vitro e in vivo han demostrado que ambos CARTs, murino (ARI2m) y humanizado (ARI2h) ejercen el mismo efecto citotóxico frente a las células tumorales de MM. Además, toda la preclínica realizada en esta tesis ha sido la base para el ensayo ensayo clínico multicéntrico para pacientes de MM con el producto ARI2h en España. Otra cuestión relevante ha sido el análisis del BCMA soluble (sBCMA) en la actividad de CARTBCMA. La enzima g-secretasa libera al medio el antígeno BCMA en su forma soluble (sBCMA), disminuyendo por tanto el BCMA presente en la membrana de las células tumorales. Varios estudios aseguran que el sBCMA no afecta a la actividad del CARTBCMA mientras que otros incluido el nuestro si hemos observado una disminución de la actividad del CARTBCMA debido al sBCMA. Por tanto, creemos que el sBCMA si afecta la actividad del CART in vitro, pero es necesario estudiar si esta inhibición del sBCMA mediante inhibidores de la g-secretasa con fármacos como DAPT conllevan a Página 4 de 4 una mejora considerable en pacientes o la inhibición debida al sBCMA solo se observa en tiempos cortos como son los ensayos in vitro. Actualmente, ya hay un ensayo clínico analizando la combinación de estos inhibidores con células CART-BCMA (NCT03502577)

Inmunoterapia dirigida: estudio preclínico de la eficacia anti-tumoral de CAR-T y CAR-CB-NK para el tratamiento de neoplasias hematológicas de célula B madura

[spa] El cáncer es definido como el crecimiento anormal de un grupo de células debido a anomalías en los circuitos de regulación que lideran la proliferación y homeóstasis de las células sanas. Las neoplasias hematológicas son generalmente enfermedades de gente de edad avanzada siendo la media entre los 65 y 70 años. El aumento de la esperanza de vida en los países desarrollados incrementará no solo el número de pacientes sino también de mayor edad con enfermedades hematológicas en los próximos años. Las neoplasias hematológicas de células B, en concreto el mieloma múltiple (MM) y el linfoma no Hodgkin (LNH) de célula B son enfermedades incurables o con un mal pronóstico después de una primera recaída, respectivamente. Este hecho pone de manifiesto la necesidad de invertir en nuevas terapias que den más opciones de tratamiento a estos pacientes. En los últimos años, la inmunoterapia se ha desarrollado exponencialmente dando lugar a nuevos tratamientos para distintas enfermedades. En concreto, la terapia CAR basada en la modificación genética de los linfocitos T para que expresen en su membrana un receptor antigénico quimérico (Chimeric Antigen Receptor, CARs por sus siglas en inglés) se ha posicionado como una nueva terapia con grandes resultados en neoplasias hematológicas, especialmente el CAR-antiCD19 para la leucemia linfoide aguda (LLA). Los CARs reconocerán específicamente un antígeno tumoral y ejercerán una respuesta citotóxica frente a las células tumorales que presenten ese antígeno. Sin embargo, uno de los principales problemas de esta terapia es la pérdida temprana del CAR produciendo recaídas de la enfermedad, que podría deberse a la reacción inmunológica frente a los CARs de origen murino. Además, los linfocitos T autólogos tras las varias líneas de tratamiento que reciben los pacientes, pueden no estar en condiciones óptimas para la terapia CAR. Recientemente han aparecido las células NK como fuente alternativa de células inmunes en la terapia CAR que podrían usarse de forma universal. Sin embargo, los primeros resultados en preclínica y clínica no son los esperados, debido a la dificultad de modificar las NK y la necesidad de añadir citoquinas para su proliferación. Estudio 1: La proteína BCMA fue identificada como un antígeno muy prometedor para ser usado en la terapia CART para tratar pacientes de MM en 2013. Des de entonces, varios estudios se han ido relevando en el tiempo, permitiéndonos el diseño y desarrollo de nuestro propio CARTBCMA (ARI2) y su posterior versión humanizada para evitar la posible pérdida temprana del CAR debido a la parte murina del CAR. Todos los ensayos in vitro e in vivo han demostrado que ambos CARTs, murino (ARI2m) y humanizado (ARI2h) ejercen el mismo efecto citotóxico frente a las células tumorales de MM. Además, toda la preclínica realizada en esta tesis ha sido la base para el ensayo ensayo clínico multicéntrico para pacientes de MM con el producto ARI2h en España. Otra cuestión relevante ha sido el análisis del BCMA soluble (sBCMA) en la actividad de CARTBCMA. La enzima g-secretasa libera al medio el antígeno BCMA en su forma soluble (sBCMA), disminuyendo por tanto el BCMA presente en la membrana de las células tumorales. Varios estudios aseguran que el sBCMA no afecta a la actividad del CARTBCMA mientras que otros incluido el nuestro si hemos observado una disminución de la actividad del CARTBCMA debido al sBCMA. Por tanto, creemos que el sBCMA si afecta la actividad del CART in vitro, pero es necesario estudiar si esta inhibición del sBCMA mediante inhibidores de la g-secretasa con fármacos como DAPT conllevan a Página 4 de 4 una mejora considerable en pacientes o la inhibición debida al sBCMA solo se observa en tiempos cortos como son los ensayos in vitro. Actualmente, ya hay un ensayo clínico analizando la combinación de estos inhibidores con células CART-BCMA (NCT03502577)

Natural Killer Cells: Angels and Devils for Immunotherapy

In recent years, the relevance of the immune system to fight cancer has led to the development of immunotherapy, including the adoptive cell transfer of immune cells, such as natural killer (NK) cells and chimeric antigen receptors (CAR)-modified T cells. The discovery of donor NK cells' anti-tumor activity in acute myeloid leukemia patients receiving allogeneic stem cell transplantation (allo-SCT) was the trigger to conduct many clinical trials infusing NK cells. Surprisingly, many of these studies did not obtain optimal results, suggesting that many different NK cell parameters combined with the best clinical protocol need to be optimized. Various parameters including the high array of activating receptors that NK cells have, the source of NK cells selected to treat patients, different cytotoxic mechanisms that NK cells activate depending on the target cell and tumor cell survival mechanisms need to be considered before choosing the best immunotherapeutic strategy using NK cells. In this review, we will discuss these parameters to help improve current strategies using NK cells in cancer therapy. Moreover, the chimeric antigen receptor (CAR) modification, which has revolutionized the concept of immunotherapy, will be discussed in the context of NK cells. Lastly, the dark side of NK cells and their involvement in inflammation will also be discussed

Engineered T cells secreting anti-BCMA T cell engagers control multiple myeloma and promote immune memory in vivo.

Multiple myeloma is the second most common hematological malignancy in adults and remains an incurable disease. B cell maturation antigen (BCMA)-directed immunotherapy, including T cells bearing chimeric antigen receptors (CARs) and systemically injected bispecific T cell engagers (TCEs), has shown remarkable clinical activity, and several products have received market approval. However, despite promising results, most patients eventually become refractory and relapse, highlighting the need for alternative strategies. Engineered T cells secreting TCE antibodies (STAb) represent a promising strategy that combines the advantages of adoptive cell therapies and bispecific antibodies. Here, we undertook a comprehensive preclinical study comparing the therapeutic potential of T cells either expressing second-generation anti-BCMA CARs (CAR-T) or secreting BCMAxCD3 TCEs (STAb-T) in a T cell-limiting experimental setting mimicking the conditions found in patients with relapsed/refractory multiple myeloma. STAb-T cells recruited T cell activity at extremely low effector-to-target ratios and were resistant to inhibition mediated by soluble BCMA released from the cell surface, resulting in enhanced cytotoxic responses and prevention of immune escape of multiple myeloma cells in vitro. These advantages led to robust expansion and persistence of STAb-T cells in vivo, generating long-lived memory BCMA-specific responses that could control multiple myeloma progression in xenograft models, outperforming traditional CAR-T cells. These promising preclinical results encourage clinical testing of the BCMA-STAb-T cell approach in relapsed/refractory multiple myeloma.Acknowledgments: We would like to thank the cell Sorting Service of the nUcleUS platform (University of Salamanca, Salamanca, Spain) for technical assistance. Funding: Financial support for this work was obtained from the Spanish Ministry of Science and innovation Mcin/Aei/10.13039/501100011033 (PiD2020- 115444GB- i00 to P.r.- n., PiD2019- 108160rB- i00 to P.M., Ple2021- 0075 to c.B., and PiD2020- 117323rB- 100 and PDc2021- 121711- 100 to l.Á.-V.), partially supported by the european regional Development Fund (erDF); the carlos iii health institute (iSciii) (Pi20/01030 to B.B., Pi19/00132 to l.S., Pi21- 01834 to P.P., Pi20/00822 to c.B., and DTS20/00089 to l.Á.-V.), partially supported by the erDF; the iSciii- ricorS within the next Generation eU program (plan de recuperación, Transformación y resilencia) (rD21/0017/0030 to B.B. and J.M.- l. and rD21/0017/0029 to P.M.); the iSciii- ciBeronc program (cB16/12/00400 to A.o.), the criS cancer Foundation (FcriS- 2021- 001 to J.M.- l. and FcriS- 2021- 0090 to l.Á.-V.), the Spanish Association Against cancer (Aecc) (PrYGn234975Mene to P.M., PrYGn211192BUen to c.B., and ProYe19084AlVA and PrYGn234844AlVA to l.Á.-V.); the Accelerator Award- cancer research UK/Airc/Aecc- incAr (GeAcc18001orF to A.o.), the Fundación “la caixa” (lcF/Pr/hr19/52160011 to P.M. and hr21- 00761 project il7r_lungcan to l.Á.-V.), the european research council (erc) (erc- Poc- 957466 to P.M.) and erc under the eU’s horizon Program (grant agreement 101100665 to P.M.), the Fundación de investigación Biomédica 12 de octubre (programa investiga 2022- 0082) to l.Á.-V.; the Fundación ramón Areces to P.P. l.D.-A. was supported by a rio hortega fellowship from the carlos iii health institute (cM20/00004). A.F. was supported by a postdoctoral fellowship from the Spanish Ministry of Science and innovation (FJc2021- 046789- i). A. Mayado was supported by the ciBeronc (PrF- 2869). A.P.- P. was supported by a grant from the Government of castilla y león (orden eDU/556/2019; Valladolid, Spain). M.G.- r. was supported by an industrial PhD ellowship from the comunidad de Madrid (inD2022/BMD- 23732). o.A.- S. was supported by a PhD fellowship from the complutense University of Madrid. c.D.-A. was supported by a PhD fellowship from the Spanish Ministry of Science and innovation (Pre2018- 083445). l.r.- P. was supported by a PhD fellowship from the immunology chair, Universidad Francisco de Vitoria/Merck. o.h. was supported by an industrial PhD fellowship from the comunidad de Madrid (inD2020/BMD- 17668). A.V. is supported by research institute hospital 12 de octubre (imas12). A.G.- o. is supported by hiGeA 2019/0123 Aie project to J.M.- l.S

Development of a novel anti-CD19 chimeric antigen receptor: A paradigm for an affordable CAR T cell production at academic institutions

Genetically modifying autologous T cells to express an anti-CD19 chimeric antigen receptor (CAR) has shown impressive response rates for the treatment of CD19+ B cell malignancies in several clinical trials (CTs). Making this treatment available to our patients prompted us to develop a novel CART19 based on our own anti-CD19 antibody (A3B1), followed by CD8 hinge and transmembrane region, 4-1BB- and CD3z-signaling domains. We show that A3B1 CAR T cells are highly cytotoxic and specific against CD19+ cells in vitro, inducing secretion of pro-inflammatory cytokines and CAR T cell proliferation. In vivo, A3B1 CAR T cells are able to fully control disease progression in an NOD.Cg-Prkdcscid Il2rdtm1Wjl/SzJ (NSG) xenograph B-ALL mouse model. Based on the pre-clinical data, we conclude that our CART19 is clearly functional against CD19+ cells, to a level similar to other CAR19s currently being used in the clinic. Concurrently, we describe the implementation of our CAR T cell production system, using lentiviral vector and CliniMACS Prodigy, within a medium-sized academic institution. The results of the validation phase show our system is robust and reproducible, while maintaining a low cost that is affordable for academic institutions. Our model can serve as a paradigm for similar institutions, and it may help to make CAR T cell treatment available to all patients