Repertoire and functionality of innate and adaptive immune receptors in chronic lymhocytic leukemia

The  role  of  antigen  in  the  development  of  CLL  is  underscored  by  the  biased   immunoglobulin   (IG)  gene  repertoire  expressed  by  the  malignant  clones,  the   prognostic  implications  of  B-­‐cell  receptor  (BcR)  structure  and  the  identification  of   subsets  of  patients  with  quasi-­‐identical,  stereotyped  BcRs.  The  structural  homology   of  BcRs  implies  a  role  for  a  limited  set  of  antigens  or  structurally  related  epitopes  in   leukemogenesis.  Antigen  recognition  and  host  defense  rely  on  multiple  mechanisms   acting  synergistically  in  order  to  mount  an  effective  immune  response.  These  include   specific  stimulation  through  the  BcR  and  non-­‐specific  stimulation  through  innate   immune  receptors,  of  which  the  major  classes  are  Toll-­‐like  receptors  (TLRs)  and  Nod-­‐ like  Receptors  (NLRs).  The  available  data  on  TLR  and  NLR  expression  in  CLL  are   limited  and  derive  from  small  series  of  patients.  We  performed  a  systematic  gene   expression  profiling  of  the  TLR  signaling  pathway  and  NLRs,  in  a  large  series  of  191   patients  with  CLL.  The  analysis  extended  from  all  TLRs  and  NOD1/2  to  adaptors,   effectors,  inhibitors  and  members  of  the  NFKB,  JNK/p38,  NF/IL6,  and  IRF  signaling   pathways  downstream  of  TLR  signaling.  In  addition,  differences  in  gene  expression   profiles  were  sought  for  among  subgroups  of  cases  defined  by   BcR   molecular   features,  such  as  the  repertoire  and  mutational  status  of  the  IG  heavy  variable   (IGHV)  genes  or  the  expression  of  stereotyped  BcRs.  CD19+  B  lymphocytes  were   negatively  selected  from  peripheral  blood  samples.  The  gene  expression  profile  of   the  TLR  signalling  pathway  was  determined  by  the  RT²  Profiler™  PCR  Array  kit  (PAHS-­‐ 018A  array,  SABiosciences),  while  NOD1/2  expression  levels  were  determined  with   specific  primers.  At  cohort  level,  among  the  receptors,  high  expression  was  recorded   for  TLR7  and  CD180,  intermediate  for  TLR1,  TLR6  and  TLR10  and  low  expression  for   TLR2  and  TLR9.  TLR4  and  TLR8  were  characterized  by  low  to  undetectable  expression,  with  significant  variations  between  patients,  while  TLR3  and  TLR5  were   not  expressed  in  any  case.  The  NOD1/2  receptors  were  highly  expressed.  The  vast   majority  of  adaptors  (e.g.  MyD88,  TICAM1,  TRAF6),  effectors  (UBE2N)  and  members   of  the  NFKB,  JNK/p38,  NF/IL6,  and  IRF  signaling  pathways  downstream  of  TLR   signaling  were  intermediately-­‐to-­‐highly  expressed,  while  the  inhibitors  of  TLR  activity   were  generally  low-­‐to-­‐undetectable  (TOLLIP,  SIGIRR/TIR8).  Further  comparison  in   subgroups  of  cases  carrying  mutated  vs.  unmutated  IGHV  sequences  (124  and  67   cases,  respectively)  revealed  upregulation  of  CD80,  CD86,  IL6,  IFNG  and  TLR4  and   downregulation  of  TLR8  and   NFKBIL1  in  the  mutated  subgroup.  Significant   differences  in  gene  expression  profiles  were  also  found  in  subgroups  of  cases  with   stereotyped  receptors.  Comparison  of  subset  #4  (mutated  IGHV4-­‐34/1GKV2-­‐30  BcR,   10  cases)  vs.  subset  #1  (unmutated  IGHV1/5/7-­‐IGKV1(D)-­‐39  BcR,  10  cases)  vs.  subset   #8  (unmutated  IGHV4-­‐39/IGKV1(D)-­‐39  BcR,  4  cases)  revealed:  (i)  upregulation  of   TLR7  and  NFKB1A  and  downregulation  of  CD86  and  TLR4  in  #1  vs  #4  cases;  (ii)   upregulation  of  MAP4K4  and  TLR4  and  downregulation  of  NFKB1A  and  CD180  in  #8   vs  #1  cases;  and,  (iii)  upregulation  of  LY96  and  downregulation  of  RIPK2  and  CD86  in   #8  vs  #4  cases.  In  conclusion,  the  TLR  gene  expression  profile  of  CLL  is  consistent   with  derivation  from  antigen-­‐experienced  B  cells.  Significant  variations  were   identified  in  different  subgroups  of   cases  defined  by   BcR   molecular  features,   indicating  distinctive  activation  patterns  of  the  TLR  signaling  pathway,  especially   among  cases  assigned  to  subsets  with  stereotyped  BcRs.  These  findings indicate  that   different  or  concomitant  signals  acting  through  receptors  other  than  the  BcR  can   affect  the  behavior  of  the  malignant  clone.  Mature  B  cells  recognize  antigens  through  the  B  cell  receptor  (BcR)  in  a  specific  way   and  through  innate  immunity  receptors,  such  as  the  Toll-­‐like  receptors  (TLRs)  and   Nod-­‐like  receptors  (NLRs),  in  a  costimulatory  manner.  Signaling  through  the  BcR   appears  to  be  a  major  contributing  factor  in  CLL  development  and,  perhaps,   evolution.  However,  the  timing,  duration  and,  most  importantly,  the  nature  of   antigenic  exposures  remain  unclear.  Although  emerging  data  suggest  that  innate   immunity  receptors  are  relevant  for  CLL  pathogenesis,  the  functionality  of  TLRs  and   NLRs  in  CLL  is  largely  unexplored.  We  investigated  TLR  and  NLR  function  within  CLL   subgroups  defined  by  IGHV  gene  usage,  IGHV  gene  mutational  status,  or   BcR   stereotypy.  To  this  end,  we  studied  a  series  of  67  patients,  with  an  intentional  bias   to  cases  expressing  stereotyped  BcRs  assigned  to  subsets  #1  (IGHV1/5/7-­‐IGKV1(D)-­‐ 39)  and  #4  (IGHV4-­‐34/IGKV2-­‐30),  which  can  be  considered  as  prototypes  of   “unmutated/adverse  prognosis”  and  “mutated/good  prognosis”  subsets,   respectively.  Negatively  isolated  CLL  cells  were  stimulated  with  specific  ligands  for  all   TLRs/NLRs  expressed  in  B  cells.  The  functional  outcome  was  assessed  after  24  hours   by  flow  cytometric  determination  of  CD25  and  CD86  expression  as  a  measure  of  cell   activation.  We  also  measured  cell  viability  at  certain  time  points.  At  cohort  level,   TLR1/2,  TLR2/6,  TLR9  and  NOD2  were  responsive  to  stimulation  with  their  respective   ligands  in  most  cases,   yet  in  a  heterogeneous  fashion.  TLR7  stimulation  with   Imiquimod,  a  small  synthetic  antiviral  molecule,  induced  CD25  and/or  CD86  in  ~50%   of  cases;  in  contrast,  loxoribine,  a  naturally  occurring  TLR7  agonist,  had  no  effects.   Markedly  different  qualitative  responses  were  observed  when  comparing  mutated   vs.  unmutated  CLL  cases,  with  TLR9  upregulating  CD86  expression  in  mutated  CLL   cases,  while  TLR7  upregulating  CD25  expression  in  unmutated  CLL  cases  (p<0.05  for   all  comparisons).  Different  patterns  of   functional  responses  to  TLR  and  NOD2   stimulation  were  also  identified  in  subsets  with  stereotyped  BcRs.  In  particular,   stimulation  of  TLR9,  TLR1/2,  TLR2/6,  and  NOD2  with  the  respective  ligands  strongly  upregulated  CD86  expression  in  subset  #4  cases,  whereas  the  same  treatment  had  a   significantly  less  pronounced  effect  on  subset  #1  cases  (p<0.05  for  all  comparisons).   Opposite  results  were  obtained  after  stimulation  of  the  TLR7  with  imiquimod,  in  that   subset  #1  cases  exhibited  stronger  up-­‐regulation  of  CD25  expression  compared  to   subset  #4  cases  (p<0.05).  Our  study  included  additional  cases  belonging  to   stereotyped  subsets  #8  (IGHV4-­‐39/IGKV1(D)-­‐39,  unmutated)  and  #16  (IGHV4-­‐ 34/IGKV3-­‐20,  mutated).   Differential,  subset-­‐biased  profiles  were  also  identified   when  limiting  the  comparisons  to  subsets  with  similar  mutational  status  (i.e.  subset   #1  vs.  #8  and  subset  #4  vs  #16),  underscoring  the  idea  of  “subset-­‐biased”  innate   immunity  responses  independently  of  IGHV  gene  usage  and/or  mutational  status.  To   further  corroborate  this  concept,  we  focused  on  cases  utilizing  the  IGHV4-­‐34  gene,   which  were  intentionally  over-­‐represented  in  the  cohort.   By  this  approach,   we   identified  significantly  (p<0.05)  different  responses  after  stimulation  of   TLR1/2,   TLR2/6,  TLR9  and  NOD2  in  subset  #4  vs.  non  subset#4/16  IGHV4-­‐34  cases  (in  terms   of  induction  of  either  CD25  or  CD86  or  both.  For  all  the  above  comparisons,  we  also   identified  differential  percentages  of  viable  cells  after  stimulation  of  certain  TLRs   and/or  NLRs  with  their  respective  ligands.  In  conclusion,  we  demonstrate  that  the   behavior  of  CLL  malignant  B  cells  can  be  influenced  by  signals  triggered  by  innate   immunity  receptors.  CLL  patient  subgroups  defined  by  specific  molecular   characteristics  of  their  clonotypic  BcRs  have  distinct  patterns  of  TLR/NLR  function   and/or  TLR  tolerance.  These   differences  support  the  hypothesis  that  specific   modalities  of  BcR/TLR  collaboration  and/or  regulation  may  eventually  impact  on  the   biological  behavior  of  the  malignant  clones.  Additionally,  they  might  prove  relevant   both  for  elucidating  the  immune  mechanisms  which  underlie  CLL  development  and   also  for  defining  subgroups  of  patients  who  might  benefit  from  treatment  with   specific  TLR  ligands,  already  used  in  the  clinical  setting.  Ο  ρόλος  του  αντιγόνου  στη  ΧΛΛ  υποδεικνύεται  από  τη  χρήση  συγκεκριμένων   γονιδίων  IGHV  για  τη  δημιουργία  των  Β  κυτταρικών  υποδοχέων  (B  cell  Receptors,   BcRs)  που  εκφράζουν  τα  νεοπλασματικά  κύτταρα,  την  προγνωστική  αξία  της  δομής   των  BcR  καθώς  και  την  ύπαρξη  υποσυνόλων  ασθενών  με  σχεδόν  πανομοιότυπους,   στερεότυπους,   BcR.  Η  δομική  ομολογία  υποδεικνύει  το  σημαντικό  ρόλο  ενός   περιορισμένου  εύρους  παθογόνων  ή  δομικά  σχετιζόμενων  επιτόπων,  στη   λευχαιμογένεση.  Η  άμυνα  έναντι  παθογόνων  μικροοργανισμών  στηρίζεται  στη   συνεργική  δράση  πολλών  μηχανισμών,  ώστε  να  επιτευχθεί  μία  αποτελεσματική   άνοση  απάντηση.  Σε  αυτούς  τους  μηχανισμούς  συμπεριλαμβάνεται  και  η  μη  ειδική   διέγερση  των  Β  λεμφοκυττάρων  μέσω  των  υποδοχέων  έμφυτης  ανοσίας,  κύριοι   αντιπρόσωποι  των  οποίων  οι  τύπου  Toll  και  NOD  (Toll  Like  Receptors,  TLRs,  Nod  Like   Receptors,   NLRs).  Τα  δεδομένα  που   υπάρχουν  σχετικά  με  την  έκφραση  των   υποδοχέων  TLR  και  NLR  στη  ΧΛΛ  είναι  περιορισμένα  και  προέρχονται  από  μικρές   σειρές  ασθενών.     Στην  παρούσα  μελέτη  πραγματοποιήσαμε  μια  συστηματική  ανάλυση  του  προτύπου   έκφρασης  του  σηματοδοτικού  μονοπατιού  των  υποδοχέων   TLR   καθώς  και  των   υποδοχέων   NLR,  σε  μία  μεγάλη  σειρά  191  ασθενών  με  ΧΛΛ.  Η  ανάλυση   περιελάμβανε  όλους  τους  TLR  και  τους  NOD1/2,  προσαρμοστές,  τελεστές,  μόρια   που  εμπλέκονται  σε  άλλα  σηματοδοτικά  μονοπάτια  που  αλληλεπιδρούν  με  το   μονοπάτι  των  TLR,  καθώς  και  τελικά  μόρια-­‐στόχους.  Παρατηρήθηκαν  διαφορετικά   πρότυπα  γονιδιακής  έκφρασης  μεταξύ  υποομάδων  ασθενών  με  ΧΛΛ  που  ορίστηκαν   με  βάση  τα  μοριακά  χαρακτηριστικά  του  BcR,  όπως  το  ρεπερτόριο  και  το  status   μεταλλάξεων  των  γονιδίων   IGHV   και  η  έκφραση  στερεότυπων   BcR.  Η  μελέτη   πραγματοποιήθηκε  σε  CD19+  Β  λεμφοκύτταρα  που  επιλέχθηκαν  αρνητικά  από  ολικό   αίμα.  Το  γονιδιακό  πρότυπο  έκφρασης  του  σηματοδοτικού  μονοπατιού  των  TLR  πραγματοποιήθηκε  με  τη  χρήση  του  RT²  Profiler™  PCR  Array  kit  (PAHS-­‐018A  array,   SABiosciences),  ενώ  τα  επίπεδα  των  mRNA  μεταγράφων  των  υποδοχέων  NOD1/2   μετρήθηκαν  με  τη  χρήση  ειδικών  εκκινητών.  Στο  σύνολο  των  ασθενών,  μεταξύ  των   υποδοχέων  υψηλά  επίπεδα  έκφρασης  παρουσίαζαν  οι  TLR7  και  CD180,  ενδιάμεσα   οι  TLR1,  TLR6  και  TLR10  και  χαμηλά  οι  TLR2  και  TLR9.  Τα  επίπεδα  έκφρασης  των   TLR4  και  TLR8  ήταν  πολύ  χαμηλά  και  σε  πολλές  περιπτώσεις  μη  ανιχνεύσιμα.  Η   έκφραση  των  TLR3  και  TLR5  ήταν  αρνητική  στην  πλειονότητα  των  περιπτώσεων.  Οι   NOD1/2  παρουσίαζαν  υψηλά  επίπεδα  έκφρασης.  Οι  περισσότεροι  προσαρμοστές   (MyD88,  TICAM1,  TRAF6),  οι  τελεστές  που  ρυθμίζουν  τη  λειτουργία  του  μονοπατιού   (UBE2N)  καθώς  και  τα  μόρια  που  εμπλέκονται  στα  άλλα  σηματοδοτικά  μονοπάτια   των  NFKB,  JNK/p38,  NF/IL6  και  IRF  καθοδικά  του  μονοπάτιου  των  TLR  εμφάνιζαν   υψηλά  ή  ενδιάμεσα  επίπεδα  έκφρασης,  ενώ  οι  αναστολείς  του  μονοπατιού   εκφραζόταν  σε  χαμηλά  έως  μηδενικά  επίπεδα  (TOLLIP,  SIGIRR/TIR8).  Η  σύγκριση   των  περιπτώσεων  που  φέρουν  μεταλλαγμένες  αλληλουχίες  IGHV  (M-­‐ΧΛΛ)  έναντι   εκείνων  που  φέρουν  αμετάλλακτες  αλληλουχίες   IGHV   (Α-­‐ΧΛΛ)  (124  και  67   περιπτώσεις,  αντιστοίχως)  αποκάλυψε  ότι  τα  μόρια  CD80,  CD86,  IL6,  IFNG  και  TLR4   υπερεκφράζονταν,  ενώ  τα  μόρια  TLR8  και  NFKBIL1  υποεκφράζονταν  στην  M-­‐ΧΛΛ   έναντι  της   Α-­‐ΧΛΛ.   Σημαντικές  διαφορές  παρατηρήθηκαν  και   κατά  τη   σύγκριση   ασθενών  που  ανήκαν  σε  διαφορετικά  στερεότυπα  υποσύνολα   (στερεότυπο   υποσύνολο  #4,  IGHV4-­‐34/1GKV2-­‐30  BcR,  στερεότυπο  υποσύνολο  #1,  IGHV1/5/7-­‐ IGKV1(D)-­‐39   BcR,  στερεότυπο  υποσύνολο  #8,   IGHV4-­‐39/IGKV1(D)-­‐39   BcR):  (i)   υπερέκφραση  των  μορίων  TLR7  και  NFKBIA  και  υποέκφραση  των  μορίων  CD86  και   TLR4  στις  περιπτώσεις  του  στερεότυπου  υποσυνόλου  #1  έναντι  του  στερεότυπου   υποσυνόλου  #4,  (ii)  υπερέκφραση  ων  μορίων  TLR4  και  MAP4K4  και  υποέκφραση   των  μορίων  NFKBIA  και  RIPK2  στις  περιπτώσεις  του  στερεότυπου  υποσυνόλου  #8   έναντι  του  στερεότυπου  υποσυνόλου  #1  και  (iii)  υπερέκφραση  του  μορίου  LY96  και   υποέκφραση   των  μορίων   RIPK2  και   CD86  στις  περιπτώσεις  του  στερεότυπου   υποσυνόλου  #8  έναντι  του  στερεότυπου  υποσυνόλου  #4.  Συμπερασματικά,  το   πρότυπο   έκφρασης  των  υποδοχέων   TLR   είναι   παρόμοιο  με  το  αντίστοιχο  των   ενεργοποιημένων  Β  λεμφοκυττάρων,  ενισχύοντας  την  άποψη  ότι  τα  κύτταρα  της   ΧΛΛ  έχουν  εμπειρία  αντιγόνου.  Επιπλέον,  υπο-­‐ομάδες  ασθενών  με  ΧΛΛ  που   ορίζονται  με  βάση  τα  ιδιαίτερα  μοριακά  χαρακτηριστικά  των   BcR   -­‐ιδίως  οι  περιπτώσεις  που  φέρουν  στερεότυπους   BcR-­‐   εμφανίζουν  διαφορετικά  πρότυπα   έκφρασης  των  υποδοχέων   TLR,  γεγονός  που  υποδεικνύει  ότι  διαφορετικά  (και   ταυτόχρονα)  σήματα  εκτός  από  τα  σήματα  που  προέρχονται  από  τον  BcR  μπορεί  να   επηρεάζουν  τη  συμπεριφορά  του  νεοπλασματικού  κλώνου.    Τα  ώριμα  Β  λεμφοκύτταρα  αναγνωρίζουν  αντιγόνα  ειδικά  μέσω  του  Β  κυτταρικού   υποδοχέα  (B  cell  Receptor,  BcR)  αλλά  και  μέσω  των  υποδοχέων  έμφυτης  ανοσίας,   όπως  οι  υποδοχείς  τύπου  Toll  (Toll  Like  Receptors,  TLRs)  και  υποδοχείς  τύπου  NOD   (NOD  Like  Receptors,  NLRs),  οι  οποίοι  ασκούν    συν-­‐διεγερτική  δράση  στον  BcR.   Φαίνεται  ότι  η  σηματοδότηση  μέσω   BcR   διαδραματίζει  σημαντικό  ρόλο  στην   ανάπτυξη  και  ίσως  στην  εξέλιξη  της  Χρόνιας  Λεμφοκυτταρικής  Λευχαιμίας  (ΧΛΛ).   Ωστόσο,  η  ακριβής  χρονική  στιγμή,  η  διάρκεια  και  κυρίως  η  φύση  της  αντιγονικής   διέγερσης  είναι  μέχρι  και  σήμερα  αδιευκρίνιστα.  Παρόλο  που  σημαντικά  δεδομένα   υποδεικνύουν  ότι  οι  υποδοχείς  έμφυτης  ανοσίας  σχετίζονται  με  την  παθογένεια  της   ΧΛΛ,  η  λειτουργικότητα  των  υποδοχέων  TLR  και  NLR  δεν  έχει  μελετηθεί  εκτενώς  στη   ΧΛΛ.  Μελετήσαμε  τη  λειτουργικότητα  των  υποδοχέων  TLR  και  NLR  σε  υποομάδες   ασθενών  με  ΧΛΛ  οι  οποίες  διαχωρίστηκαν  με  βάση  το  ρεπερτόριο,  το   status   μεταλλάξεων  των  γονιδίων  IGHV  και  την  έκφραση  στερεότυπων  BcR.  Για  το  λόγο   αυτό  μελετήσαμε  67  ασθενείς,  με  σκόπιμη  υπερ-­‐αντιπροσώπευση  περιπτώσεων   που   εκφράζουν   στερεότυπους  υποδοχείς  χαρακτηριστικούς   των  στερεότυπων   υποσυνόλων  #1  (IGHV1/5/7-­‐IGKV1(D)-­‐39)  και  #4  (IGHV4-­‐34/IGKV2-­‐30),  τα  οποία   θεωρούνται  υποδείγματα  κακής  και  καλής  πρόγνωσης,  αντίστοιχα.  Έγινε  διέγερση   CD19+  κυττάρων,  που  είχαν  επιλεγεί  αρνητικά  από  ολικό  αίμα,  με  προσδέτες   ειδικούς  για  όλους  τους   TLR/NLR   που  εκφράζονται  στα  Β  λεμφοκύτταρα.  Τα   αποτελέσματα  της  διέγερσης  εκτιμήθηκαν  μετά  από  12  ώρες  με  μέτρηση  της   έκφρασης  των  μορίων   CD25  και   CD86   (δείκτες  ενεργοποιημένων  Β  λεμφοκυττάρων),  με  κυτταρομετρία  ροής.  Επίσης,  μετρήθηκε  η  βιωσιμότητα  των   κυττάρων  σε  συγκεκριμένα  χρονικά  στιγμιότυπα  (Ημέρα  3,  6,  9).  Οι  TLR1/2,  TLR2/6,   TLR9  και   NOD2  απάντησαν  στη  διέγερση  με  τους  ειδικούς  προσδέτες  στις   περισσότερες  περιπτώσεις  που  μελετήθηκαν,  αν  και   με   μεγάλη  ετερογένεια.  Η   διέγερση  του  TLR7  με  Imiquimod,  ένα  μικρό  συνθετικό  αντι-­‐ιικό  μόριο,  οδήγησε  σε   αύξηση  της  έκφρασης  του  CD25  και/ή  CD86  σε  ~50%  των  περιπτώσεων.  Αντίθετα,  η   loxoribine  που  είναι  ο  φυσικός  προσδέτης  του  TLR7  δεν  είχε  καμία  επίδραση  στα  Β   λεμφοκύτταρα  της  ΧΛΛ.  Παρατηρήθηκαν  σημαντικές  διαφορές  στην  απάντηση  μετά   από  διέγερση   επιλεγμένων   TLR   όταν   μεταξύ  περιπτώσεων   που  έφεραν   μεταλλαγμένες  έναντι  αμετάλλακτων   αλληλουχιών   IGHV   (M-­‐ΧΛΛ   vs   Α-­‐ΧΛΛ).   Συγκεκριμένα,  το  ποσοστό  των  CD25  θετικών  κυττάρων  αυξήθηκε  περισσότερο  στην   Α-­‐ΧΛΛ  μετά  από  διέγερση  του  TLR7  με  Im.  Αντίθετα,  μετά  από  διέγερση  του  TLR9  με   CpG,  το  ποσοστό  των   CD86  θετικών  κυττάρων  ήταν  μεγαλύτερο  στην   M-­‐ΧΛΛ.   Ιδιαίτερα  λειτουργικά  πρότυπα  των   TLR   και   NOD2  παρατηρήθηκαν  και  στα   διαφορετικά  στερεότυπα  υποσύνολα  ασθενών.  Συγκεκριμένα,  μετά  από  διέγερση   των  υποδοχέων  TLR9,  TLR1/2,  TLR2/6,  και  NOD2  με  τους  κατάλληλους  προσδέτες,  η   έκφραση  του   CD86  επαγόταν  ισχυρά  στις  περιπτώσεις  του  στερεότυπου   υποσύνολου  #4,  ενώ  στις  περιπτώσεις  του  στερεότυπου  υποσύνολου  #1  η  επαγωγή   της  έκφρασης  ήταν  χαμηλή  έως  μηδενική.  Η  διέγερση  του  TLR7  με  Im  δεν  είχε  καμία   επίδραση  στην  έκφραση  του  CD86,  αλλά  οδηγούσε  σε  αυξημένη  έκφραση  του  CD25   μόνο  στις  περιπτώσεις  του  στερεότυπου  υποσυνόλου  #1.  Η  μελέτη  μας   περιλάμβανε  επίσης  περιπτώσεις  που  ανήκαν  στα  στερεότυπα  υποσύνολα  #8   (IGHV4-­‐39/IGKV1(D)-­‐39,   UM)  και  #16  (IGHV4-­‐34/IGKV3-­‐20,   M).  Παρατηρήσαμε   ιδιαίτερα  λειτουργικά  πρότυπα  ακόμα  και  όταν  συγκρίναμε  περιπτώσεις  που   ανήκαν  σε  στερεότυπα  υποσύνολα  με  ίδιο  status  μεταλλάξεων  των  γονιδίων  IGHV   (στερεότυπο  υποσύνολο  #1  έναντι  #8  και  στερεότυπο  υποσύνολο  #4  έναντι  #16),   γεγονός  που  υποδεικνύει  ότι  τα  ιδιαίτερα  πρότυπα  έκφρασης  των  υποδοχέων  TLR   είναι  χαρακτηριστικά  των  στερεότυπων  υποσυνόλων,  ανεξάρτητα  από  τη  χρήση   συγκεκριμένου  γονιδίου  IGHV  ή  status  μεταλλάξεων.  Για  να  επιβεβαιώσουμε  το   παραπάνω    συμπέρασμα,   επικεντρωθήκαμε  στις  περιπτώσεις  που   χρησιμοποιούσαν  το  γονίδιο    IGHV4-­‐34  σε  στερεότυπες  (#4  και  #16)  και  μη  (non   #4/16)  αναδιατάξεις.  Με  αυτή  την  προσέγγιση  παρατηρήθηκαν  στατιστικά σημαντικές  διαφορές  (p<0.05)  ανάμεσα  στις  τρεις  ομάδες  ασθενών  αναφορικά  με   την  έκφραση  των  συνδιεγερτικών  μορίων  μετά  από  διέγερση  των  TLR1/2,  TLR2/6,   NOD2  και   TLR9.  Σε  όλες  τις  παραπάνω  συγκρίσεις  παρατηρήθηκαν  επίσης   διαφορετικά  ποσοστά  βιωσιμότητας  μετά  από  διέγερση  συγκεκριμένων  TLR  και/ή   NLR  με  τους  κατάλληλους  προσδέτες.  Συμπερασματικά,  η  ανάπτυξη  και  εξέλιξη  της   ΧΛΛ  πιθανόν  επηρεάζεται  και  από  σήματα  που  λαμβάνονται  μέσω  των  υποδοχέων   έμφυτης  ανοσίας.  Υποομάδες  ασθενών  με  ΧΛΛ  που  ορίζονται  με  βάση  τα  ιδιαίτερα   μοριακά  χαρακτηριστικά  των   BcR   εμφανίζουν  διαφορετικά  πρότυπα   λειτουργικότητας  των  υποδοχέων   TLR   και/ή   NLR.  Με  βάση  τα  παραπάνω,  η   βιολογική  συμπεριφορά  του  λευχαιμικού  κλώνου,  που  αντικατοπτρίζεται  στην   κλινική  πορεία  της  νόσου,  είναι  αποτέλεσμα  της  συνεργασίας  των  κλωνοτυπικών   BcR   με  συγκεκριμένους  υποδοχείς  έμφυτης  ανοσίας  που  διαφέρουν  κατά   περίπτωση.  Επιπλέον,  τα  αποτελέσματα  της  παρούσας  μελέτης  θα  μπορούσε  να   χρησιμεύσουν  για  τη  διάκριση  ομάδων  ασθενών  που  θα  ωφελούνταν  από  τη   θεραπεία  με  συγκεκριμένους  προσδέτες

Studying the Cohesion Evolution of Genes Related to Chronic Lymphocytic Leukemia Using Semantic Similarity in Gene Ontology and Self-Organizing Maps

A significant body of work on biomedical text mining is aimed at uncovering meaningful associations between biological entities, including genes. This has the potential to offer new insights for research, uncovering hidden links between genes involved in critical pathways and processes. Recently, high-throughput studies have started to unravel the genetic landscape of chronic lymphocytic leukemia (CLL), the most common adult leukemia. CLL displays remarkable clinical heterogeneity, likely reflecting its underlying biological heterogeneity which, despite all progress, still remains insufficiently characterized and understood. This paper deploys an ontology-based semantic similarity combined with self-organizing maps for studying the temporal evolution of cohesion among CLL-related genes and the extracted information. Three consecutive time periods are considered and groups of genes are derived therein. Our preliminary results indicated that our proposed gene groupings are meaningful and that the temporal dimension indeed impacted the gene cohesion, leaving a lot of room for further promising investigations

Distinct transcriptional control in major immunogenetic subsets of chronic lymphocytic leukemia exhibiting subset-biased global DNA methylation profiles.

To access publisher full text version of this article. Please click on the hyperlink in Additional Links field.Chronic lymphocytic leukemia (CLL) can be divided into prognostic subgroups based on the IGHV gene mutational status, and is further characterized by multiple subsets of cases with quasi-identical or stereotyped B cell receptors that also share clinical and biological features. We recently reported differential DNA methylation profiles in IGHV-mutated and IGHV-unmutated CLL subgroups. For the first time, we here explore the global methylation profiles of stereotyped subsets with different prognosis, by applying high-resolution methylation arrays on CLL samples from three major stereotyped subsets: the poor-prognostic subsets #1 (n = 15) and #2 (n = 9) and the favorable-prognostic subset #4 (n = 15). Overall, the three subsets exhibited significantly different methylation profiles, which only partially overlapped with those observed in our previous study according to IGHV gene mutational status. Specifically, gene ontology analysis of the differentially methylated genes revealed a clear enrichment of genes involved in immune response, such as B cell activation (e.g., CD80, CD86 and IL10), with higher methylation levels in subset #1 than subsets #2 and #4. Accordingly, higher expression of the co-stimulatory molecules CD80 and CD86 was demonstrated in subset #4 vs. subset #1, pointing to a key role for these molecules in the crosstalk of CLL subset #4 cells with the microenvironment. In summary, investigation of three prototypic, stereotyped CLL subsets revealed distinct DNA methylation profiles for each subset, which suggests subset-biased patterns of transcriptional control and highlights a key role for epigenetics during leukemogenesis.Nordic Cancer Union Swedish Cancer Society Swedish Research Council Medical Faculty of Uppsala University, Uppsala University Hospital, and Lion's Cancer Research Foundation in Uppsala, Sweden Cariplo Foundation in Milan, Italy ENosAI project 09SYN-13-880 EU Greek General Secretariat for Research and Technolog

Distinct homotypic B-cell receptor interactions shape the outcome of chronic lymphocytic leukaemia

Cell-autonomous B-cell receptor (BcR)-mediated signalling is a hallmark feature of the neoplastic B lymphocytes in chronic lymphocytic leukaemia (CLL). Here we elucidate the structural basis of autonomous activation of CLL B cells, showing that BcR immunoglobulins initiate intracellular signalling through homotypic interactions between epitopes that are specific for each subgroup of patients with homogeneous clinicobiological profiles. The molecular details of the BcR-BcR interactions apparently dictate the clinical course of disease, with stronger affinities and longer half-lives in indolent cases, and weaker, short-lived contacts mediating the aggressive ones. The diversity of homotypic BcR contacts leading to cell-autonomous signalling reconciles the existence of a shared pathogenic mechanism with the biological and clinical heterogeneity of CLL and offers opportunities for innovative treatment strategies