Enzyme molecular choreography : studies on soluble inorganic pyrophosphatases

Inorganic pyrophosphatases (PPases, EC 3.6.1.1) hydrolyse pyrophosphate in a reaction that provides the thermodynamic 'push' for many reactions in the cell, including DNA and protein synthesis. Soluble PPases can be classified into two families that differ completely in both sequence and structure. While Family I PPases are found in all kingdoms, family II PPases occur only in certain prokaryotes. The enzyme from baker's yeast (Saccharomyces cerevisiae) is very well characterised both kinetically and structurally, but the exact mechanism has remained elusive. The enzyme uses divalent cations as cofactors; in vivo the metal is magnesium. Two metals are permanently bound to the enzyme, while two come with the substrate. The reaction cycle involves the activation of the nucleophilic oxygen and allows different pathways for product release. In this thesis I have solved the crystal structures of wild type yeast PPase and seven active site variants in the presence of the native cofactor magnesium. These structures explain the effects of the mutations and have allowed me to describe each intermediate along the catalytic pathway with a structure. Although establishing the ʻchoreographyʼ of the heavy atoms is an important step in understanding the mechanism, hydrogen atoms are crucial for the mechanism. The most unambiguous method to determine the positions of these hydrogen atoms is neutron crystallography. In order to determine the neutron structure of yeast PPase I perdeuterated the enzyme and grew large crystals of it. Since the crystals were not stable at ambient temperature, a cooling device was developed to allow neutron data collection. In order to investigate the structural changes during the reaction in real time by time-resolved crystallography a photolysable substrate precursor is needed. I synthesised a candidate molecule and characterised its photolysis kinetics, but unfortunately it is hydrolysed by both yeast and Thermotoga maritima PPases. The mechanism of Family II PPases is subtly different from Family I. The native metal cofactor is manganese instead of magnesium, but the metal activation is more complex because the metal ions that arrive with the substrate are magnesium different from those permanently bound to the enzyme. I determined the crystal structures of wild type Bacillus subtilis PPase with the inhibitor imidodiphosphate and an inactive H98Q variant with the substrate pyrophosphate. These structures revealed a new trimetal site that activates the nucleophile. I also determined that the metal ion sites were partially occupied by manganese and iron using anomalous X- ray scattering.Entsyymit ovat biologisia katalyyttejä, jotka nopeuttavat soluissa tapahtuvia kemiallisia reaktioita. Vaikka entsyymejä on tutkittu vuosikymmeniä, ovat niiden toimintamekanismit edelleen puutteellisesti ymmärrettyjä. Epäorgaaniset pyrofosfataasit ovat entsyymejä, jotka katalysoivat pyrofosfaatin pilkkoutumista kahdeksi fosfaatti-ioniksi. Tämä reaktio tuottaa käyttövoiman monille solun prosesseille, kuten proteiinien tai DNA:n synteesille. Liukoiset pyrofosfataasit voidaan jakaa kahteen perheeseen, joiden aminohappojärjestys ja rakenne ovat täysin erilaiset. Ensimmäiseen perheeseen kuuluva hiivan pyrofosfataasi on erittäin perusteellisti tutkittu entsyymi, mutta sen tarkka toimintamekanismi on pysynyt arvoituksena. Entsyymi hyödyntää kahdenarvoisia metalli-ioneja, luonnossa magnesiumia, joista kaksi on pysyvästi sitoutunut entsyymiin ja kaksi saapuu substraatin mukana. Reaktioon kuuluu nukleofiilisen happiatomin aktivointi ja tuotteen poistumiseen on useita mahdolisia reittejä. Tässä työssä olen määrittänyt muokkaamattoman hiivan pyrofosfataasin ja seitsemän variantin kiderakenteet magnesiumin kanssa. Nämä rakenteet selittävät mutaatioden vaikutukset katalyysiin ja mahdollistivat reaktion jokaisen välituotteen rakenteellisen kuvauksen. Vaikka tämä 'atomikoreografia' onkin tärkeä askel mekanismin ymmärtämisessä, ovat vetyatomit keskeisessä osassa mekanismissa. Yksikäsitteisin menetelmä vetyatomien paikkojen määrittämiseen on neutronikristallografia. Hiivan pyrofosfataasin neutronirakenteen määrittämiseksi tuotin perdeuteroitua entsyymiä ja kasvatin siitä suuria kiteitä. Koska kiteet eivät olleet stabiileja huoneenlämmössä, kehitetttin neutronimittauksia varten jäähdytyslaite. Tutkittasessa rakenteellisia muutoksia reaaliajassa aikaerotteisen kristallografian avulla tarvitaan fotolysoitava substraatin esiaste. Syntetisoin tällaisen ehdokasmolekyylin ja selvitin sen fotolyysikinetiikan, mutta valitettavasti sekä hiivan että Thermotoga maritiman pyrofosfataasit hydrolysoivat tämän molekyylin. Perheen II pyrofosfataasien mekanismi on hieman erilainen kuin ensimmäisellä perheellä, erityisesti metalliaktivaation osalta. Määritin Bacillus subtiliksen pyrofosfataasin rakenteen inhibiittori imidodifosfaatin kanssa sekä inaktiivisen H98Q variantin rakenteen pyrofosfaatin kanssa. Näistä rakenteista paljastui uudenlainen kolmen metalli-ionin muodostelma nukleofiilin aktivoimiseen

Puutavarakuorma-auton tärinän vähentäminen rengaspaineita säätämällä

Tämä tutkimus on jatkoa vuonna 2006 tehdylle tutkimukselle "Puutavarakuorma-autojen tärinä ja melu". Tässä tutkimuksessa alennettujen rengaspaineiden merkitystä puutavarakuorma-autoon ja sen kuljettajaan kohdistuvaan tärinään tutkittiin kesä- ja talviolosuhteissa neljällä erityyppisellä tiellä: metsäautotie, huono hiekkatie, hyvä hiekkatie sekä huono asfalttitie

Water structure in solution and crystal molecular dynamics simulations compared to protein crystal structures

The function of proteins is influenced not only by the atomic structure but also by the detailed structure of the solvent surrounding it. Computational studies of protein structure also critically depend on the water structure around the protein. Herein we compare the water structure obtained from molecular dynamics (MD) simulations of galectin-3 in complex with two ligands to crystallographic water molecules observed in the corresponding crystal structures. We computed MD trajectories both in a water box, which mimics a protein in solution, and in a crystallographic unit cell, which mimics a protein in a crystal. The calculations were compared to crystal structures obtained at both cryogenic and room temperature. Two types of analyses of the MD simulations were performed. First, the positions of the crystallographic water molecules were compared to peaks in the MD density after alignment of the protein in each snapshot. The results of this analysis indicate that all simulations reproduce the crystallographic water structure rather poorly. However, if we define the crystallographic water sites based on their distances to nearby protein atoms and follow these sites throughout the simulations, the MD simulations reproduce the crystallographic water sites much better. This shows that the failure of MD simulations to reproduce the water structure around proteins in crystal structures observed both in this and previous studies is caused by the problem of identifying water sites for a flexible and dynamic protein (traditionally done by overlaying the structures). Our local clustering approach solves the problem and shows that the MD simulations reasonably reproduce the water structure observed in crystals. Furthermore, analysis of the crystal MD simulations indicates a few water molecules that are close to unmodeled electron density peaks in the crystal structures, suggesting that crystal MD could be used as a complementary tool for identifying and modelling water in protein crystallography

Publishing and Using Legislation and Case Law as Linked Open Data on the Semantic Web

ISBN 978-3-030-62327-2 Springer, ChamPeer reviewe

LawSampo Portal and Data Service for Publishing and Using Legislation and Case Law as Linked Open Data on the Semantic Web

Publisher Copyright: © 2022 Copyright for this paper by its authors.This paper argues for the idea of publishing legislation and case law as Linked Open Data (LOD) on the Semantic Web, to cater several user groups, including the general public, legislators, lawyers, researchers of legal informatics, and application developers. To support the argument, the proof-of-concept system LawSampo - Finnish Legislation and Case Law on the Semantic Web is introduced, including a semantic portal and a LOD service. Based on the Sampo Model, the main novelty of LawSampo is the provision of heterogenous distributed legal data through multiple application perspectives for faceted searching and exploring the data and for data analysis in legal informatics.Peer reviewe

Citizen Science Archaeological Finds on the Semantic Web : The FindSampo Framework

FindSampo fosters collecting, sharing, publishing and studying archaeological finds discovered by the public. The framework includes the following: a mobile find-reporting system; a semantic portal for researchers, the public and collection managers to use; and a Linked Open Data service for creating custom data analyses and for application developers.Peer reviewe

Kuntien rakennuskannan kehitys- ja säästöpotentiaali

Tutkimushankkeessa selvitettiin kuntien rakennuskannan nykytilannetta ja ennusteita maakunta- ja sote-uudistuksen jälkeiselle ajalle, arvioitiin rakennuskantaan sisältyvää kehitys- ja säästöpotentiaalia sekä tunnistettiin keskeisimmät keinot potentiaalin hyödyntämiseksi. Kunnat ovat kooltaan, rakenteiltaan ja taloudeltaan erilaisia, mutta kaikille keskeisin haaste toimitilakysymyksissä on, kuinka kukin kunta pystyy jatkossa sopeuttamaan rakennuskantansa palvelutarvettaan vastaavaksi niin, että siinä otetaan huomioon muuttuvat tarpeet myös pitkälle tulevaisuuteen. Kuntien rakennuskannassa on selkeästi merkittävää kehitys- ja säästöpotentiaalia, joka koostuu mm. tyhjistä, vajaakäyttöisistä ja käyttötarkoitukseensa sopimattomista rakennuksista sekä energiatehokkuudesta. Potentiaalin hyödyntäminen ei kuitenkaan ole nopealla aikataululla mahdollista, vaan vaatii pitkäaikaisia, valtakunnallisia ja kuntakohtaisia toimenpiteitä. Erityisesti toimenpiteet tulee kohdistaa väestöään menettäneisiin kuntiin ja kaupunkeihin. Tutkimushankkeessa määritettiin kymmenen tärkeintä strategista ja operatiivista toimenpidettä, joiden avulla kuntia tuetaan oman kuntakohtaisen kehitys-ja säästöpotentiaalin tunnistamisessa, analysoinnissa, suunnittelussa ja toteuttamisessa ja joiden avulla kunnat pystyvät parantamaan taloutensa vakautta, vähentämään massiivista korjausvelkaa ja pääsemään vähitellen eroon myös rakennusterveysongelmist