Protein isoforms. Origin, structure and functions

Many proteins in mammalian organism exist as isoforms. These isoforms can be encoded by different genes or produced by alternative splicing of one gene. Despite rapid instrumental progress in the isoform identification, the reasons for their existence and specific functions remain largely unknown. During recent years, attention of researchers was mostly concentrated on spliced isoforms, while the variants of the same protein coded by different genes can play an essential role in different cell processes. This review presents examples of different potential functions of the protein isoforms coded by different genes. Molecular background which could provide a difference between highly homologous protein variants is discussed with an example of isoforms translation elongation factor 1A (eEF1A).Велика кількість білків в організмі ссавців існує у вигляді декількох ізоформ. Ці варіанти кодуються різними гена-ми або є сплайсованими модифікаціями продуктів того ж самого гена. Незважаючи на швидкий інструментальний прогрес у ідентифікації ізоформ, причини їхнього існування та специфічні функції у більшості випадків залишаються достеменно невідомими. Останнім часом увага дослідників здебільшого зосереджена на сплайсованих ізоформах, у той час як різногенні білкові ізоформи можуть відігравати суттєву роль у різних клітинних процесах. У огляді наводяться приклади різних потенційних функцій ізоформ того ж самого білка, які кодуються різними генами. Молекулярне підґрунтя, що може забезпечувати існування такої різниці функцій у високогомологічних білкових ізоформ обговорюється на прикладі останніх досягнень у вивченні ізоформ фактора елонгації трансляції 1A (eEF1A).Многие белки в организме млекопитающих существует в виде нескольких изоформ. Они кодируются разными генами или являются продуктами альтернативного сплайсинга одного и того же гена. Несмотря на быстрый инструментальный прогресс в идентификации изоформ, причины их существования и специфические функции в большинстве случаев остаются точно неизвестными. В последнее время в основном внимание исследователей сосредоточено на сплайсированных изоформах, в то время как разногенные белковые изоформы могут выполнять существенную роль в разных клеточных процессах. В обзоре приводятся примеры разных потенциальных функций изоформ одного и того же белка, кодируемых разными генами. Молекулярные основы существования такой функциональной разницы высокогомологичных белковых изоформ обсуждаются на примере последних достижений в изучении изоформ фактора элонгации трансляции 1A (eEF1A)

Comparison of the ability of mammalian eEF1A1 and its oncogenic variant eEF1A2 to interact with actin and calmodulin

The question as to why a protein exerts oncogenic properties is answered mainly by well-established ideas that these proteins interfere with cellular signaling pathways. However, the knowledge about structural and functional peculiarities of the oncoproteins causing these effects is far from comprehensive. The 97.5% homologous tissue-specific A1 and A2 isoforms of mammalian translation elongation factor eEF1A represent an interesting model to study a difference between protein variants of a family that differ in oncogenic potential. We propose that the different oncogenic impact of A1 and A2 might be explained by differences in their ability to communicate with their respective cellular partners. Here we probed this hypothesis by studying the interaction of eEF1A with two known partners – calmodulin and actin. Indeed, an inability of the A2 isoform to interact with calmodulin is shown, while calmodulin is capable of binding A1 and interferes with its tRNA-binding and actin-bundling activities in vitro. Both A1 and A2 variants revealed actin-bundling activity; however, the form of bundles formed in the presence of A1 or A2 was distinctly different. Thus, a potential inability of A2 to be controlled by Ca2+-mediated regulatory systems is revealed

Control of the amount and functionality of the eEF1A1 and eEF1A2 isoforms in mammalian cells

Aim. To review mechanisms of regulation of expression and the functionality of two isoforms of translation elongation factor eEF1A in mammalian cells. Results. eEF1A1 and eEF1A2 proteins are regulated by post-translational modifications, protein-protein and protein-tRNA interactions as well as by controlling the amount of their mRNAs in human cells. Conclusions. EEF1A1 mRNA levels in cancer cells may depend on the allelic copy number while the level of EEF1A2 mRNA may be controlled by micro RNAs. eEF1A2 protein activity in different cellular processes may be determined, in part, by its increased affinity for tRNA and viral RNAs as compared to eEF1A1. eEF1A1 activity can be regulated by its increased susceptibility to post-translational modifications (PTM) and protein-protein interactions (PTI) as compared to eEF1A2.Мета. Представити короткий огляд деяких механізмів, за допомогою яких клітини ссавців контролюють експресію і функціональність двох ізоформ фактора елонгації трансляції eEF1A. Результати. Описано клітинну тактику контроля білків eEF1A1 і eEF1A2 за участі пост-трансляційних модифікацій, білок-білкових та білок-РНКових взаємодій, а також регуляції кількості і стабільності EEF1A1 і EEF1A2 мРНК. Висновки. Рівень мРНК, що кодує еEF1A1 в ракових клітинах, може залежати від зміни кількості алельних копій, у той час, коли рівень EEF1A2 мРНК може контролюватися за допомогою мікро РНК. Активність білка еEF1A2 в різних клітинних процесах, може визначатися, зокрема, підвищеною, в порівнянні з еEF1A1, афінністю до тРНК і вірусної РНК. В свою чергу, активність еEF1A1 може регулюватися підвищеною, в порівнянні з еF1A2, доступністю цього білка до пост-трансляційних модифікацій і білок-білкових взаємодій.Цель. Представить краткий обзор некоторых механизмов, с помощью которых клетки млекопитающих контролируют экспрессию и функциональность двух изоформ фактора элонгации трансляции еEF1A. Результаты. Описано клеточную тактику контроля белков eEF1A1 и eEF1A2 с участием пост-трансляционных модификаций, белок-белковых и белок-РНКовых взаимодействий, а также регуляции количества и стабильности EEF1A1 и EEF1A2 мРНК. Выводы. Уровень мРНК, которая кодирует еEF1A1 в раковых клетках, может определяться измененным количеством аллельных копий, в то время как уровень мРНК, кодирующей еEF1A2, может контролироваться посредством микроРНК. Активность белка еEF1A2 в разных клеточных процессах может определяться, в частности, его увеличенной, в сравнении с eEF1A1, аффинностью к тРНК и вирусной РНК. В свою очередь, активность eEF1A1 может регулироваться увеличенными, по сравнению с eEF1A2, подверженностью этого белка пост-трансляционным модификациям и доступностью для белок-белковых взаимодействий

Mass-spectrometric and bioinformatic analysis of eEF1Bγ interactome in the cytoplasmic fraction of A549 cells

Aim. To study protein networks containing the translation elongation factor eEF1B gamma (eEF1Bγ) in lung carcinoma cells. Methods. The protein partners of eEF1Bγ in the cytoplasmic fraction of human lung adenocarcinoma A549 cells were identified by co-immunoprecipitation (co-IP) followed by subsequent liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). The protein interaction network for eEF1Bγ was determined by a Cytoscape 3.2.0 program using a MCODE plugin. Results. 222 high-scored proteins interacting with eEF1Bγ in the cytoplasm of A549 cells have been identified. Possible functional networks involving these protein-protein interactions were predicted using bioinformatic approaches. Conclusions. Five protein networks were identified as possible targets of eEF1Bγ in lung cancer cells. Apart from translation, eEF1Bγγ was shown to be potentially involved in cell cycle regulation, nucleosome remodeling, transcription, mRNA splicing and processing, and oxidative stress response.Мета. Виявити білкові мережі, до яких може входити фактор елонгації трансляції eEF1Bγ в клітинах карциноми легені. Методи. Білки-партнери eEF1Bγ у цитоплазматичній фракції клітин аденокарциноми легені людини А549 були ідентифіковані за допомогою ко-іммунопреципітації із наступною рідинною хроматографією та тандемною мас-спектрометрією (LC-MS/MS). Білкові мережі, до яких входить eEF1Bγ, визначали за допомогою програми Cytoscape 3.2.0 із плагіном MCODE. Результати. Ідентифіковано 222 білки-партнери eEF1Bγ в цитоплазматичній фракції клітин А549. Функціональні мережі, які можуть формуватися цими білками, були визначені біоінформатично. Висновки. На основі експериментальних даних винайдено п’ять білкових мереж, у яких може брати участь eEF1Bγ в клітинах аденокарциноми легені людини. Показано, що крім трансляційних компонентів, ці мережі формуються білками, задіяними у регуляції клітинного циклу, ремоделюванні нуклеосом, транскрипції, сплайсингу і процесінгу мРНК та клітинної відповіді на оксидативний стрес.Цель. Выявить белковые сети, членом которых может быть фактор элонгации трансляции eEF1Bγ в клетках карциномы легкого. Методы. С помощью ко-иммунопреципитации с последующей жидкостной хроматографией и тандемной масс-спектрометрией были идентифицированы белки-партнеры eEF1Bγ в цитоплазматической фракции клеток аденокарциномы легкого людини А549. Белковые сети, в состав которых входит eEF1Bγ, определяли с помощью программы Cytoscape 3.2.0 с плагином MCODE. Результаты. Идентифицированы 222 белка-партнера eEF1Bγ в цитоплазматической фракции клеток А549. Функциональные сети, которые могут формироваться этими белками, были определены биоинформатически. Выводы. На основании экспериментальных данных найдено пять белкових сетей, в которых может участвовать eEF1Bγ в клетках аденокарциномы легкого человека. Показано, что кроме трансляционных компонентов, эти сети формируются белками, задействованными в регуляции клеточного цикла, ремоделировании нуклеосом, транскрипции, сплайсинга и процессинга мРНК и клеточного ответа на оксидативный стресс

Specific features of protein biosynthesis in higher eukaryotes

Over 40 years of studies in the field of higher eukaryotic translation are summarized in the review. Among the pioneer results obtained we should especially accentuate the following: i) discovery of the adaptation of tRNAs and aminoacyl-tRNA synthetases (ARSs) cellular pools to the synthesis of specific proteins and modulation of the elongation rate by rare isoacceptor tRNAs; ii) the chaperone-like properties of the translation components (ribosomes and elongation factor eEF1A); characterization of high molecular weight complexes of ARSs; iii) functional compartmentalization, including channeling of tRNA in eukaryotic cells; iv) molecular mechanisms of channeling mediated by different non-canonical complexes involving eEF1A, tRNA and aminoacyl-tRNA synthetases; v) characterization of the crystal structure of eEF1A2; vi) comparison of spatial structure, molecular dynamics, tyrosine phosphorylation and abilities to interact with different protein partners of the eEF1A1 and eEF1A2 isoforms; vii) discovery of the microRNA-mediated control of the expression of the proto-oncogenic eEF1A2 isoform in cancer cells; viii) examination of the cancer-related changes in translation elongation complex eEF1H and mechanisms of oncogene PTI-1 action; ix) discovery of the third tRNA binding site on mammals ribosomes and the allosteric interaction of the 80S ribosomal A and E sites.В огляд підсумовано найвагоміші результати більш ніж сорокалітніх досліджень особливостей трансляції у вищих евкаріотів, з-поміж яких: 1) відкриття адаптації клітинних пулів тРНК і аміноацил-тРНК синтетаз (АРСаз) до синтезу специфічних білків і модуляції швидкості елонгації рідкісними ізоакцепторними тРНК; 2) визначення шапероноподібних властивостей компонентів апарату трансляції (рибосом і фактора елонгації eEF1A), характеристика високомолекулярних комплексів АРСаз; 3) встановлення функціональної компартменталізації, у тому числі каналювання тРНК в евкаріотних клітинах; 4) з’ясування молекулярних механізмів каналювання, що відбувається за посередництвом різних неканонічних комплексів, які містять eEF1A, тРНК і АРС-ази; 5) характеристика кристалічної структури eEF1A2; 6) порівняння просторової організації, молекулярної динаміки, тирозинового фосфорилювання і здатності до взаємодії з різними білками – партнерами ізоформ eEF1A1 i eEF1A2; 7) виявлення ролі мікроРНК у контролі експресії протоонкогенної ізоформи eEF1A2 в ракових клітинах; 8) вивчення спричинених раком змін комплексу факторів елонгації трансляції eEF1H і механізмів дії онкогену PTI-1; 9) відкриття третього сайта зв’язування тРНК у рибосомах ссавців та алостеричної взаємодії А- і Е-сайтів 80S рибосоми.В обзоре суммированы наиболее значимые результаты более чем сорокалетнего исследования особенностей трансляции у высших эукариот, среди них: 1) открытие адаптации клеточных пулов тРНК и аминоацил-тРНК синтетаз (АРСаз) к синтезу специфических белков и модуляции скорости элонгации редкими изоакцепторными тРНК; 2) определение шапероноподобных свойств компонентов аппарата трансляции (рибосом и фактора элонгации eEF1A) и характеристика высокомолекулярных комплексов АРСаз; 3) установление функциональной компартментализации, включающей каналирование тРНК в эукариотных клетках; 4) выяснение молекулярных механизмов каналирования, опосредованного неканоническими комплексами, содержащими eEF1A, тРНК и АРС-азы; 5) характеристика кристаллической структуры eEF1A2; 6) сравнение пространственной организации, молекулярной динамики, тирозинового фосфорилирования и способности к взаимодействию с различными белками – партнерами изоформ eEF1A1 и eEF1A2; 7) выявление роли микроРНК в контроле экспрессии протоонкогенной изоформы eEF1A2 в раковых клетках; 8) изучение связанных с раком изменений комплекса факторов элонгации трансляции eEF1H и механизмов действия онкогена РТІ-1; 9) открытие третьего сайта связывания тРНК в рибосомах млекопитающих и аллостерического взаимодействия А- и Е-сайтов на 80S рибосомах

Characterization of novel peptide-specific antibodies against the translation elongation factor eEF1A2 and their application for cancer research

Aim. We intend to characterize the new peptide-specific antibodies against the isoform 2 of translation elongation factor 1A (eEF1A2) and determine its presence in the postoperative samples of human breast, lung and stomach tumor tissues. Methods. The analysis of antibody specificity was performed by enzyme-linked immunosorbent assay, immunoblotting and immunohistochemistry. Immunoblotting and immunohistochemistry were used for the determination of the eEF1A2 in the human tumor samples, as well as in the samples of normal tissues surrounding tumors. Results. The antibodies obtained against the eEF1A2 specifically recognized this protein in the cell extracts and histological sections and did not cross-react with the elongation factor 1A isoform 1. eEF1A2 was revealed in the postoperative samples of breast, lung and stomach tumors as well as in the putative normal tissues surrounding tumors. Conclusions. The antibodies obtained against eEF1A2 are highly specific for the antigen and can be used for the immunological studies of tumors.Мета. Охарактеризувати особливості нових пептидоспецифічних антитіл проти другої ізоформи фактора елонгації трансляції 1А (eEF1A2). Визначити присутність цієї ізоформи у післяопераційних зразках пухлин молочної залози, легенів, шлунку людини і порівняти із зразками умовної норми відповідних тканин. Методи. Специфічність антитіл аналізували методами імуноферментного аналізу, імуноблотингу та імуногістохімії. Iмуноблотинг та iмуногiстохімію використано для визначення eEF1A2 в зразках пухлин людини, а також умовної норми. Результати. Встановлено, що отримані антитіла проти eEF1A2 специфічно розпізнають зазначений білок в екстрактах та на гістологічних зрізах і не виявляють перехресної взаємодії з першою ізоформою фактора елонгації. Визначено, що фактор eEF1A2 присутній в післяопераційних зразках пухлин молочної залози, легенів і шлунку, а також в умовно нормальних зразках цих тканин. Висновки. Нами одержано високоспецифічні антитіла проти eEF1A2, які можна використовувати в імунологічних дослідженнях зразків пухлин.Цель. Охарактеризовать особенности новых пептидоспецифических антител против второй изоформы фактора элонгации трансляции 1А (eEF1A2). Определить наличие этой изоформы в послеоперационных образцах опухолей молочной железы, легких, желудка человека и сравнить с условной нормой соответствующих тканей. Методы. Специфичность антител анализировали методами иммуноферментного анализа, иммуноблотинга и иммуногистохимии. Методы иммуноблоттинга и иммуногистохимии использовали для определения eEF1A2 в образцах опухолей человека, а также условной нормы. Результаты. Установлено, что полученные антитела против eEF1A2 специфически распознают этот белок в экстрактах и на гистологических срезах и не выявляют перекрестного взаимодействия с первой изоформой фактора элонгации. Мы определили, что фактор eEF1A2 присутствует в послеоперационных образцах молочной железы, легких и желудка, а также в условно нормальных образцах этих тканей. Выводы. Полученные нами антитела против eEF1A2 являются высокоспецифическими по отношению к антигену и могут быть использованы в иммунологических исследованиях опухолей

Protein isoforms. Origin, structure and functions.

Many proteins in mammalian organism exist as isoforms. These isoforms can be encoded by different genes or produced by alternative splicing of one gene. Despite rapid instrumental progress in the isoform identification, the reasons for their existence and specific functions remain largely unknown. During recent years, attention of researchers was mostly concentrated on spliced isoforms, while the variants of the same protein coded by different genes can play an essential role in different cell processes. This review presents examples of different potential functions of the protein isoforms coded by different genes. Molecular background which could provide a difference between highly homologous protein variants is discussed with an example of isoforms translation elongation factor 1A (eEF1A).Велика кількість білків в організмі ссавців існує у вигляді декількох ізоформ. Ці варіанти кодуються різними гена-ми або є сплайсованими модифікаціями продуктів того ж самого гена. Незважаючи на швидкий інструментальний прогрес у ідентифікації ізоформ, причини їхнього існування та специфічні функції у більшості випадків залишаються достеменно невідомими. Останнім часом увага дослідників здебільшого зосереджена на сплайсованих ізоформах, у той час як різногенні білкові ізоформи можуть відігравати суттєву роль у різних клітинних процесах. У огляді наводяться приклади різних потенційних функцій ізоформ того ж самого білка, які кодуються різними генами. Молекулярне підґрунтя, що може забезпечувати існування такої різниці функцій у високогомологічних білкових ізоформ обговорюється на прикладі останніх досягнень у вивченні ізоформ фактора елонгації трансляції 1A (eEF1A).Многие белки в организме млекопитающих существует в виде нескольких изоформ. Они кодируются разными генами или являются продуктами альтернативного сплайсинга одного и того же гена. Несмотря на быстрый инструментальный прогресс в идентификации изоформ, причины их существования и специфические функции в большинстве случаев остаются точно неизвестными. В последнее время в основном внимание исследователей сосредоточено на сплайсированных изоформах, в то время как разногенные белковые изоформы могут выполнять существенную роль в разных клеточных процессах. В обзоре приводятся примеры разных потенциальных функций изоформ одного и того же белка, кодируемых разными генами. Молекулярные основы существования такой функциональной разницы высокогомологичных белковых изоформ обсуждаются на примере последних достижений в изучении изоформ фактора элонгации трансляции 1A (eEF1A)

The eEF1 family of mammalian translation elongation factors

The eEF1 family of mammalian translation elongation factors is comprised of the two variants of eEF1A (eEF1A1 and eEF1A2), and the eEF1B complex. The latter consists of eEF1Bα, eEF1Bβ, and eEF1Bγ subunits. The two eEF1A variants have similar translation activity but may differ with respect to their secondary, “moonlighting” functions. This variability is underlined by the difference in the spatial organization of eEF1A1 and eEF1A2, and also possibly by the differences in their post-translational modifications. Here, we review the data on the spatial organization and post-translation modifications of eEF1A1 and eEF1A2, and provide examples of their involvement in various processes in addition to translation. We also describe the structural models of eEF1B subunits, their organization in the subcomplexes, and the trimeric model of the entire eEF1B complex. We discuss the functional consequences of such an assembly into a complex as well as the involvement of individual subunits in non-translational processes