Efeito antitumoral in vitro e in vivo de fenilaminonaftoquinonas isoladas ou em associação ao ascorbato de sódio e estudo da interação entre as proteínas MNT e CCDC6 sobre a proliferação celular

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2016.Introdução. Evidências indicam um promissor efeito antitumoral das quinonas juglona, fenilaminonaftoquinona-7 (Q7) e fenilaminonaftoquinona-9 (Q9), especialmente quando associadas ao ascorbato. Objetivo. Dar continuidade aos estudos sobre o efeito antitumoral das naftoquinonas juglona, Q7 e Q9 em associação ao ascorbato de sódio, bem como avaliar a melhor associação para o tratamento do câncer a partir dos efeitos obtidos in vitro e in vivo. Metodologia. Foram analisados os efeitos das quinonas juglona, Q7 e Q9 associadas ou não ao ascorbato de sódio sobre o CT-DNA (Calf Thymus-DNA). Em células MCF-7 (carcinoma de mama) foram avaliados a viabilidade celular, os níveis de EROs intracelular, os danos ao DNA e a proliferação celular. Proteínas oriundas dos lisados de células MCF-7 foram utilizados para os ensaios de imunoeletroforese para verificar a integridade da proteína poli (ADP-ribose) polimerase (PARP), gama-H2AX (?H2AX) e pAkt. A atividade antitumoral in vivo das quinonas associadas ou não ao ascorbato de sódio foi inicialmente analisada através de parâmetros de sobrevida e crescimento tumoral de camundongos portadores do tumor ascítico de Ehrlich. Posteriormente, amostras do tumor foram coletadas e utilizadas para análise de marcadores de estresse oxidativo como: substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), proteína carbonilada, glutationa reduzida (GSH), superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx), glutationa redutase (GR) e glutationa-S-transferase (GST). Ainda em amostras do tumor ascítico de Ehrlich foram avaliados danos ao DNA, parada do ciclo celular, influência na captação de glicose e tipo de morte celular induzida pelos tratamentos. As mesmas amostras foram utilizadas para a análise de imunoeletroforese de proteínas envolvidas no dano ao DNA e proliferação celular (?H2AX e pAkt, respectivamente), na progressão do ciclo celular (p53, p16 e ciclina A), na captação de glicose (HIF-1a e GLUT1) e proteínas envolvidas na sinalização da morte celular (PARP, Bax, Bcl-xL). Resultados. As quinonas, quando associadas ao ascorbato, causaram um aumento na intercalação e clivagem oxidativa do CT-DNA. Em células MCF-7, a associação com ascorbato diminuiu significativamente a viabilidade celular. As associações juglona/ascorbato e, principalmente Q7/ascorbato, aumentaram os níveis de EROs intracelulares e os danos ao DNA. As três associações testadas causaram diminuição no número de colônias, porém, juglona/ascorbato e Q7/ascorbato foram capazes de inibir a proteína Akt fosforilada (pAkt). Os resultados in vitro foram reproduzidos in vivo. Juglona/ascorbato e Q7/ascorbato inibiram significativamente o desenvolvimento do tumor e aumentaram o tempo de sobrevida dos animais. Os marcadores de estresse oxidativo foram alterados, indicando uma indução na geração de EROs pelos tratamentos, aumentando assim a peroxidação lipídica e a carbonilação de proteínas, danificando o DNA das células do tumor ascítico de Ehrlich e promovendo também, a parada do ciclo celular em G1/S, redução da captação de glicose e morte celular por apoptose. Conclusão. Os resultados apresentados mostraram que o ascorbato de sódio potencializou o efeito antitumoral das quinonas juglona e, principalmente da Q7, também in vivo, evidenciando que estas associações são promissores agentes para o tratamento do câncer.Abstract : Introduction. Evidences point to the promising antitumor effect of quinones juglone, phenylaminonaphthoquinone-7 (Q7) and phenylaminonaphthoquinone-9 (Q9), especially when associated to ascorbate. Objective. To continue the studies on the antitumor effect of naphthoquinones juglone, Q7 and Q9 associated with sodium ascorbate, as well as to evaluate the best association for cancer treatment from the effects obtained in vivo and in vitro. Methodology. The effects of quinones juglone, Q7 and Q9 associated or not to sodium ascorbate on Calf Thymus-DNA were analyzed. Cell viability, levels of intracellular ROS, damages on DNA and cell proliferation were evaluated in MCF-7 cells (breast carcinoma). Proteins from MCF-7 cell lysate were used in immunoblotting assays to check the integrity of poly (ADP-ribose) polymerase (PARP), gamma-H2AX (?H2AX) and pAkt. The in vivo antitumor activity of quinones associated or not with sodium ascorbate was firstly analyzed by means of survival parameters and tumor growth of mice carrying Ehrlich ascitic tumor. After that, samples of the tumor were collected and analyzed for oxidative stress markers such as: thiobarbituric acid reactive substances (TBARS), carbonylation of protein, reduced glutathione (GSH), superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx), glutathione reductase (GR) and glutathione-S-transferase (GST). Also, of Ehrlich ascitic tumor, DNA damages, cellular cycle arrest, influence in glucose capture and type of cell death induced by the treatments were evaluated. The same samples were used in immunoblotting assays of proteins involved in damage to DNA and cell proliferation (?H2AX and pAkt, respectively), cell cycle progression (p53, p16 and cyclin A) and glucose capture (HIF-1a and GLUT1) and proteins involved in cell death signaling (PARP, Bax, Bcl-xL). Results. When associated to ascorbate, quinones promoted an increase in interleaving and oxidative cleavage of CT-DNA. In MCF-7 cells, the association with ascorbate declined significantly cell viability. The associations juglone/ascorbate and, mainly Q7/ascorbate increased levels of intracellular EROs and damage to DNA. The three assessed associations promoted the decrease in the number of colonies, however, julone/ascorbate and Q7/ascorbate were able to inhibit the protein pAkt. The in vitro results were in vivo reproduced. Juglone/ascorbate and Q7/ascorbate significantly inhibited the growth of the tumor and increased survival time of the animals. The oxidative stress markers were altered pointing to an induction in the generation of ROS by these treatments, thereby increasing lipid peroxidation and protein carbonylation, damaging DNA of cells of Ehrlich ascitic tumor also promoting, cellular cycle arrest in G1/S, reduction of glucose capture and cellular death by apoptosis. Conclusion. The results presented here showed that the sodium ascorbate potentialized the antitumor effect of juglone, especially Q7, also in vivo, evidencing that those associations are promising agents for cancer treatment

Avaliação in vitro da atividade antioxidante dos carotenóides totais extraídos do músculo de camarões cultivados Litopenaeus vannamei

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Nutrição, Florianópolis, 2010Os carotenóides têm sido bastante investigados como agentes quimiopreventivos, funcionando como antioxidantes em sistemas biológicos. A astaxantina é um carotenóide do grupo das xantofilas, de ocorrência natural em algas, peixes e frutos do mar, sendo o camarão uma de suas principais fontes alimentares. Sua atividade antioxidante parece ser muito superior àquela dos demais carotenóides. No presente estudo foi avaliada a atividade antioxidante in vitro dos carotenóides totais (CT) extraídos do músculo de camarões Litopenaues vannamei cultivados em cativeiro, utilizando-se como parâmetros a medida de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), o seqüestro do radical livre 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) e a co-oxidação do ?-caroteno/ácido linoléico, utilizando-se a astaxantina sintética como padrão. Foram utilizados dois grupos de camarões: camarão controle (CC) que recebeu ração controle não suplementada, com 3 ppm de carotenóides e camarão suplementado (CS) que recebeu ração contento 60 ppm de carotenóides provenientes da alga Haematococcus pluvialis. Após 30 dias de tratamento, os camarões foram capturados, extraídos os carotenóides totais e realizada a quantificação da astaxantina. Soro e homogenato de fígados extraídos de ratos Wistar adultos foram incubados com os agentes oxidantes CuCl2 0,1 mM e 2,2´-azobis(2-amidinopropano) dihidrocloreto (AAPH) 5 mM, na presença ou ausência dos carotenóides oriundos dos camarões, nas concentrações 0, 0,25, 1,25, 2,5 e 5 ?M. Posteriormente foram realizadas as medidas de TBARS. Para a análise de DPPH utilizaram-se as concentrações de 5 e 10 ?M de carotenóides totais, enquanto que para a co-oxidação foram utilizadas as concentrações de 10 e 20 ?M de carotenóides totais. Os resultados estão expressos como média ± erro padrão da média (E.P.M.). Os dados foram analisados pela análise de variância de duas vias (ANOVA) com medidas repetidas, seguido pelo teste post-hoc de Bonferroni. O nível de significância considerado foi de P < 0,05. Nas análises de TBARS, no soro e homogenato de fígado, após a indução da oxidação com CuCl2 e AAPH observa-se que a proteção contra a lipoperoxidação dos CT extraídos do CS foi semelhante àquela obtida com a astaxantina sintética, principalmente nas concentrações mais elevadas (2,5 e 5 ?M), indicando um perfil concentração-resposta. Nas análises de co-oxidação do ?-caroteno/ácido linoléico, os CT extraídos dos camarões do grupo CC não apresentaram atividade antioxidante nas concentrações de 10 e 20 ?M, enquanto que os CT extraídos do grupo CS mostraram uma atividade antioxidante estatisticamente semelhante àquela da astaxantina sintética para ambas as concentrações testadas. Para o seqüestro do radical livre DPPH, observou-se novamente um possível efeito concentração-resposta dos CT extraídos dos grupos CC e CS, onde os CT do grupo CS apresentaram uma capacidade de seqüestrar o radical DPPH semelhante àquela da astaxantina sintética (aproximadamente 75%), apesar da diferença estatística. Ainda, os resultados da cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) indicam não haver diferença nos níveis de astaxantina nos dois grupos de camarões (CC e CS), sendo este o carotenóide majoritário nos crustáceos de ambos os grupos. Foi observada uma maior atividade antioxidante in vitro dos carotenóides extraídos dos camarões que receberam uma suplementação de astaxantina na ração (grupo CS). Neste grupo, o efeito protetor da astaxantina pode ter evitado a oxidação de ácidos graxos poliinsaturados e colesterol nos crustáceos, evitando desta forma a presença de compostos oxidados nos extratos. No grupo CC, com menor teor de astaxantina, uma maior concentração de compostos oxidados presentes nos extratos poderia estar interferindo nas análises. Os carotenóides do grupo suplementado exerceram uma maior proteção contra a lipoperoxidação no soro e homogenato de fígado de ratos, proteção contra a oxidação de um ácido graxo poliinsaturado e maior atividade no seqüestro de radicais livres. A partir destes resultados observados in vitro novos estudos devem ser conduzidos com o intuito de verificar os possíveis efeitos benéficos in vivo do consumo de alimentos que possuam astaxantina como o carotenóide majoritário, como o camarão

The MNT transcription factor autoregulates its expression and supports proliferation in MYC-associated factor X (MAX)-deficient cells

The MAX network transcriptional repressor (MNT) is an MXD family transcription factor of the basic helix-loop-helix (bHLH) family. MNT dimerizes with another transcriptional regulator, MYC-associated factor X (MAX), and down-regulates genes by binding to E-boxes. MAX also dimerizes with MYC, an oncogenic bHLH transcription factor. Upon E-box binding, the MYC-MAX dimer activates gene expression. MNT also binds to the MAX dimerization protein MLX (MLX), and MNT-MLX and MNT-MAX dimers co-exist. However, all MNT functions have been attributed to MNT-MAX dimers, and no functions of the MNT-MLX dimer have been described. MNT's biological role has been linked to its function as a MYC oncogene modulator, but little is known about its regulation. We show here that MNT localizes to the nucleus of MAX-expressing cells and that MNT-MAX dimers bind and repress the MNT promoter, an effect that depends on one of the two E-boxes on this promoter. In MAX-deficient cells, MNT was overexpressed and redistributed to the cytoplasm. Interestingly, MNT was required for cell proliferation even in the absence of MAX. We show that in MAX-deficient cells, MNT binds to MLX, but also forms homodimers. RNA-sequencing experiments revealed that MNT regulates the expression of several genes even in the absence of MAX, with many of these genes being involved in cell cycle regulation and DNA repair. Of note, MNT-MNT homodimers regulated the transcription of some genes involved in cell proliferation. The tight regulation of MNT and its functionality even without MAX suggest a major role for MNT in cell proliferation.This work was supported by Grant SAF2017-88026-R from Agencia Estatal de Investigación, Spanish Government (to J. L. and M. D. D.), funded in part by FEDER Program from the European Union, National Institutes of Health Grant CA57138/CA from NCI (to R. N. E.), and grants from Shriners Hospitals for Children (to P. J. H.). The authors declare that they have no conflicts of interest with the contents of this article. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health

Antioxidant biomarkers and food intake in elderly women.

To investigate the relationship between antioxidant biomarkers and food intake in elderly women. Design: Cross-sectional study. Setting: Recreation Center for the Elderly in the city of Itajaí, Santa Catarina, Brazil. Participants: 73 elderly women with an average age of 71 years, 93% caucasian, average body weight 68.7 ± 13.1 kg and average BMI 28.5 ± 2.3 kg/m2

Substituted 3‑acyl‑2‑phenylamino‑1,4‑naphthoquinones intercalate into DNA and cause genotoxicity through the increased generation of reactive oxygen species culminating in cell death

Naphthoquinones interact with biological systems by generating reactive oxygen species (ROS) that can damage cancer cells. The cytotoxicity and the antitumor activity of 3‑acyl‑2‑phenylamino‑1,4‑naphthoquinones (DPB1‑DPB9) were evaluated in the MCF7 human breast cancer cell line and in male Ehrlich tumor‑bearing Balb/c mice. DPB4 was the most cytotoxic derivative against MCF7 cells (EC50 15 µM) and DPB6 was the least cytotoxic one (EC50 56 µM). The 1,4‑naphthoquinone derivatives were able to cause DNA damage and promote DNA fragmentation as shown by the plasmid DNA cleavage assay (FII form). In addition, 1,4‑naphthoquinone derivatives possibly interacted with DNA as intercalating agents, which was demonstrated by the changes caused in the fluorescence of the DNA‑ethidium bromide complexes. Cell death of MCF7 cells induced by 3‑acyl‑2‑phenylamino‑1,4‑naphthoquinones was mostly due to apoptosis. The DNA fragmentation and subsequent apoptosis may be correlated to the redox potential of the 1,4‑naphthoquinone derivatives that, once present in the cell nucleus, led to the increased generation of ROS. Finally, certain 1,4‑naphthoquinone derivatives and particularly DPB4 significantly inhibited the growth of Ehrlich ascites tumors in mice (73%)

Sodium orthovanadate associated with pharmacological doses of ascorbate causes an increased generation of ROS in tumor cells that inhibits proliferation and triggers apoptosis

Pharmacological doses of ascorbate were evaluated for its ability to potentiate the toxicity of sodium orthovanadate (Na(3)VO(4)) in tumor cells. Cytotoxicity, inhibition of cell proliferation, generation of ROS and DNA fragmentation were assessed in T24 cells. Na(3)VO(4) was cytotoxic against T24 cells (EC(50)=5.8 μM at 24 h), but in the presence of ascorbate (100 μM) the EC(50) fell to 3.3 μM. Na(3)VO(4) plus ascorbate caused a strong inhibition of cell proliferation (up to 20%) and increased the generation of ROS (4-fold). Na(3)VO(4) did not directly cleave plasmid DNA, at this aspect no synergism was found occurring between Na(3)VO(4) and ascorbate once the resulting action of the combination was no greater than that of both substances administered separately. Cells from Ehrlich ascites carcinoma-bearing mice were used to determine the activity of antioxidant enzymes, the extent of the oxidative damage and the type of cell death. Na(3)VO(4) alone, or combined with ascorbate, increased catalase activity, but only Na(3)VO(4) plus ascorbate increased superoxide dismutase activity (up to 4-fold). Oxidative damage on proteins and lipids was higher due to the treatment done with Na(3)VO(4) plus ascorbate (2-3-fold). Ascorbate potentiated apoptosis in tumor cells from mice treated with Na(3)VO(4). The results indicate that pharmacological doses of ascorbate enhance the generation of ROS induced by Na(3)VO(4) in tumor cells causing inhibition of proliferation and apoptosis. Apoptosis induced by orthovanadate and ascorbate is closer related to inhibition on Bcl-xL and activation of Bax. Our data apparently rule out a mechanism of cell demise p53-dependent or related to Cdk2 impairment