Contribution de l'albumen au développement de la graine chez Medicago truncatula : caractérisation d'un facteur de transcription de type DOF exprimé dans l'albumen chalazal

In the current context, which necessitates a reduction in inputs in crop systems and boosting of production of plant proteins to reduce France’s dependency on feed imports,, growing legumes represents an alternative. Grain legumes are major sources of proteins for animal and human nutrition. In the UMR1347 Agroécologie, the objectives of the study group "déterminismes Génétiques et Environnementaux de l’Adaptation des Plantes à des Systèmes de culture Innovants" (GEAPSI) are to promote legume cultivation and adaptation to environmental stresses, via multidisciplinary approaches (genetics, ecophysiology, molecular physiology). This thesis project was carried out in the "Étude des Mécanismes Moléculaires" team, particularly interested in seed quality traits such as protein content or seed size and identification of genes implicated in variations of these trait s. Experiments were performed using Medicago truncatula as a model species for legumes with a view to transferring the information to the target crop species Pisum sativum.Legume seed size is determined by the embryo’s capacity to divide during embryogenesis and to accumulate reserves during seed filling. At early developmental stages, nutrient assimilation occurs predominantly in embryo-surrounding tissues: the endosperm and seed coat. This thesis project aims to evaluate the endosperm contribution to seed development in M. truncatula. We have shown several DOF (DNA-binding One Zinc Finger) genes to be expressed in this tissue. They belong to a large family of transcription factors implicated in numerous biological processes, but whose role remain to be elucidated. One of these genes, termed DASH for Dof Affecting Seed embryogenesis and Hormone metabolism, is expressed preferentially in the endosperm during embryogenesis. TILLING and TnT1 mutants isolated for this transcription factor are affected in seed development (abortion at 10 DAP). The cytology of development at early stages (6 to 10 DAP) revealed that the expression of this gene in the endosperm is required for the normal development of the embryo, demonstrating the role of the endosperm in the control of embryogenesis in legumes. A comparative transcriptomics study of dash vs wild-type pods allowed us to suggest hypothesis about the function of the DASH gene. Evidence for a deregulation of hormone metabolism, in particular for auxin, was obtained, and several potential target genes of this transcription factor were selected. A comparison of the transcriptome of the three tissues of the seed at 12 DAP was carried out for the reference wild-type line (Jemalong A17). This allowed the tissue localization of the target genes, to reveal metabolic pathways preferentially expressed in the endosperm, and to propose hypotheses about the role of this tissue during seed development.Dans un contexte actuel qui tend vers une réduction d’intrants dans les systèmes de culture et une relance de la production de protéines végétales pour réduire la dépendance alimentaire de la France, la culture des légumineuses constitue une alternative. Les légumineuses à graines offrent une source riche en protéines pour l’alimentation animale et humaine. Au sein de l'UMR1347 Agroécologie, le pôle "déterminismes Génétiques et Environnementaux de l’Adaptation des Plantes à des Systèmes de culture Innovants" (GEAPSI) étudie via une approche multidisciplinaire (génétique, écophysiologie, physiologie moléculaire) l’adaptation des espèces végétales, et notamment des légumineuses aux contraintes environnementales. Ces travaux de thèse ont été réalisés au sein de l'équipe "Étude des Mécanismes Moléculaires" qui s'intéresse plus particulièrement à des critères de qualité de la graine (teneur en protéine, taille de graine) et au déterminisme génétique de ces caractères chez la plante modèle Medicago truncatula en vue d'un transfert de connaissances vers l'espèce cible Pisum sativum. Chez les légumineuses, la taille de la graine est déterminée par la capacité de l’embryon à se diviser lors de l’embryogenèse et à accumuler des réserves lors du remplissage. Aux stades précoces du développement, l’assimilation de nutriments est réalisée majoritairement par les tissus qui entourent l’embryon: l’albumen et le tégument. Les recherches menées visent à évaluer la contribution de l’albumen dans le développement de la graine chez M. truncatula. Nous avons révélé plusieurs gènes DOF (DNA-binding with One zinc Finger) comme étant exprimé dans ce tissu. Ils appartiennent à une large famille de facteurs de transcription impliqués dans de nombreux processus biologiques mais dont les rôles restent à préciser. Un de ces gènes, nommé DASH pour Dof Affecting Seed embryogenesis and Hormone metabolism, est exprimé préférentiellement dans l’albumen lors de l’embryogenèse. Des mutants TILLING et Tnt-1 isolés pour ce facteur de transcription sont affectés dans le développement de la graine (avortement à environ 10 jap). La cytologie du développement aux stades précoces (6 à 10 jap) a révélé que l’expression de ce gène dans l’albumen est requise pour un développement normal de l’embryon, démontrant le rôle de l’albumen dans le contrôle de l’embryogenèse chez les légumineuses. Une étude comparative du transcriptome des gousses de dash vs sauvage a permis d’émettre des hypothèses quant à la fonction du gène DASH. Une dérégulation du métabolisme hormonal, en particulier de l’auxine, a été mise en évidence et plusieurs gènes cibles potentiels de ce facteur de transcription ont été sélectionnés. Une comparaison du transcriptome des trois tissus de la graine à 12 jap a été réalisée chez la lignée sauvage de référence (Jemalong, A17). Elle a permis de préciser la localisation tissulaire de ces gènes cibles putatifs, de mettre en évidence des voies métaboliques plus spécifiques de l’albumen et de proposer des hypothèses quant à la fonction de ce tissu dans le développement de la graine

The nitrate transporter family protein LjNPF8.6 controls the N-fixing nodule activity

N-fixing nodules are new organs formed on legume roots as a result of the beneficial interaction with soil bacteria, rhizobia. The nodule functioning is still a poorly characterized step of the symbiotic interaction, as only a few of the genes induced in N-fixing nodules have been functionally characterized. We present here the characterization of a member of the Lotus japonicus nitrate transporter1/peptide transporter family, LjNPF8.6. The phenotypic characterization carried out in independent L. japonicus LORE1 insertion lines indicates a positive role of LjNPF8.6 on nodule functioning, as knockout mutants display N-fixation deficiency (25%) and increased nodular superoxide content. The partially compromised nodule functioning induces two striking phenotypes: anthocyanin accumulation already displayed 4 weeks after inoculation and shoot biomass deficiency, which is detected by long-term phenotyping. LjNPF8.6 achieves nitrate uptake in Xenopus laevis oocytes at both 0.5 and 30 mm external concentrations, and a possible role as a nitrate transporter in the control of N-fixing nodule activity is discussed

Un facteur de transcription impliqué dans le développement de la graine chez <em>Medicago truncatula</em>

National audienc

Endosperm cintribution to Medicago truncatula seed development : characterization of a DOF transcription factor expressed in chalazal endosperm

Dans un contexte actuel qui tend vers une réduction d’intrants dans les systèmes de culture et une relance de la production de protéines végétales pour réduire la dépendance alimentaire de la France, la culture des légumineuses constitue une alternative. Les légumineuses à graines offrent une source riche en protéines pour l’alimentation animale et humaine. Au sein de l'UMR1347 Agroécologie, le pôle "déterminismes Génétiques et Environnementaux de l’Adaptation des Plantes à des Systèmes de culture Innovants" (GEAPSI) étudie via une approche multidisciplinaire (génétique, écophysiologie, physiologie moléculaire) l’adaptation des espèces végétales, et notamment des légumineuses aux contraintes environnementales. Ces travaux de thèse ont été réalisés au sein de l'équipe "Étude des Mécanismes Moléculaires" qui s'intéresse plus particulièrement à des critères de qualité de la graine (teneur en protéine, taille de graine) et au déterminisme génétique de ces caractères chez la plante modèle Medicago truncatula en vue d'un transfert de connaissances vers l'espèce cible Pisum sativum. Chez les légumineuses, la taille de la graine est déterminée par la capacité de l’embryon à se diviser lors de l’embryogenèse et à accumuler des réserves lors du remplissage. Aux stades précoces du développement, l’assimilation de nutriments est réalisée majoritairement par les tissus qui entourent l’embryon: l’albumen et le tégument. Les recherches menées visent à évaluer la contribution de l’albumen dans le développement de la graine chez M. truncatula. Nous avons révélé plusieurs gènes DOF (DNA-binding with One zinc Finger) comme étant exprimé dans ce tissu. Ils appartiennent à une large famille de facteurs de transcription impliqués dans de nombreux processus biologiques mais dont les rôles restent à préciser. Un de ces gènes, nommé DASH pour Dof Affecting Seed embryogenesis and Hormone metabolism, est exprimé préférentiellement dans l’albumen lors de l’embryogenèse. Des mutants TILLING et Tnt-1 isolés pour ce facteur de transcription sont affectés dans le développement de la graine (avortement à environ 10 jap). La cytologie du développement aux stades précoces (6 à 10 jap) a révélé que l’expression de ce gène dans l’albumen est requise pour un développement normal de l’embryon, démontrant le rôle de l’albumen dans le contrôle de l’embryogenèse chez les légumineuses. Une étude comparative du transcriptome des gousses de dash vs sauvage a permis d’émettre des hypothèses quant à la fonction du gène DASH. Une dérégulation du métabolisme hormonal, en particulier de l’auxine, a été mise en évidence et plusieurs gènes cibles potentiels de ce facteur de transcription ont été sélectionnés. Une comparaison du transcriptome des trois tissus de la graine à 12 jap a été réalisée chez la lignée sauvage de référence (Jemalong, A17). Elle a permis de préciser la localisation tissulaire de ces gènes cibles putatifs, de mettre en évidence des voies métaboliques plus spécifiques de l’albumen et de proposer des hypothèses quant à la fonction de ce tissu dans le développement de la graine.In the current context, which necessitates a reduction in inputs in crop systems and boosting of production of plant proteins to reduce France’s dependency on feed imports,, growing legumes represents an alternative. Grain legumes are major sources of proteins for animal and human nutrition. In the UMR1347 Agroécologie, the objectives of the study group "déterminismes Génétiques et Environnementaux de l’Adaptation des Plantes à des Systèmes de culture Innovants" (GEAPSI) are to promote legume cultivation and adaptation to environmental stresses, via multidisciplinary approaches (genetics, ecophysiology, molecular physiology). This thesis project was carried out in the "Étude des Mécanismes Moléculaires" team, particularly interested in seed quality traits such as protein content or seed size and identification of genes implicated in variations of these trait s. Experiments were performed using Medicago truncatula as a model species for legumes with a view to transferring the information to the target crop species Pisum sativum.Legume seed size is determined by the embryo’s capacity to divide during embryogenesis and to accumulate reserves during seed filling. At early developmental stages, nutrient assimilation occurs predominantly in embryo-surrounding tissues: the endosperm and seed coat. This thesis project aims to evaluate the endosperm contribution to seed development in M. truncatula. We have shown several DOF (DNA-binding One Zinc Finger) genes to be expressed in this tissue. They belong to a large family of transcription factors implicated in numerous biological processes, but whose role remain to be elucidated. One of these genes, termed DASH for Dof Affecting Seed embryogenesis and Hormone metabolism, is expressed preferentially in the endosperm during embryogenesis. TILLING and TnT1 mutants isolated for this transcription factor are affected in seed development (abortion at 10 DAP). The cytology of development at early stages (6 to 10 DAP) revealed that the expression of this gene in the endosperm is required for the normal development of the embryo, demonstrating the role of the endosperm in the control of embryogenesis in legumes. A comparative transcriptomics study of dash vs wild-type pods allowed us to suggest hypothesis about the function of the DASH gene. Evidence for a deregulation of hormone metabolism, in particular for auxin, was obtained, and several potential target genes of this transcription factor were selected. A comparison of the transcriptome of the three tissues of the seed at 12 DAP was carried out for the reference wild-type line (Jemalong A17). This allowed the tissue localization of the target genes, to reveal metabolic pathways preferentially expressed in the endosperm, and to propose hypotheses about the role of this tissue during seed development

Revisiting the functional properties of NPF6.3/NRT1.1/CHL1 in xenopus oocytes

preprint déposé dans bioRxivWithin the Arabidopsis NPF proteins, most of the characterized nitrate transporters are low-affinity transporters, whereas the functional characterization of NPF6.3/NRT1.1 has revealed interesting transport properties: the transport of nitrate and auxin, the eletrogenicity of the nitrate transport and a dual-affinity transport behavior for nitrate depending on external nitrate concentration. However, some of these properties remained controversial and were challenged here. We functionally express WT NPF6.3/NRT1.1 and some of its mutant in Xenopus oocytes and used a combination of uptake experiments using 15N-labelled nitrate and two-electrode voltage-clamp. In our experimental conditions in xenopus oocytes, in the presence or in the absence of external chloride, NPF6.3/NRT1.1 behaves as a non- electrogenic and pure low-affinity transporter. Moreover, further functional characterization of a NPF6.3/NRT1.1 point mutant, P492L, allowed us to hypothesize that NPF6.3/NRT1.1 is regulated by internal nitrate concentration and that the internal perception site involves the P492 residue

Functional Characterization of the Arabidopsis Abscisic Acid Transporters NPF4.5 and NPF4.6 in Xenopus Oocytes

Dynamic reprogramming of gene regulatory networks (GRNs) enables organisms to rapidlyrespond to environmental perturbation. However, the underlying transient interactionsbetween transcription factors (TFs) and genome-wide targets typically elude biochemicaldetection. Here, we capture both stable and transient TF-target interactions genome-widewithin minutes after controlled TF nuclear import using time-series chromatin immunoprecipitation(ChIP-seq) and/or DNA adenine methyltransferase identification (DamID-seq).The transient TF-target interactions captured uncover the early mode-of-action of NIN-LIKEPROTEIN 7 (NLP7), a master regulator of the nitrogen signaling pathway in plants. Thesetransient NLP7 targets captured in root cells using temporal TF perturbation account for 50%of NLP7-regulated genes not detectably bound by NLP7 in planta. Rapid and transient NLP7binding activates early nitrogen response TFs, which we validate to amplify the NLP7-initiatedtranscriptional cascade. Our approaches to capture transient TF-target interactions genomewidecan be applied to validate dynamic GRN models for any pathway or organism of interest

Un facteur de transcription de type DOF impliqué dans le développement de la graine chez les Légumineuses

National audienceDans un contexte actuel qui tend vers une réduction d’intrants dans les systèmes de culture et une relance de la production de protéines végétales, la culture des légumineuses constitue une alternative fondamentale à prendre en compte car elles constituent une source riche en protéines pour l’alimentation animale et humaine. Il est donc important de s’intéresser aux facteurs limitants leur culture, comme la tolérance aux stress ou le rendement, en étudiant le déterminisme génétique de ces caractères. Le rendement protéique de la graine dépend à la fois du génotype et des facteurs environnementaux qui interviennent pendant l’étape clé du remplissage. Aux stades précoces du développement, l’assimilation de nutriments est réalisée majoritairement par les tissus qui entourent l’embryon: l’albumen et le tégument. Les recherches menées visent à évaluer la contribution de l’albumen dans le développement et le remplissage de la graine chez les légumineuses. L’étude du rôle de ce tissu qui entoure l’embryon est réalisé grâce à des mutants (TILLING et TnT) pour un facteur de transcription de type DOF. Ce facteur de transcription est exprimé à un moment clé dans le développement de la graine, à la transition entre les phases de division cellulaire et de remplissage de la graine. Il est spécifique de l’albumen, tissu qui entoure et supporte le développement de l’embryon pendant la phase critique du remplissage. Ces mutants présentent des phénotypes qui affectent le développement de la graine (avortement à des stades précoces). La cytologie du développement de la graine a été étudiée dans une première partie afin de caractériser l’impact de la mutation sur le développement. Dans un second temps, une étude comparative du transcriptome mutant vs sauvage a permis de sélectionner plusieurs gènes de part leur expression différentielle mutant vs sauvage. Une fois replacés dans les voies métaboliques, ils sont une indication importante pour émettre des hypothèses quant à la fonction du gène

Disruption of the Lotus japonicus transporter LjNPF2.9 increases shoot biomass and nitrate content without affecting symbiotic performances

BACKGROUND: After uptake from soil into the root tissue, distribution and allocation of nitrate throughout the whole plant body, is a critical step of nitrogen use efficiency (NUE) and for modulation of plant growth in response to various environmental conditions. In legume plants nitrate distribution is also important for the regulation of the nodulation process that allows to fix atmospheric N (N2) through the symbiotic interaction with rhizobia (symbiotic nitrogen fixation, SNF).[br/] RESULTS: Here we report the functional characterization of the Lotus japonicus gene LjNPF2.9, which is expressed mainly in the root vascular structures, a key localization for the control of nitrate allocation throughout the plant body. LjNPF2.9 expression in Xenopus laevis oocytes induces 15NO3 accumulation indicating that it functions as a nitrate importer. The phenotypic characterization of three independent knock out mutants indicates an increased shoot biomass in the mutant backgrounds. This phenotype is associated to an increased/decreased nitrate content detected in the shoots/roots. Furthermore, our analysis indicates that the accumulation of nitrate in the shoot does not affect the nodulation and N-Fixation capacities of the knock out mutants.[br/] CONCLUSIONS:[br/] This study shows that LjNPF2.9 plays a crucial role in the downward transport of nitrate to roots, occurring likely through a xylem-to-phloem loading-mediated activity. The increase of the shoot biomass and nitrate accumulation might represent a relevant phenotype in the perspective of an improved NUE and this is further reinforced in legume plants by the reported lack of effects on the SNF efficiency