Nuevas peroxidasas de origen vegetal: aislamiento, caracterización y aplicaciones

[ES] En el trabajo realizado se estudian diferentes aspectos de la peroxidasa de la planta de lenteja (Lens culinaris), LPP, y de la peroxidasa de escoba blanca (Cytisus multiflorus), CMP, dos de las peroxidasas más activas y estables encontradas en la búsqueda sistemática de actividad peroxidasa entre residuos agrícolas abundantes en la comunidad autónoma de Castilla y León. En el Capítulo I se ha demostrado la aplicabilidad analítica de los extractos vegetales con actividad peroxidasa, sin necesidad de aislar ni purificar la enzima. Este hecho repercute de forma drástica en la simplicidad y en el coste de las aplicaciones analíticas. En este sentido se ha utilizado el extracto crudo de la planta de lenteja para la determinación del nivel de sarcosina en orina, parámetro éste que en los últimos cinco años ha generado un cierto interés, no exento de polémica, por su aparente relación con el diagnóstico precoz del cáncer de próstata. La reacción de la peroxidasa se ha llevado a cabo utilizando como sustrato una mezcla de 4-aminoantipirina (4-AAP) y ácido 2,4,6-tribromo-3-hidroxibenzoico (TBHBA) con medida espectrofotométrica de la quinonaimina producida. Esta reacción se ha acoplado a la oxidación de sarcosina con oxígeno en presencia de sarcosina oxidasa. Como resultado de la optimización de la reacción global resultante del acoplamiento, se ha propuesto un procedimiento para la determinación de sarcosina, en concentraciones adecuadas para el diagnóstico de individuos enfermos (valores típicos entre 2x10-6 y 3x10-5 M en orina de 24 h). El procedimiento propuesto se ha aplicado satisfactoriamente al análisis de muestras de orina dopadas. Dado que la mayoría de las aplicaciones conocidas de las peroxidasas se llevan a cabo con enzimas puras, en el Capítulo II se estudia y optimiza el proceso de extracción y purificación de peroxidasas vegetales, concretamente de la peroxidasa de la planta de escoba blanca. El procedimiento propuesto consta de una primera etapa de aislamiento y concentración. A continuación se separan los compuestos fenólicos (inhibidores de la actividad peroxidasa) presentes en el extracto y finalmente se lleva a cabo un procedimiento de purificación consistente en consecutivas etapas cromatográficas de interacción hidrofóbica, intercambio iónico y exclusión molecular, obteniéndose un rendimiento final del 38%. Finalmente, puesto que la estabilidad y características cinéticas de las peroxidasas pueden ser determinantes de sus potenciales aplicaciones biotecnológicas, en el Capítulo III se lleva a cabo la caracterización de la peroxidasa de escoba blanca (CMP) obtenida y purificada según el procedimiento del capítulo precedente. Se ha encontrado que dicha peroxidasa es monomérica en disolución, con una masa molecular de 55 3 kDa, que coincide con la encontrada para otras peroxidasas vegetales. Su estructura secundaria se encuentra dominada por α-hélices. Su desnaturalización térmica, estudiada por dicroísmo circular y fluorescencia intrínseca, se ajusta al modelo de dos estados y resulta ser un proceso irreversible controlado cinéticamente con una temperatura de transición de 55±2 ºC. Al igual que otras muchas peroxidasas vegetales descritas, el ciclo catalítico de CMP sigue un mecanismo de tipo ping-pong Bi Bi y presenta inactivación por sustrato suicida. Los valores de las constantes cinéticas del proceso de inactivación, así como los números de recambio calculados sugieren que CMP presenta una mayor resistencia a la inactivación por peróxido de hidrógeno que otras peroxidasas descritas, siendo por ello una potencial alternativa comercial a la peroxidasa de rábano picante (HRP) en diferentes aplicaciones biotecnológicas

Study on extraction, purification and characterization of a novel peroxidase from white Spanish broom (Cytisus multiflorus)

Peroxidases (EC 1.11.1.7) are a large group of enzymes widely distributed in the plant kingdom. The present work describes a study on the isolation, purification and some features of a novel peroxidase from white Spanish broom (Cytisus multiflorus), a tree legume very abundant in the northern half of Spain and Portugal. Optimal conditions are proposed for enzyme extraction, removal of phenolic compounds and enzyme purification by consecutive hydrophobic, ion-exchange and size-exclusion chromatographies. Peroxidase from Cytisus multiflorus (CMP) was found to have a molecular weight of 49 kDa. The spectrum of CMP showed a Soret band at 403 nm with a Rz factor of 3.3. Substrate specificity and the effect of some variables on the activity of CMP with guaiacol as cosubstrate have also been investigated.This work was partially supported by project SA052A10-2, funded by Consejería de Educación de la Junta de Castilla y León (Spain).Peer reviewe

Apoyo a la docencia práctica mediante la creación de vídeos de algunas técnicas básicas del laboratorio de química

Memoria ID-0241. Ayudas de la Universidad de Salamanca para la innovación docente, curso 2014-2015

Steady-state kinetics of Roystonea regia palm tree peroxidase

ABSTRAC

Design of remediation pilot plants for the treatment of industrial metal-bearing effluents (BIOMETAL DEMO project): Lab tests

Current research is the first part of the BIOMETAL DEMO project, funded by the European Union, focusing on the development of complementary and modular biotreatment processes for the removal of metal ions from industrial effluents (issued from mining industry, surface treatment and ceramics). Metal bio-precipitation (in form of metal sulfides and metal phosphates) using sulfate-reducing bacteria (SRB), phytase and phosphatase enzymes, biosorption using sugar-beet pulp, algal biomass and alginate- or chitosan-based composites (immobilizing polyethyleneimine derivatives by encapsulation) have been extensively studied using synthetic and industrial effluents. These preliminary results allow designing a treatment flow-sheet including pre-treatment of the effluent using biologically-assisted precipitation followed by biosorption (for mining effluents that contain sulfate anions). For surface treatment and ceramics effluents, bio-precipitation combined with biosorption processes and physicochemical pretreatment followed by biosorption process represent, respectively, a promising solution. The carbon-source for the SRB process, the optimization of process parameters and the biosorbents have been selected taking into account both the technical performance and the economic viability.European Union's Seventh Framework ProgrammeDepto. de Ingeniería Química y de MaterialesFac. de Ciencias QuímicasTRUEpu

ExoMars Raman Laser Spectrometer: A Tool for the Potential Recognition of Wet-Target Craters on Mars

In the present work, NIR, LIBS, Raman and XRD techniques have been complementarily used to carry out a comprehensive characterization of a terrestrial analogue selected from the Chesapeake Bay Impact Structure (CBIS). The obtained data clearly highlight the key role of Raman spectroscopy in the detection of minor and trace compounds, through which inferences about geological processes occurred in the CBIS can be extrapolated. Beside the use of commercial systems, further Raman analyses were performed by the Raman Laser Spectrometer (RLS) ExoMars Simulator. This instrument representsthe most reliable tool to effectively predict the scientific capabilities of the ExoMars/Raman system that will be deployed on Mars in 2021. By emulating the analytical procedures and operational restrictions established by the ExoMars mission rover design, it was proved that the RLS ExoMars Simulator is able to detect the amorphization of quartz, which constitutes an analytical clue of the impact origin of craters. On the other hand, the detection of barite and siderite, compounds crystallizing under hydrothermal conditions, helps to indirectly confirm the presence of water in impact targets. Furthermore, the RLS ExoMars Simulator capability of performing smart molecular mappings was also evaluated. According to the obtained results, the algorithms developed for its operation provide a great analytical advantage over most of the automatic analysis systems employed by commercial Raman instruments, encouraging its application for many additional scientific and commercial purposes.Proyecto MINECO Retos de la Sociedad. Ref. ESP2017-87690-C3-1-