Genetic analysis and virulence factors of clinical isolates of Candida albicans from patients with chronic periodontitis with diabetes mellitus type II

Orientadores: Reginaldo Bruno Gonçalves, Cristiane DuqueTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de PiracicabaResumo: Candida spp. são leveduras comensais que habitam diferentes sítios da cavidade bucal. Em indivíduos saudáveis, sem alterações imunológicas, esses microrganismos não causam doença. Entretanto, diante de condições imunossupressoras, essas leveduras podem se tornar mais virulentas e expressar patogenicidade. Espécies de Candida apresentam diversos fatores de virulência, incluindo mecanismos de adesão e invasão celular associado à produção de enzimas que auxiliam na degradação tecidual e facilitam sua proliferação na mucosa bucal. Estudos têm demonstrado a presença de Candida sp. em sítios periodontais de pacientes com periodontite crônica, principalmente quando estes são imunologicamente comprometidos. Entretanto, ainda é desconhecido o papel desses microrganismos na patogênese da doença periodontal. Os objetivos do presente trabalho foram: 1) identificar a presença de espécies de Candida e periodontopatógenos por PCR em sítios bucais de pacientes diabéticos ou não com periodontite crônica; 2) isolar cepas de Candida albicans desses pacientes e avaliá-las quanto à atividade das enzimas proteinase, fosfolipase e hemolisina e os graus de hidrofobicidade da superfície celular, sob diferentes condições atmosféricas, além de realizar a análise genotípica desses isolados; 3) avaliar a capacidade de adesão e invasão de cepas de Candida albicans com diferentes graus de hidrofobicidade, em fibroblastos gengivais humanos. As reações de PCR mostraram que os diabéticos tiveram maior prevalência de Candida spp. principalmente C. albicans e C. dubliniensis, e menor freqüência de Tannerella forsythia, quando comparado aos pacientes não diabéticos, para bolsa periodontal e furcas. C. glabrata e C. tropicalis não foram encontradas em sítios periodontais de pacientes não diabéticos. Dos pacientes diabéticos, foram isoladas 128 cepas de C. albicans, das quais 51.6% foram determinadas como genótipo B e 48.4% como genótipo A. As condições ambientais consideradas neste estudo, níveis reduzidos de oxigênio ou anaerobiose, não modificaram o tipo de hemólise realizado pelo microrganismo, sendo que a maioria das cepas foi alfa-hemolítica. Nesses ensaios, 100% das cepas em anaerobiose apresentaram as colônias rugosas, enquanto que em ambiente de oxigênio reduzido, houve variação em relação à morfologia e a maioria delas apresentou colônia lisa. Com relação à atividade de proteinase e fosfolipase, cepas de C. albicans não produziram as enzimas na ausência total de oxigênio. Em ambiente com nível reduzido de oxigênio, a maioria das cepas de C. albicans foram fortemente produtoras de proteinase e a maioria das cepas foi positiva para fosfolipase. A hidrofobicidade foi mais alta na condição de anaerobiose. A partir desses resultados, foram selecionadas 16 cepas com alta ou baixa hidrofobicidade e avaliadas quanto à capacidade de adesão e invasão em fibroblastos gengivais humanos. Foi verificado que ambos os processos foram maiores nas cepas com alta hidrofobicidade. A produção de óxido nítrico foi maior para as cepas mais hidrofóbicas. Os resultados demonstraram que as espécies de Candida podem ser encontradas, em grande proporção, em bolsas periodontais e furcas de pacientes portadores de periodontite crônica, principalmente naqueles acometidos por diabetes mellitus. A maioria das cepas de C. albicans apresentou atividade enzimática, que atuaria diretamente na degradação tecidual. Além disso, a hidrofobicidade das cepas de C. albicans mostrou estar relacionada à maior capacidade de adesão e invasão em fibroblastos. Todos esses fatores de virulência aumentam a patogenicidade da Candida, que poderia colaborar na progressão da doença periodontal, principalmente em pacientes imunodeficientesAbstract: Candida spp. are commensal yeasts that inhabit different sites of the oral cavity. In healthy subjects, without immunological alterations, these microorganisms do not cause disease. However, in immunosuppressive conditions, these yeasts can become more virulent and express pathogenicity. Candida species have different virulence factors, including mechanisms of cell adhesion and invasion associated with the production of enzymes that facilitate tissue degradation and their proliferation in oral mucosa. Studies have shown the presence of Candida spp. in periodontal sites of patients with chronic periodontitis, especially when they are immunologically compromised. However is still unknown their role in the pathogenesis of periodontal disease. The objectives of this study were: 1) to identify the presence of Candida species and putative periodontopathogens by PCR in periodontal sites of diabetic or non-diabetic patients with chronic periodontitis; 2) to isolate strains of Candida albicans in these patients and evaluate the proteinase, phospholipase and haemolysin activities and degrees of cell surface hydrophobicity under different atmospheric conditions, besides to performe the genotypic analysis of these isolates; 3) to evaluate the ability of adhesion and invasion of Candida albicans strains with different degrees of hydrophobicity, in human gingival fibroblasts. The PCR reactions revealed that diabetics had higher prevalence of Candida spp., mainly C. albicans and C. dubliniensis, and lower T. forsythia frequency, when compared to non-diabetic patients, for both periodontal sites. C. glabrata and C. tropicalis were not found in periodontal pockets and furcation sites of non-diabetic patients. From diabetic patients, it was isolated 128 strains of C. albicans and 51.6% were determined as genotype B and 48.4% as genotype A. The atmospheric conditions, reduced oxygen and anaerobiosis, did not change the type of hemolysis, and the most of strains were alpha-hemolytic. From these assays, 100% of the strains under anaerobiosis showed rough colonies, whereas in an environment with reduced oxyen was no change in relation to morphology and most of them had smooth colony. Considering proteinase and phospholipase activities, C. albicans strains did not produce the enzymes in the total absence of oxygen. In reduced oxygen, the majority of C. albicans strains were strong proteinase producers and most strains were positive for phospholipase. Hydrophobicity was higher in anaerobic condition. From these results, 16 hydrophobic or hydrophilic strains were selected and evaluated their ability of adhesion and invasion in human gingival fibroblasts. Both processes were greater in strains with high hydrophobicity. The production of nitric oxide was higher for hydrophobic strains. The results showed that Candida species can be found in large proportion, in periodontal pockets and furcation of patients with chronic periodontitis, especially diabetics. The most of C. albicans strains showed enzymatic activity, which could act directly on tissue degradation. Moreover, the hydrophobicity of C. albicans seems to be related to higher capacity of adhesion and invasion in fibroblasts. All these virulence factors enhance the pathogenicity of Candida that could collaborate for the progression of periodontal diseaseDoutoradoMicrobiologia e ImunologiaDoutor em Biologia Buco-Denta

Conventional and alternative antifungal therapies to oral candidiasis

Candida-associated denture stomatitis is the most common form of oral candidal infection, with Candida albicans being the principal etiological agent. Candida adheres directly or via an intermediary layer of plaque-forming bacteria to denture acrylic. Despite antifungal therapy to treat denture stomatitis, infection is reestablished soon after the treatment ceases. In addition, many predisposing factors have been identified as important in the development of oral candidiasis, including malnourishment, common endocrine disorders, such as diabetis mellitus, antibacterial drug therapy, corticosteroids, radiotherapy and other immunocompromised conditions, such as acquired immunodeficiency syndrome (AIDS). These often results in increased tolerance to the most commonly used antifungals. So this review suggests new therapies to oral candidiasis.82483

Processamento de Cucurbita maxima: uma análise sobre seu rendimento / Cucurbita maxima processing: an analysis of its yield

As abóboras são pertencentes a uma vasta família denominada Cucurbitaceae, que contém mais de 120 gêneros. O Brasil é considerado o país que produz abóboras em maior escala, em especial as do gênero Cucurbita sp. Estas constituem inestimável importância social, tanto no provimento de novos empregos, quanto suas contribuições nutricionais como propriedades antioxidantes, anti-helmínticas, antimicrobianas, antidiabéticas, anticoagulantes, anti-hipertensivas, além de ser um componente bastante visado para realização de pesquisas científicas. A Cucurbita maxima objeto deste estudo, é também conhecida popularmente como “abóbora-moranga”, no qual possui o atributo do vantajoso desenvolvimento diante de diversas condições do solo, clima, umidade, estando dentre os dez vegetais mais cultivados em regiões que contem clima temperado e subtropical. O presente estudo teve como propósito avaliar o processamento e destacar diferenças morfológicas da abóbora C. maxima bem como realizar a análise do seu rendimento. Foram selecionadas dez abóboras, no qual passaram por processo de sanitização, pesagem, identificação, retirada de medidas, e fracionamento em: casca, polpa, e semente. O tamanho médio das abóboras foi de 24,5 cm de comprimento, e 14,3 cm de altura, já quando analisado o seu rendimento, obteve-se um rendimento de 2%, 13% e 84% para sementes, casca, e polpa respectivamente. Por meio deste estudo, obtivemos resultados que indicam um potencial uso de abóboras para desenvolvimento de novas pesquisas científicas. 

Extração das proteínas de sementes e polpa de Cucurbita maxima: uma análise experimental / Extraction of proteins from Cucurbita maxima seeds and pulp: an experimental analysis

As abóboras (Cucurbitaceae) estão distribuídas em mais de 120 gêneros e 800 espécies. Acredita-se que as abóboras foram cultivadas pela primeira vez no México, em 5.550 a.C. Devido ao melhoramento genético, hoje, as abóboras são cultivadas nas mais variadas condições climáticas em todo o mundo. Por este motivo, estudos acerca do potencial anti-helmíntico, anti-hipertensivo, hipoglicêmico, antimicrobiano e antioxidante de diversas espécies de abóboras são crescentes. Do ponto de vista nutricional, as Cucurbitáceas são fontes de vitaminas A, B, cálcio, ferro, silício e magnésio. Neste estudo descrevemos o processo de extração das proteínas presentes no endosperma das sementes e na polpa de Cucurbita maxima, variedade Duchesne (moranga). A farinha do endosperma das sementes foi utilizada para a extração de proteínas, utilizando tampão fosfato de potássio (KH2PO4) 0,1 M contendo 0,3 M de NaCl, pH7,6. Uma segunda metodologia de extração foi realizada utilizando água destilada. A extração em tampão fosfato apresentou um rendimento de 10,5%, enquanto a extração aquosa apresentou rendimento próximo de 0,6%. A partir da polpa, a recuperação de proteínas foi inversa: 0,2% para o extrato salino e 1,7% para o extrato aquoso. Dado o elevador teor de proteínas presente nas sementes, propomos seu uso como forma de suplementação nutricional e/ou probiótica, sendo necessárias análises complementares para investigar seu valor biológico, bem como as propriedades antimicrobianas e antifúngicas. 

A new Kunitz trypsin inhibitor from Erythrina poeppigiana exhibits antimicrobial and antibiofilm properties against bacteria

Erythrina poeppigiana belongs to Fabaceae family (subfamily Papillionoideae) and is commonly found in tropical and subtropical regions in Brazil. Herein, we described the purification and characterization of a new Kunitz-type inhibitor, obtained from E. poeppigiana seeds (EpTI). EpTI is composed by three isoforms of identical aminoterminal sequences with a molecular weight ranging from 17 to 20 kDa. The physicochemical features showed by EpTI are common to Kunitz inhibitors, including the dissociation constant (13.1 nM), stability against thermal (37–100 ◦C) and pH (2–10) ranging, and the presence of disulfide bonds stabilizing its reactive site. Furthermore, we investigated the antimicrobial, anti-adhesion, and anti-biofilm properties of EpTI against Grampositive and negative bacteria. The inhibitor showed antimicrobial activity with a minimum inhibitory concentration (MIC, 5–10 μM) and minimum bactericidal concentration (MBC) of 10 μM for Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, and Staphylococcus haemolyticus. The combination of EpTI with ciprofloxacin showed a marked synergistic effect, reducing the antibiotic concentration by 150%. The increase in crystal violet uptake for S. aureus and K. pneumoniae strains was approximately 30% and 50%, respectively, suggesting that the bacteria plasma membrane is targeted by EpTI. Treatment with EpTI at 1x and 10 x MIC significantly reduced the biofilm formation and prompted the disruption of a mature biofilm. At MIC/2, EpTI decreased the bacterial adhesion to polystyrene surface within 2 h. Finally, EpTI showed low toxicity in animal model Galleria mellonella. Given its antimicrobial and anti-biofilm properties, the EpTI sequence might be used to design novel drug prototypes

Atividade anti fúngica do α-terpinen sobre Candida albicans

Objetivo: avaliar a atividade antifúngica do α- terpinen sobre culturas planctonicas e biofi lme de Candida albicans. Material e Métodos: Primeiramente, foi determinada a Concentração Inibitória Mínima (CIM) e a Concentração Fungicida Mínima (CFM) do α-terpinen sobre microrganismos planctônicos. A Nistatina foi utilizada como controle positivo. Biofi lme de Candida albicans foi desenvolvido e, após o tratamento com diferentes concentrações de α-terpinen, foi quantifi cado em UFC/mL, além da atividade metabólica das células ser avaliada por XTT. Resultados: a menor concentração capaz de inibir o crescimento (CIM) foi 0,2 % para o α-terpinen e 4 μg/mL para a Nistatina. Na CIM, os resultados mostraram que a partir da concentração 0,05 % de α-terpinen e 2 μg/mL de Nistatina houve diminuição de C.albicans quando comparado ao controle. A CFM foi para α-terpinen 0,2 % e Nistatina 8 μg/mL. Na quantifi cação as concentrações efi cazes foram de α-terpinen (0,1%) e Nistatina (128μg/mL), e no teste do XTT, observou-se que α –terpinen (0,1%) e Nistatina (256μg/mL) diminuem a viabilidade quando comparado com o controle. Conclusão: Assim, pode-se afi rmar que α-terpineol pode ser uma alternativa para tratamento de infecções fúngicas

An Intracellular Arrangement of Histoplasma capsulatum Yeast-Aggregates Generates Nuclear Damage to the Cultured Murine Alveolar Macrophages

Histoplasma capsulatum is responsible for a human systemic mycosis that primarily affects lung tissue. Macrophages are the major effector cells in humans that respond to the fungus, and the development of respiratory disease depends on the ability of Histoplasma yeast cells to survive and replicate within alveolar macrophages. Therefore, the interaction between macrophages and H. capsulatum is a decisive step in the yeast dissemination into host tissues. Although the role played by components of cell-mediated immunity in the host's defense system and the mechanisms used by the pathogen to evade the host immune response are well understood, knowledge regarding the effects induced by H. capsulatum in host cells at the nuclear level is limited. According to the present findings, H. capsulatum yeast cells display a unique architectural arrangement during the intracellular infection of cultured murine alveolar macrophages, characterized as a formation of aggregates that seem to surround the host cell nucleus, resembling a crown. This extranuclear organization of yeast-aggregates generates damage on the nucleus of the host cell, producing DNA fragmentation and inducing apoptosis, even though the yeast cells are not located inside the nucleus and do not trigger changes in nuclear proteins. The current study highlights a singular intracellular arrangement of H. capsulatum yeast near to the nucleus of infected murine alveolar macrophages that may contribute to the yeast’s persistence under intracellular conditions, since this fungal pathogen may display different strategies to prevent elimination by the host's phagocytic mechanisms

Probiotics as Potential Antimicrobials for the Treatment of Infections: Current Reality or Remote Future?

Probiotics are microorganisms that live in symbiosis with the human body. The intake of probiotics in adequate amounts can improve biological functions bringing improvements in the health of the host. Many studies have demonstrated the indisputable antimicrobial activity of probiotics and their potential for an alternative treatment of infections. Nevertheless, the forms of encapsulation, as well as clinical trials on the clinical use of these microorganisms as a recognized and well-established protocol, are still incipient. In this chapter, we provide a general approach to the topic and point to future directions in the probiotics field for this purpose. Moreover, microbial resistance is a current public health problem and the search for new therapeutic alternatives is urgent. Probiotics and other natural therapies have been considered very promising. The approaches of future research should focus mainly on the isolation of new probiotic microorganisms, the definition of inoculum, forms of encapsulation for controlled delivery, and clinical trials for the definition of doses and mechanism of action in the fight against infections