Estudio de los procesos celulares inducidos por campos eléctricos en sistemas Lab-on-a-Chip

[spa] En esta tesis doctoral se ha estudiado de forma sistemática la relación entre los campos eléctricos y las células, y los efectos que éstos tienen a diferentes niveles (supervivencia, metabolismo, expresión proteica, morfología), en dispositivos de tipo Lab-on-a-Chip y aplicándolo a un caso concreto de un concentrador basado en dielectroforesis. Se ha realizado de manera que se ha podido diferenciar la aportación de cada uno de los parámetros eléctricos a los cambios. Se ha diseñado, fabricado y comprobado un chip que permite la aplicación de campos eléctricos controlados a células así como la evaluación de parámetros objetivos. Se han realizado dos versiones del mismo chip, con electrodos en oro y en ITO. El sistema se ha controlado en sus aspectos fluídicos y eléctricos, así como en el comportamiento térmico y la variación de la conductividad con el tiempo. Se ha realizado una simulación en COMSOL para determinar cuál es el rango en el que es más interesante centrar el estudio. Para ello se han simulado las condiciones de campo eléctrico sobre un modelo de la bacteria Escherichia coli como una elipsoide alargada con 3 capas. El análisis de los resultados en frecuencia de la intensidad de campo, densidad de corriente y disipación de potencia muestra que la corriente comienza a atravesar la célula a una frecuencia entre 100 KHz y 1 MHz, y otorga un rol importante a la pared bacteriana en cuanto a diana de la corriente eléctrica. Se ha realizado una simulación complementaria de la variación de la impedancia del sistema formado por el chip y la solución de las bacterias. La combinación de ambas informaciones nos permite escoger como frecuencias más relevantes para el estudio las comprendidas entre 100KHz y 1 MHz. El primer bloque de investigación se ha realizado sobre el modelo biológico bacteriano: Escherichia coli. Las magnitudes evaluadas se han dividido en dos grupos: eléctricas (Intensidad de campo, Corriente y Frecuencia) y no eléctricas (tiempo, temperatura y concentración). Los resultados principales son los siguientes: Se puede establecer como umbral de letalidad de la intensidad de campo eléctrico un valor inferior al considerado habitualmente de 1000 V/cm, ya que se consigue una mortalidad del 80% de la población con una intensidad de campo de 660 V/cm, y de un 50 % con campos de 400 V/cm. Se han evidenciado daños subletales en el aumento de los tiempos de generación, así como en la dinámica de crecimiento. A frecuencias altas la mortalidad se hace más elevada. La corriente eléctrica se evidencia a través de los resultados como la magnitud principal en relación a la supervivencia celular. La aplicación de la temperatura amplifica el efecto del campo eléctrico, mostrando una sinergia entre ambas magnitudes. En general, el tiempo no afecta de forma lineal. Parece haber una disminución de la viabilidad en el primer instante de aplicación del campo eléctrico. Posteriormente las células se adaptan y mayor tiempo de aplicación no repercute en una mayor letalidad. Analizando los valores de la supervivencia a diferentes concentraciones, encontramos que concentraciones muy altas producen un efecto de “protección” sobre las células. Posteriormente se ha profundizado en las implicaciones biológicas subletales que tienen los dispositivos LOC, aplicándolo a un dispositivo concentrador de bacterias, y se han hecho estudios proteómicos y de alteraciones morfológicas. Para valorar el efecto del campo eléctrico se ha realizado un análisis de expresión proteica mediante un SDS-PAGE. A las intensidades utilizadas en el dispositivo concentrador no se observan cambios en el proteograma. Si aumentamos la corriente eléctrica, observamos variaciones en la expresión de las proteínas, correspondientes mayoritariamente a dos grupos: Outer Membrane Proteins A (ompA) y Proteínas 2 ribosomales implicadas en el proceso de translación. También se ha observado que las muestras irradiadas tienen una longitud promedio mayor que las de la muestra control, siendo esto un indicio de posibles mecanismos SOS de reparación. El segundo modelo biológico sobre el que se ha trabajado es la línea celular C2C12 de premioblastos inmortalizados de ratón. En este caso, el estudio ha consistido en el diseño y puesta a punto del sistema capaz de albergar las células, permitir su crecimiento normal y aplicar de forma controlada los campos eléctricos. Se han determinado las pruebas a realizar para estudiar un posible cambio de linaje de destino inducido por campos eléctricos, obteniéndose un patrón de referencia con el cual comparar los resultados obtenidos. El sistema ha demostrado ser adecuado para estos estudios y queda preparado para posteriores investigaciones

Combined dielectrophoretic and impedance system for on-chip controlled bacteria concentration: Application to Escherichia coli

The present paper reports a bacteria autonomous controlled concentrator prototype with a user-friendly interface for bench-top applications. It is based on a micro-fluidic lab-on-a-chip and its associated custom instrumentation, which consists in a dielectrophoretic actuator, to pre-concentrate the sample, and an impedance analyser, to measure concentrated bacteria levels. The system is composed by a single micro-fluidic chamber with interdigitated electrodes and a instrumentation with custom electronics. The prototype is supported by a real-time platform connected to a remote computer, which automatically controls the system and displays impedance data used to monitor the status of bacteria accumulation on-chip. The system automates the whole concentrating operation. Performance has been studied for controlled volumes of Escherichia coli (E. coli) samples injected into the micro-fluidic chip at constant flow rate of 10 μL/min. A media conductivity correcting protocol has been developed, as the preliminary results showed distortion of the impedance analyser measurement produced by bacterial media conductivity variations through time. With the correcting protocol, the measured impedance values were related to the quantity of bacteria concentrated with a correlation of 0.988 and a coefficient of variation of 3.1%. Feasibility of E. coli on-chip automated concentration, using the miniaturized system, has been demonstrated. Furthermore, the impedance monitoring protocol had been adjusted and optimized, to handle changes in the electrical properties of the bacteria media over time