Nanosecond Electric Pulses Differentially Affect Inward and Outward Currents in Patch Clamped Adrenal Chromaffin Cells

This study examined the effect of 5 ns electric pulses on macroscopic ionic currents in whole-cell voltage-clamped adrenal chromaffin cells. Current-voltage (I-V) relationships first established that the early peak inward current was primarily composed of a fast voltage-dependent Na+ current (INa), whereas the late outward current was composed of at least three ionic currents: a voltage-gated Ca2+ current (ICa), a Ca2+-activated K+ current (IK(Ca)), and a sustained voltage-dependent delayed rectifier K+ current (IKV). A constant-voltage step protocol was next used to monitor peak inward and late outward currents before and after cell exposure to a 5 ns pulse. A single pulse applied at an electric (E)-field amplitude of 5 MV/m resulted in an instantaneous decrease of ~4% in peak INa that then declined exponentially to a level that was ~85% of the initial level after 10 min. Increasing the E-field amplitude to 8 or 10 MV/m caused a twofold greater inhibitory effect on peak INa. The decrease in INa was not due to a change in either the steady-state inactivation or activation of the Na+ channel but instead was associated with a decrease in maximal Na+ conductance. Late outward current was not affected by a pulse applied at 5 MV/m. However, for a pulse applied at the higher E-field amplitudes of 8 and 10 MV/m, late outward current in some cells underwent a progressive ~22% decline over the course of the first 20 s following pulse exposure, with no further decline. The effect was most likely concentrated on ICa and IK(Ca) as IKV was not affected. The results of this study indicate that in whole-cell patch clamped adrenal chromaffin cells, a 5 ns pulse differentially inhibits specific voltage-gated ionic currents in a manner that can be manipulated by tuning E-field amplitude

2-ns Electrostimulation of Ca\u3csup\u3e2+\u3c/sup\u3e Influx Into Chromaffin Cells: Rapid Modulation by Field Reversal

Cellular effects of nanosecond pulsed electric field exposures can be attenuated by an electric field reversal, a phenomenon called bipolar pulse cancellation. Our investigations of this phenomenon in neuroendocrine adrenal chromaffin cells show that a single 2 ns, 16 MV/m unipolar pulse elicited a rapid, transient rise in intracellular Ca2+ levels due to Ca2+ influx through voltage-gated calcium channels. The response was eliminated by a 2 ns bipolar pulse with positive and negative phases of equal duration and amplitude, and fully restored (unipolar-equivalent response) when the delay between each phase of the bipolar pulse was 30 ns. Longer interphase intervals evoked Ca2+ responses that were greater in magnitude than those evoked by a unipolar pulse (stimulation). Cancellation was also observed when the amplitude of the second (negative) phase of the bipolar pulse was half that of the first (positive) phase but progressively lost as the amplitude of the second phase was incrementally increased above that of the first phase. When the amplitude of the second phase was twice that of the first phase, there was stimulation. By comparing the experimental results for each manipulation of the bipolar pulse waveform with analytical calculations of capacitive membrane charging/discharging, also known as accelerated membrane discharge mechanism, we show that the transition from cancellation to unipolar-equivalent stimulation broadly agrees with this model. Taken as a whole, our results demonstrate that electrostimulation of adrenal chromaffin cells with ultrashort pulses can be modulated with interphase intervals of tens of nanoseconds, a prediction of the accelerated membrane discharge mechanism not previously observed in other bipolar pulse cancellation studies. Such modulation of Ca2+ responses in a neural-type cell is promising for the potential use of nanosecond bipolar pulse technologies for remote electrostimulation applications for neuromodulation

Mechanism of the Inhibition of Ca2+-Activated Cl− Currents by Phosphorylation in Pulmonary Arterial Smooth Muscle Cells

The aim of the present study was to provide a mechanistic insight into how phosphatase activity influences calcium-activated chloride channels in rabbit pulmonary artery myocytes. Calcium-dependent Cl− currents (IClCa) were evoked by pipette solutions containing concentrations between 20 and 1000 nM Ca2+ and the calcium and voltage dependence was determined. Under control conditions with pipette solutions containing ATP and 500 nM Ca2+, IClCa was evoked immediately upon membrane rupture but then exhibited marked rundown to ∼20% of initial values. In contrast, when phosphorylation was prohibited by using pipette solutions containing adenosine 5′-(β,γ-imido)-triphosphate (AMP-PNP) or with ATP omitted, the rundown was severely impaired, and after 20 min dialysis, IClCa was ∼100% of initial levels. IClCa recorded with AMP-PNP–containing pipette solutions were significantly larger than control currents and had faster kinetics at positive potentials and slower deactivation kinetics at negative potentials. The marked increase in IClCa was due to a negative shift in the voltage dependence of activation and not due to an increase in the apparent binding affinity for Ca2+. Mathematical simulations were carried out based on gating schemes involving voltage-independent binding of three Ca2+, each binding step resulting in channel opening at fixed calcium but progressively greater “on” rates, and voltage-dependent closing steps (“off” rates). Our model reproduced well the Ca2+ and voltage dependence of IClCa as well as its kinetic properties. The impact of global phosphorylation could be well mimicked by alterations in the magnitude, voltage dependence, and state of the gating variable of the channel closure rates. These data reveal that the phosphorylation status of the Ca2+-activated Cl− channel complex influences current generation dramatically through one or more critical voltage-dependent steps

Differential Interactions of Na+ Channel Toxins with T-type Ca2+ Channels

Two types of voltage-dependent Ca2+ channels have been identified in heart: high (ICaL) and low (ICaT) voltage-activated Ca2+ channels. In guinea pig ventricular myocytes, low voltage–activated inward current consists of ICaT and a tetrodotoxin (TTX)-sensitive ICa component (ICa(TTX)). In this study, we reexamined the nature of low-threshold ICa in dog atrium, as well as whether it is affected by Na+ channel toxins. Ca2+ currents were recorded using the whole-cell patch clamp technique. In the absence of external Na+, a transient inward current activated near −50 mV, peaked at −30 mV, and reversed around +40 mV (HP = −90 mV). It was unaffected by 30 μM TTX or micromolar concentrations of external Na+, but was inhibited by 50 μM Ni2+ (by ∼90%) or 5 μM mibefradil (by ∼50%), consistent with the reported properties of ICaT. Addition of 30 μM TTX in the presence of Ni2+ increased the current approximately fourfold (41% of control), and shifted the dose–response curve of Ni2+ block to the right (IC50 from 7.6 to 30 μM). Saxitoxin (STX) at 1 μM abolished the current left in 50 μM Ni2+. In the absence of Ni2+, STX potently blocked ICaT (EC50 = 185 nM) and modestly reduced ICaL (EC50 = 1.6 μM). While TTX produced no direct effect on ICaT elicited by expression of hCaV3.1 and hCaV3.2 in HEK-293 cells, it significantly attenuated the block of this current by Ni2+ (IC50 increased to 550 μM Ni2+ for CaV3.1 and 15 μM Ni2+ for CaV3.2); in contrast, 30 μM TTX directly inhibited hCaV3.3-induced ICaT and the addition of 750 μM Ni2+ to the TTX-containing medium led to greater block of the current that was not significantly different than that produced by Ni2+ alone. 1 μM STX directly inhibited CaV3.1-, CaV3.2-, and CaV3.3-mediated ICaT but did not enhance the ability of Ni2+ to block these currents. These findings provide important new implications for our understanding of structure–function relationships of ICaT in heart, and further extend the hypothesis of a parallel evolution of Na+ and Ca2+ channels from an ancestor with common structural motifs

Profiling cytotoxic microRNAs in pediatric and adult glioblastoma cells by high-content screening, identification, and validation of miR-1300

MicroRNAs play an important role in the regulation of mRNA translation and have therapeutic potential in cancer and other diseases. To profile the landscape of microRNAs with significant cytotoxicity in the context of glioblastoma (GBM), we performed a high-throughput screen in adult and pediatric GBM cells using a synthetic oligonucleotide library representing all known human microRNAs. Bioinformatics analysis was used to refine this list and the top seven microRNAs were validated in a larger panel of GBM cells using state-of-the-art in vitro assays. The cytotoxic effect of our most relevant candidate was assessed in a preclinical model. Our screen identified ~100 significantly cytotoxic microRNAs with 70% concordance between cell lines. MicroRNA-1300 (miR-1300) was the most potent and robust candidate. We observed a striking binucleated phenotype in miR-1300 transfected cells due to cytokinesis failure followed by apoptosis. This was also observed in two stem-like patient-derived cultures. We identified the physiological role of miR-1300 as a regulator of endomitosis in megakaryocyte differentiation where blockade of cytokinesis is an essential step. In GBM cells, where miR-1300 is normally not expressed, the oncogene Epithelial Cell Transforming 2 (ECT2) was validated as a direct key target. ECT2 siRNA phenocopied the effects of miR-1300, and ECT2 overexpression led to rescue of miR-1300 induced binucleation. We showed that ectopic expression of miR-1300 led to decreased tumor growth in an orthotopic GBM model. Our screen provides a resource for the neuro-oncology community and identified miR-1300 as a novel regulator of endomitosis with translatable potential for therapeutic application

Hypoxie et accélération du processus de repolarisation ventriculaire: mise en évidence des courants ioniques impliqués par une étude sur le potentiel d'action propagé

L'objectif principal de la présente étude était de déterminer la nature des courants ioniques impliqués dans le raccourcissement du potentiel d'action ventriculaire propagé induit par l'hypoxie. Deux types de préparations ont été utilisés, soit le coeur isolé perfusé de lapin et le muscle papillaire de la même espèce, chaque modèle expérimental ayant ses propres objectifs. L'approche expérimentale a consisté en l'utilisation de techniques électrophysiologiques classiques couplées à l'emploi d'agents pharmacologiques et de variations des concentrations ioniques de la solution de perfusion. Sur le coeur isolé entraîné à se contracter à une fréquence de 2.5 Hz (33 °C) et perfusé avec une solution Krebs normale (Ko = 5 mM), l'hypoxie cause une diminution rapide de la durée du potentiel d'action (PA) qui atteint un régime établi entre 15 et 20 minutes, état qui se maintient durant 60 minutes. Les autres paramètres du PA sont beaucoup moins affectés par l'hypoxie: 1. pas de changements du potentiel de repos; 2. des diminutions de l'amplitude, de la phase lente de dépolarisation, de l'overshoot; 3. l'amplitude de la phase rapide et sa Vmax ne sont que très légèrement déprimées après 60 minutes. Une variation de la concentration externe en potassium (Ko; 1.5 à 10 mM) après 40 minutes en hypoxie initie d'abord un changement rapide de la durée, puis une diminution lente en fonction du temps. Le degré des changements induits varie selon Ko et aussi selon le niveau de repolarisation. Pour la durée totale, une réponse en "U" est notée entre 1.5 et 10 mM-Ko, l'hypoxie ayant un effet maximal à 5 mM-Ko. A courant durant le plateau induisent encore les effets caractéristiques attribués au courant lent suggérant qu'il serait peu inhibé par l'inhibition métabolique. Une courbe typique en forme de cloche de la durée du PA en fonction de la fréquence de stimulations (0.1 à 4 Hz) est observée en milieu normal et oxygène. Cette courbe s'affaisse lentement en fonction du temps en hypoxie. Un comportement similaire est observée en présence de 4-AP. Lorsque reportée en pourcentage de la courbe obtenue en normoxie, les effets sont plus importants à basse qu'à haute fréquence, comportement à l'inverse de ce qui serait attendu pour une cinétique de réactivation plus lente du courant lent en hypoxie à haute fréquence. De plus, les résultats suggèrent que même si le courant est inhibé, cette inhibition est masquée de façon importante par l'augmentation d'un courant sortant de fond repolarisant. Toutes les conditions pouvant moduler les niveaux internes des ions Na+ et Ca2+ en condition d'hypoxie favorisent dans une sens ou dans l'autre une accélération ou un ralentissement du processus de repolarisation ventriculaire. L'addition de tétrodotoxine, un bloqueur spécifique des canaux sodiques, après une période d'incubation en hypoxie et milieu normal, initie une augmentation lente et progressive de la durée. Le verapamil prévient le raccourcissement du PA en hypoxie. Une élévation du Ko externe en hypoxie, condition limitant l'entrée de Na+ par inactivation partielle des canaux sodiques, et par une diminution de la force motrice pour ces ions, a également pour effet d'allonger le potentiel d'action. Un abaissement de la fréquence des stimulations produit le même effet. Contrairement au coeur isolé qui était stimulé à 2.5 Hz, la préparation du muscle papillaire était pour sa part entraînée à une l'inverse, dans la région du plateau, un abaissement de la tension d'oxygène a graduellement moins d'effets de 1.5 à 10 mM-Ko. Le verapamil, un bloqueur du courant entrant lent calcique, abolit la phase lente de dépolarisation et démasque une contribution graduellement plus importante de ce courant au processus de repolarisation lorsque la membrane est dépolarisée par le potassium. À toutes les Ko étudiées (2.5 à 10 mM), cette substance prévient en grande partie le raccourcissement du potentiel d'action causé par l'hypoxie. Tous les bloqueurs des canaux potassiques employés (chlorure de césium, chlorure de barium, chlorure de tétraéthylammonium, 4-aminopyridine) ont tous retardé ou ralenti à des degrés divers les effets de l'hypoxie sur la repolarisation, en particulier sur la phase terminale. Une déplétion des catécholamines endogènes par un traitement chronique des lapins à la réserpine retarde considérablement les effets de l'hypoxie sur la durée, l'amplitude totale et l'overshoot du potentiel d'action en haut Ko (7.5 mM). Les expériences en double-microélectrodes ainsi que les variations de la fréquence de stimulations réalisées sur la préparation du muscle papillaire et sur la trabécule suggèrent que le courant lent serait peu inhibé, du moins qualitativement, après 60 minutes d'hypoxie. Des impulsions de courant constant dépolarisantes ou hyperpolarisantes allongent et raccourcissent respectivement le PA après leur relaxation en normoxie, comportement caractéristique d'une contribution de la cinétique du courant lent à la repolarisation. Cet effet est également observé en présence de la 4-aminopyridine (4-AP; 2 mM) et est inhibé en présence de chlorure de cobalt (1-3 mM), un bloqueur du courant lent. En hypoxie et milieu normal ou 4-AP, des déplacement de potentiel par injections de fréquence de 1 Hz. Le processus de repolarisation était moins sensible à l'hypoxie sur cette préparation, indiquant que la limitation de l'entrée des ions Na+ et/ou Ca2+ par unité de temps retarde les effets délétères de l'hypoxie sur la durée. Au contraire, un abaissement de la concentration externe en sodium, condition favorisant une accumulation en Ca2+ intracellulaire (effet inotrope positif), amplifie la cinétique d'accélération de la repolarisation en hypoxie. La sensibilité du processus de repolarisation en hypoxie face à un changement du gradient transmembranaire des ions K+, ainsi que l'action des différents bloqueurs des conductances potassiques dans ces conditions suggèrent qu'un courant de fond potassique s'active en hypoxie et est responsable en majeure partie de l'accélération de la repolarisation observée en hypoxie. Par le fait que la durée mesurée en phase terminale n'est pas altérée par l'hypoxie en présence d'une combinaison des bloqueurs Ba2+ (0.2 mM) et Cs+ (4 mM), et ce pour trois Ko étudiées (2.5, 5 et 7.5 mM), il est proposé que la conductance activée rectifie dans le sens entrant et serait de type IK1. En conclusion, la présente étude réaffirme le rôle prépondérent que jouent les ions K+, les catécholamines et les facteurs responsables du maintien de la teneur cytoplasmique des ions Na+ et Ca2+ dans la détermination de la réponse électrophysiologique du myocarde face à une baisse de la tension d'oxygène dans le milieu, situation imitant en partie plusieurs situations pathophysiologiques dont l'ischémie cardiaque

Le potentiel de repos et l'électrogénèse cardiaque en relation avec l'hypoxie et la concentration externe en potassium

L'objectif du présent projet était double : tout d'abord étudier les effets de l'hypoxie sur la réponse régénérative initiée en présence de concentrations diverses en potassium; en second lieu, vérifier s'il y avait persistance d'une fraction électrogène au potentiel de repos et s'il y avait lieu, quelle en était sa dépendance en fonction de la concentration potassique externe. Ces deux sous-projets étaient étudiés en relation avec les mesures de distribution transmembranaire du Na et du K. Les expériences ont été réalisées sur le cœur isolé de lapin perfusé avec une solution de Krebs-Henseleit selon la technique de Langendorff à 33°C. Les concentrations intracellulaires en Na et K ont été estimées à partir de contenus tissulaires en eau, Na et K ainsi que le volume de l'espace extracellulaire. Le potentiel transmembranaire était enregistré à l'aide de microélectrodes flottantes classiques en verre remplies avec du KCl 3M. Nous avons étudié les effets de 60 minutes d'hypoxie, soit une hypoxie de durée moyenne. La période d'hypoxie était divisée entre une première période de 40 minutes en milieu normal (Ko = 5mM) suivie d'une période de 20 minutes où la concentration externe en K était variée, concentration identique à celle utilisée dans la partie témoin précédant l'hypoxie. À la fin de la période de 60 minutes en hypoxie, les muscles étaient d'une part retirés du montage pour analyse de leurs contenus en Na et K, ou d'autre part exposés à une période supplémentaire de 30 minutes en hypoxie en présence de ouabaïne 10-4 M à la même concentration potassique externe que la période test la précédant. Cette période supplémentaire en hypoxie servait pour la détermination de la fraction électrogène du potentiel de repos en hypoxie. En condition d'oxygénation normale, une augmentation du Na intracellulaire fut observée pour Ko = 1.5mM alors qu'aucun changement était noté pour le K intracellulaire(Ki) à toutes les Ko étudiées. L'hypoxie a causé des gains nets en Na à toutes les_Ko. Ces gains nets étaient accompagnés de pertes potassiques nettes qui étaient restreintes à mesure que Ko était élevée. Ces résultats suggèrent que les gains en Na étaient médiés par une dépression de l'activité de la pompe Na:K alors que les pertes en K reflétaient un effet mixte : dépression de l'activité de la pompe Na:K et augmentation de la perméabilité potassique. L'hypoxie n'a causé aucune dépolarisation de la membrane à toutes les Ko. Une hyperpolarisation significative était même observée pour Ko = 7.5mM. À toutes les Ko, des diminutions de l'amplitude totale et de l'overshoot étaient observées en hypoxie, diminutions qui étaient moins importantes pour des Ko élevées. L'hypoxie a causé une dépression significative de l'amplitude de la phase rapide de montée pour Ko ? 5mM. Une diminution de la vitesse maximale de dépolarisation Vmax était observée seulement pour Ko = 10mM. Il a été démontré que la diminution de la Vmax en haut Ko et hypoxie était reflétée par un déplacement du bas de la courbe d'inactivation du système sodique en régime établi (H?) vers des valeurs de potentiel plus négatives. Bien qu'on ait pas les éléments pour déterminer si l'effet dépresseur de l'hypoxie sur le système sodique est un mécanisme inhibiteur direct du K sur la conductance sodique ou une dépendance du voltage modifiée par l'hypoxie, il est exclu que l'accumulation intracellulaire en Na et autres ions tels le calcium ainsi que l'acidose métabolique soient la cause du déplacement du bas de la courbe H?. Il est proposé que le Na intracellulaire est compartimentalisé, le compartiment des canaux ioniques serait dissocié du compartiment de transport (pompe Na:K). Dans une série d'expériences particulières, nous avons employé la TTX pour inhiber partiellement la phase rapide de montée pour permettre une mesure adéquate de la vitesse maximale de dépolarisation de la phase lente (VmaxII) en conditions d'oxygénation et d'hypoxie (60 minutes) pour quatre Ko. La raison était d'établir si l'effet inhibiteur de l'hypoxie sur la phase lente en bas Ko, et l'insensibilité relative en haut Ko se traduisaient par des changements du courant entrant membranaire net, assumé comme étant en grande partie composé du courant entrant Isi. En normoxie, VmaxII n'a pas varié significativement selon Ko. L'hypoxie a causé une légère diminution significative de ce paramètre pour Ko? 5 mM alors qu'une augmentation significative fut observée pour 7.5 et 10 mM-Ko. Deux mécanismes sont proposés pour justifier la diminution de la phase lente en bas Ko : 1. la cinétique et l'amplitude de la phase rapide ou du courant sodique rapide INa diminuerait la manifestation de la phase lente du fait que Isi ne serait pas activé au complet : 2. le degré de développement de la phase initiale, en particulier son décours temporel, conditionnerait le degré de sensibilité de la phase lente à l'hypoxie. Des expériences en présence d'un ?-bloqueur, le propranolol, ont pu déterminer que l'augmentation de VmaxII en hypoxie et haut Ko était causée par une libération endogène de catécholamines. Il est postulé qu'une libération endogène de catécholamines peut contribuer significativement à maintenir l'activité électrique dans des conditions telles l'ischémie. Une étude électrophysiologique du tissu auriculaire en milieu normal (Ko= 5 mM) a révélé la présence de deux types de potentiel d'action, l'un caractérisé par une phase de montée rapide à Vmax à peu près équivalente au ventricule (138 ± 2 Vs-1) suivie d'une petite composante lente; l'autre caractérisé par une phase de montée unique extrêmement rapide (180 ± 7 Vs-1) suivie d'une petite repolarisation rapide ressemblant aux cellules de Purkinje. Le premier type serait différencié pour la contraction alors que le second serait plutôt la manifestation de fibres spécialisées pour la propagation de l'excitation. Pour les deux types de morphologie, l'hypoxie (60 minutes) n'a causé aucune dépolarisation membranaire et n'a pas affecté l'amplitude de la phase rapide et sa Vmax. La diminution de l'amplitude totale dans le cas du premier type est expliquée en terme d'inhibition de la phase lente. La diminution beaucoup moins importante à l'oreillette de la durée du potentiel d'action en hypoxie par rapport au ventricule suggère que le tissu auriculaire s'adapte mieux à l'hypoxie que le muscle ventriculaire. Dans les expériences où nous avons employé la ouabaïne 10-4M pour inhiber complètement et rapidement la pompe Na:K de façon à dévoiler la composante de diffusion ou de Goldman VG du potentiel de repos, l'hypoxie (60 minutes) a causé une augmentation de VG pour toutes les Ko, augmentation qui fut plus importante pour de basses Ko. Il est postulé que l'augmentation importante de VG est causée par une augmentation sélective de la perméabilité potassique. Il fut démontré qu'en hypoxie, une fraction électrogène persiste pour Ko ? 5mM. Il est proposé que dans des conditions telles l'ischémie où une augmentation de Ko prévaut, l'augmentation de VG et la persistance d'une composante électrogène peuvent contribuer significativement à maintenir le potentiel de repos ainsi que l'activité électrique dans ces conditions. La persistance d'un potentiel de pompe peut avoir des implications substantielles quant à la génération des arythmies cardiaques dans de telles conditions

Validation of a human cell model to investigate the role of Ca2+-activated Cl- channels encoded by Anoctamin-1 in human pulmonary arterial smooth muscle cells

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a rare chronic disease in humans. While new genetic markers have been identified and new therapeutic agents developed within the last two decades, survival rate and quality of care have only seen incremental improvement. For this fact, investigation into the mechanisms behind pulmonary arterial hypertension (PAH) is merited. Animal models of pulmonary hypertension demonstrate increased activity and expression of Ca2+ -activated Cl- channels (CaCC) encoded by Anocatmin-1 (ANO1). It is known that CaCCs activity and ANO1 expression are in increased in animal models of PAH, which is thought to promote smooth muscle cell depolarization, enhanced Ca2+ entry and tone (Leblanc et al., 2015). The goal of this study is to create a human cell model of pulmonary arterial smooth muscle cells (hPASMCs) to later investigate the role of CaCCs in PAH. This study measured intracellular Ca2+ concentration in hPASMCs with the calcium indicator Fluo-4/AM. The Fluo-4 fluorescence (F/F0) was recorded using a Photo Detection System and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy whereby the constricting agonists Phenylephrine and Serotonin, and the TRPV4 agonist GSK 1016790A, were perfused on hPASMCs. Phenylephrine and Serotonin did not consistently elicit Ca2+ responses in hPASMCs, however, the TRPV4 agonist GSK exhibited a more consistent effect on Fluo-4 fluorescence in hPASMCs. In order to gather more conclusive results, the number of experiments using GSK should be increased substantially and more cell lines need to be made available including samples of hPASMCs from patients of all ages and sexes, and PAH patients. Once these additional resources and results are met, this will allow for a more comprehensive validation of hPASMCs as a model to investigate the role of CaCCs and ANO1 in PAH