Cuantificación de citocinas caninas mediante reacción en cadena de la polimerasa de transcriptasa reversa en tiempo real

Introduction. Canines are the principal domestic reservoirs of visceral leishmaniasis in both the Old and New World. The development of highly sensitive and quantitative methods, such as real time reverse transcriptase polymerase chain reaction for measurement of canine cytokines has not been exploited in studies of visceral leishmaniasis.Objective. To standardize the relative quantification of canine IFN-g, IL-4, IL-10, IL-12p40 and IL-12p35 using real time reverse transcriptase polymerase chain reaction.Materials and methods. RNA was isolated from PBMCs from 1 year–old foxhounds and cultured with or without Con A, LPS orStaphylococcus aureus extract. This RNA was used in one-step real time reverse transcriptase polymerase chain reaction to optimize the concentrations of the cytokine primers and probes, generate standard curves for each cytokine, confirm equivalent amplification efficiency of cytokine and normalizer (18S rRNA) RNA, and to quantify the expression of the cytokine RNA. The comparative Ct method was used to determine the relative levels of gene expression in the samples, expressed as the fold-increase relative to the control samples.Results. The regression coefficient for the standard curves and the amplification efficiencies of the cytokine and normalizer RNA indicated that the quantification was reliable over a broad concentration range of input RNA. Relative to control cells, activation of PBMCs led to increased expression of IFN-g (132-fold), IL-4 (8.8-fold), IL-10 (7.2-fold), and IL-12p40 (275-fold). Basal expression of IL-12p35 was also detected.Conclusion. This approach provides several advantages over conventional assays for cytokine measurement and can be exploited in the study of the immunopathogenesis and immunity in canine leishmaniasis.Introducción. Los caninos son el principal reservorio domestico de la leishmaniasis visceral en el Nuevo y Viejo mundo. La reacción en cadena de la polimerasa de transcriptasa reversa en tiempo real para la medición de citocinas caninas no ha sido implementada para el estudio de la leishmaniasis visceral.Objetivo. Estandarizar la cuantificación relativa de IFN-g, IL-4, IL-10, IL-12p40 y IL-12p35 caninas utilizando reacción en cadena de la polimerasa de transcriptasa reversa en tiempo real.Materiales y métodos. Células mononucleares de sangre periférica de perros Fox-Hound fueron estimuladas con ConA, LPS y extracto de Staphylococcus aureus. El ARN fue utilizado en la reacción en cadena de la polimerasa de transcriptasa reversa en tiempo real de un solo paso para optimizar las concentraciones de iniciadores y sondas especificas de cada citocina, generar curvas estándar, confirmar la eficiencia de amplificación de las citocinas y del normalizador (18S ARNr) y cuantificar la expresión de ARN. El método comparativo Ct fue utilizado para determinar los niveles relativos de expresión de ARN en las muestras, expresado como el incremento en el número de veces comparado con los controles.Resultados. El coeficiente de regresión para las curvas estándar y las eficiencias de amplificación de las citocinas y el normalizador, indicaron que la cuantificación fue confiable en un amplio rango de concentraciones de ARN. La activación de células mononucleares de sangre periférica resultó en un incremento en la expresión de IFN-g (132), IL-4 (8.8), IL-10 (7,2), y IL-12p40 (275), relativo a células control. La expresión basal de IL-12p35 fue también detectada.Conclusión. Esta metodología, comparada con los métodos convencionales disponibles para la medición de citocinas, ofrece varias ventajas y podría ser utilizada en estudios sobre inmunopatogenia e inmunidad en leishmaniasis visceral canina

Pathologic Inflammation in Malnutrition Is Driven by Proinflammatory Intestinal Microbiota, Large Intestine Barrier Dysfunction, and Translocation of Bacterial Lipopolysaccharide

Acute malnutrition, or wasting, is implicated in over half of all deaths in children under five and increases risk of infectious disease. Studies in humans and preclinical models have demonstrated that malnutrition is linked to an immature intestinal microbiota characterized by increased prevalence of Enterobacteriaceae. Observational studies in children with moderate acute malnutrition (MAM) have also observed heightened systemic inflammation and increased circulating bacterial lipopolysaccharides (LPS; endotoxin). However, the mechanisms that underpin the systemic inflammatory state and endotoxemia, and their pathophysiological consequences, remain uncertain. Understanding these pathophysiological mechanisms is necessary to design targeted treatments that will improve the unacceptable rate of failure or relapse that plague current approaches. Here we use a mouse model of MAM to investigate the mechanisms that promote inflammation in the malnourished host. We found that mice with MAM exhibited increased systemic inflammation at baseline, increased translocation of bacteria and bacterial LPS, and an exaggerated response to inflammatory stimuli. An exaggerated response to bacterial LPS was associated with increased acute weight loss. Remarkably, intestinal inflammation and barrier dysfunction was found in the cecum and colon. The cecum showed a dysbiotic microbiota with expansion of Gammaproteobacteria and some Firmicutes, and contraction of Bacteroidetes. These changes were paralleled by an increase in fecal LPS bioactivity. The inflammatory phenotype and weight loss was modulated by oral administration of non-absorbable antibiotics that altered the proportion of cecal Gammaproteobacteria. We propose that the heightened inflammation of acute malnutrition is the result of changes in the intestinal microbiota, intestinal barrier dysfunction in the cecum and colon, and increased systemic exposure to LPS

Progressive Visceral Leishmaniasis Is Driven by Dominant Parasite-induced STAT6 Activation and STAT6-dependent Host Arginase 1 Expression

The clinicopathological features of the hamster model of visceral leishmaniasis (VL) closely mimic active human disease. Studies in humans and hamsters indicate that the inability to control parasite replication in VL could be related to ineffective classical macrophage activation. Therefore, we hypothesized that the pathogenesis of VL might be driven by a program of alternative macrophage activation. Indeed, the infected hamster spleen showed low NOS2 but high arg1 enzyme activity and protein and mRNA expression (p<0.001) and increased polyamine synthesis (p<0.05). Increased arginase activity was also evident in macrophages isolated from the spleens of infected hamsters (p<0.05), and arg1 expression was induced by L. donovani in primary hamster peritoneal macrophages (p<0.001) and fibroblasts (p<0.01), and in a hamster fibroblast cell line (p<0.05), without synthesis of endogenous IL-4 or IL-13 or exposure to exogenous cytokines. miRNAi-mediated selective knockdown of hamster arginase 1 (arg1) in BHK cells led to increased generation of nitric oxide and reduced parasite burden (p<0.005). Since many of the genes involved in alternative macrophage activation are regulated by Signal Transducer and Activator of Transcription-6 (STAT6), and because the parasite-induced expression of arg1 occurred in the absence of exogenous IL-4, we considered the possibility that L. donovani was directly activating STAT6. Indeed, exposure of hamster fibroblasts or macrophages to L. donovani resulted in dose-dependent STAT6 activation, even without the addition of exogenous cytokines. Knockdown of hamster STAT6 in BHK cells with miRNAi resulted in reduced arg1 mRNA expression and enhanced control of parasite replication (p<0.0001). Collectively these data indicate that L. donovani infection induces macrophage STAT6 activation and STAT6-dependent arg1 expression, which do not require but are amplified by type 2 cytokines, and which contribute to impaired control of infection

Omecamtiv mecarbil in chronic heart failure with reduced ejection fraction, GALACTIC‐HF: baseline characteristics and comparison with contemporary clinical trials

Aims: The safety and efficacy of the novel selective cardiac myosin activator, omecamtiv mecarbil, in patients with heart failure with reduced ejection fraction (HFrEF) is tested in the Global Approach to Lowering Adverse Cardiac outcomes Through Improving Contractility in Heart Failure (GALACTIC‐HF) trial. Here we describe the baseline characteristics of participants in GALACTIC‐HF and how these compare with other contemporary trials. Methods and Results: Adults with established HFrEF, New York Heart Association functional class (NYHA) ≥ II, EF ≤35%, elevated natriuretic peptides and either current hospitalization for HF or history of hospitalization/ emergency department visit for HF within a year were randomized to either placebo or omecamtiv mecarbil (pharmacokinetic‐guided dosing: 25, 37.5 or 50 mg bid). 8256 patients [male (79%), non‐white (22%), mean age 65 years] were enrolled with a mean EF 27%, ischemic etiology in 54%, NYHA II 53% and III/IV 47%, and median NT‐proBNP 1971 pg/mL. HF therapies at baseline were among the most effectively employed in contemporary HF trials. GALACTIC‐HF randomized patients representative of recent HF registries and trials with substantial numbers of patients also having characteristics understudied in previous trials including more from North America (n = 1386), enrolled as inpatients (n = 2084), systolic blood pressure &lt; 100 mmHg (n = 1127), estimated glomerular filtration rate &lt; 30 mL/min/1.73 m2 (n = 528), and treated with sacubitril‐valsartan at baseline (n = 1594). Conclusions: GALACTIC‐HF enrolled a well‐treated, high‐risk population from both inpatient and outpatient settings, which will provide a definitive evaluation of the efficacy and safety of this novel therapy, as well as informing its potential future implementation

Type A Fusion Rules

In this paper we will define fusion algebras and give the general construction to obtain them from affine lie algebras. We also give several known methods to compute the structure constants for fusion algebras of type A.

Inmunobiología de la infección por Brucella spp: Fundamentos para una estrategia vacunal

Las especies de Brucella causan enfermedades en animales domésticos y salvajes incluyendo bovinos, ovinos, caprinos, suinos, caninos. Esta bacteria representa una serio problema económico para la ganadería mundial; en Colombia por ejemplo, se calculan pérdidas anuales por 28 mil millones de pesos representados en la incapacidad de incursionar en los mercados internacionales, los trastornos reproductivos y los abortos que sufren los animales infectados. Además, esta bacteria representa un gran peligro para la salud pública ya que produce una enfermedad zoonótica. Aunque varios modelos para el control han sido llevados a cabo, como los sacrificios de los animales infectados y los tratamientos con antimicrobianos, varios países en el mundo como Colombia han mantenido un programa de vacunación como estrategia de control. La cepa 19 de B. abortus, viva atenuada, es la vacuna más utilizada actualmente e induce una amplia protección en varios modelos animales. Sin embargo, su similitud antigénica con cepas de campo impide la discriminación entre animales vacunados e infectados naturalmente. Para obviar estos inconvenientes se han diseñado varias vacunas utilizando diferentes estrategias, entre ellas la delección de genes que codifican proteínas inmunodominates de la B. abortus, que no afectan la respuesta inmune protectora como, vacunas de polisacáridos, vacunas de ácidos nucleicos y la expresión de proteínas foráneas en las cepas vacunales. La cepa rugosa RB51, carente de LPS, hasta el momento una de las cepas utilizadas con más éxito ya que no induce respuesta humoral, por lo que no interfiere con el diagnóstico de la infección por las cepas de campo. Además, esta cepa ofrece gran seguridad en los animales vacunados e induce una inmunidad esencialmente celular, donde las citoquinas producidas por los linfocitos, han mostrado ser de gran importancia en la resistencia a la infección por esta bacteria

Genes y plásmidos de la Salmonella spp. asociados con virulencia

Las serovariedades de Salmonella, patógenos intracelulares gram negativos, afectan varias especies animales como las aves, los cerdos, los bovinos y el hombre. Después de la ingestión de alimentos o aguas contaminadas, la bacteria se localiza en la porción distal del intestino delgado donde hace contacto con la mucosa intestinal. Estos microorganismos requieren la expresión coordinada de muchos de sus genes para causar una infección productiva en su hospedero. La expresión se inicia cuando la Salmonella entra en contacto con el medio ambiente hostil que representa el tracto gastrointestinal del hospedero, donde encuentra una gran variedad de condiciones como: la osmolaridad, la tensión de oxígeno y el pH; que actúan como señales para que inicie la transcripción de genes que codifican factores de virulencia, los cuales favorecen la interacción con la célula blanco durante la patogénesis. La Salmonella utiliza, además, un sistema de secreción tipo III como un mecanismo básico de virulencia, este sistema es el encargado de translocar proteínas hacia el citosol, las cuales interfieren con las señales de transducción y otros procesos celulares, facilitando la patogénesis de la bacteria, algunos de estos genes han sido descritos y caracterizados mediante la obtención de mutantes in vitro, las cuales han mostrado defectos en ciertas características que parecen ser importantes para cumplir algunas funciones básicas y para la virulencia in vivo, por ejemplo: la capacidad para invadir células epiteliales en cultivo, la sobrevivencia dentro de células fagocíticas, la citotoxicidad de macrófagos, la regulación de la inflamación y la secreción de fluidos. Muchos de los genes que codifican estos factores de virulencia son regulados por sistemas presentes en especies patógenas y no patógenas. Algunas cepas de Salmonella contienen plásmidos que codifican genes de virulencia que están altamente asociados con bacteremia y con la diseminación de la infección. El conocimiento de los genes que conforman el genoma bacteriano, de las proteínas que codifican y de sus funciones, permitirá comprender mejor los mecanismos de patogenecidad de estos microorganismos para generar conocimiento que permita prevenir exitosamente estas infecciones

Respuesta inmune y estrategias de evasión durante la infección con Brucella spp.

La Brucella es una bacteria Gram-negativa, intracelular facultativa que infecta en forma persistente a humanos y animales domésticos y salvajes. Este género de bacterias se replica en los fagocitos mononucleares del hospedero, evadiendo los mecanismos solubles extracelulares de la respuesta inmune. La patogénesis de la infección por Brucella es bastante compleja, depende del patógeno y de los mecanismos de defensa que se activan, donde la inmunidad celular, macrófagos, citoquinas tipo Th1 y células citotóxicas participan activamente en la resolución de la infección. Aunque esta bacteria no evade los mecanismos de fagocitosis, si ha desarrollado mecanismos para la sobrevivencia intracelular. El entendimiento de la interrelación de la respuesta inmune con estos patógenos microbianos, permitirá el desarrollo de medidas para la prevención y el control. Esta revisión describe algunos de los mecanismos inmunológicos innatos y específicos involucrados en la eliminación de la infección causada por las especies de Brucella y referencia artículos originales que dan cuenta del avance logrado mediante la utilización de diferentes modelos animales

SHORT COMMUNICATION - Standardization of Bovine Macrophage Monolayers and Isolation and Culture of Trypanosomes

We describe a method for culturing over 90% pure bovine macrophages from peripheral blood mononuclear cells separated with Nycoprep. The cells were cultured for 12 days and then stained with esterase and with anti CD14 to test for purity. The method is reproducible and ensures an adequate number of cells for immunological research. Additionally, we report the unexpected finding of Trypanosoma   trypomastigotes in our macrophage cultures from bovines belonging to a geographic area from which no bovine trypanosomes had been reported before